Name: retrograde neuroanatomical tracing of phrenic motor neurons in mice
Uploaded: 2018-02-22T14:00:00
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Siamo grati a Robert Graffin e Pauline Duhant per il loro supporto tecnico.

Il protocollo sperimentale è stato condotto nel rispetto delle direttive del Consiglio delle Comunità europee per l'esperimento animale (2010/63/UE, 86/609/CEE e 87-848/CEE) ed è stato approvato da animale etica Comitato dell'Università di Namur (etica progetto n ° 17-284 ). Figura 1 raffigura i due rispettivi approcci: transdiaphragmatic o transtoracica iniezioni. Utilizzare i topi C57bl/6J maschii (n = 18), all'età da 3 a 4 mesi nello studio.
1. preparazione...

<ol>
	<li>Webber, C. L., Wurster, R. D., Chung, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cat+phrenic+nucleus+architecture+as+revealed+by+horseradish+peroxidase+mapping.">Cat phrenic nucleus architecture as revealed by horseradish peroxidase mapping.</a> Exp Brain Res. 35 (3), 395-406 (1979).</li><li>Goshgarian, H. G., Rafols, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phrenic+nucleus+of+the+albino+rat:+a+correlative+HRP+and+Golgi+study.">The phrenic nucleus of the albino rat: a correlative HRP and Golgi study.</a> J Comp Neurol. 201 (3), 441-456 (1981).</li><li>Gordon, D. C., Richmond, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topography+in+the+phrenic+motoneuron+nucleus+demonstrated+by+retrograde+multiple-labelling+techniques.">Topography in the phrenic motoneuron nucleus demonstrated by retrograde multiple-labelling techniques.</a> J Comp Neurol. 292 (3), 424-434 (1990).</li><li>Mantilla, C. B., Zhan, W. Z., Sieck, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrograde+labeling+of+phrenic+motoneurons+by+intrapleural+injection.">Retrograde labeling of phrenic motoneurons by intrapleural injection.</a> J Neurosci Methods. 182 (2), 244-249 (2009).</li><li>Nicaise, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+phrenic+motor+neuron+loss+and+transient+respiratory+abnormalities+after+unilateral+cervical+spinal+cord+contusion.">Early phrenic motor neuron loss and transient respiratory abnormalities after unilateral cervical spinal cord contusion.</a> J Neurotrauma. 30 (12), 1092-1099 (2013).</li><li>Nicaise, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phrenic+motor+neuron+degeneration+compromises+phrenic+axonal+circuitry+and+diaphragm+activity+in+a+unilateral+cervical+contusion+model+of+spinal+cord+injury.">Phrenic motor neuron degeneration compromises phrenic axonal circuitry and diaphragm activity in a unilateral cervical contusion model of spinal cord injury.</a> Exp Neurol. 235 (2), 539-552 (2012).</li><li>Nicaise, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Degeneration+of+phrenic+motor+neurons+induces+long-term+diaphragm+deficits+following+mid-cervical+spinal+contusion+in+mice.">Degeneration of phrenic motor neurons induces long-term diaphragm deficits following mid-cervical spinal contusion in mice.</a> J Neurotrauma. 29 (18), 2748-2760 (2012).</li><li>Qiu, K., Lane, M. A., Lee, K. Z., Reier, P. J., Fuller, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phrenic+motor+nucleus+in+the+adult+mouse.">The phrenic motor nucleus in the adult mouse.</a> Exp Neurol. 226 (1), 254-258 (2010).</li><li>Laskowski, M. B., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topographic+mapping+of+motor+pools+onto+skeletal+muscles.">Topographic mapping of motor pools onto skeletal muscles.</a> J Neurosci. 7 (1), 252-260 (1987).</li><li>Feldman, J. L., Loewy, A. D., Speck, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Projections+from+the+ventral+respiratory+group+to+phrenic+and+intercostal+motoneurons+in+cat:+an+autoradiographic+study.">Projections from the ventral respiratory group to phrenic and intercostal motoneurons in cat: an autoradiographic study.</a> J Neurosci. 5 (8), 1993-2000 (1985).</li><li>Gottschall, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+diaphragm+of+the+rat+and+its+innervation.+Muscle+fiber+composition;+perikarya+and+axons+of+efferent+and+afferent+neurons.">The diaphragm of the rat and its innervation. Muscle fiber composition; perikarya and axons of efferent and afferent neurons.</a> Anat Embryol (Berl). 161 (4), 405-417 (1981).</li><li>Lai, B. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholera+Toxin+B+Subunit+Shows+Transneuronal+Tracing+after+Injection+in+an+Injured+Sciatic+Nerve.">Cholera Toxin B Subunit Shows Transneuronal Tracing after Injection in an Injured Sciatic Nerve.</a> PLoS One. 10 (12), e0144030 (2015).</li><li>Torgersen, M. L., Skretting, G., van Deurs, B., Sandvig, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Internalization+of+cholera+toxin+by+different+endocytic+mechanisms.">Internalization of cholera toxin by different endocytic mechanisms.</a> J Cell Sci. 114 (Pt 20), 3737-3747 (2001).</li><li>Chinnapen, D. J., Chinnapen, H., Saslowsky, D., Lencer, W. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rafting+with+cholera+toxin:+endocytosis+and+trafficking+from+plasma+membrane+to+ER.">Rafting with cholera toxin: endocytosis and trafficking from plasma membrane to ER.</a> FEMS Microbiol Lett. 266 (2), 129-137 (2007).</li><li>Fujinaga, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gangliosides+that+associate+with+lipid+rafts+mediate+transport+of+cholera+and+related+toxins+from+the+plasma+membrane+to+endoplasmic+reticulm.">Gangliosides that associate with lipid rafts mediate transport of cholera and related toxins from the plasma membrane to endoplasmic reticulm.</a> Mol Biol Cell. 14 (12), 4783-4793 (2003).</li><li>Badizadegan, K., Wheeler, H. E., Fujinaga, Y., Lencer, W. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trafficking+of+cholera+toxin-ganglioside+GM1+complex+into+Golgi+and+induction+of+toxicity+depend+on+actin+cytoskeleton.">Trafficking of cholera toxin-ganglioside GM1 complex into Golgi and induction of toxicity depend on actin cytoskeleton.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 287 (5), C1453-C1462 (2004).</li><li>Abbott, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+axonal+transport+in+the+rat+visual+pathway.">Imaging axonal transport in the rat visual pathway.</a> Biomed Opt Express. 4 (2), 364-386 (2013).</li><li>Li, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+the+astrocyte+glutamate+transporter+GLT1+exacerbates+phrenic+motor+neuron+degeneration,+diaphragm+compromise,+and+forelimb+motor+dysfunction+following+cervical+contusion+spinal+cord+injury.">Overexpression of the astrocyte glutamate transporter GLT1 exacerbates phrenic motor neuron degeneration, diaphragm compromise, and forelimb motor dysfunction following cervical contusion spinal cord injury.</a> J Neurosci. 34 (22), 7622-7638 (2014).</li><li>Lepore, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraspinal+cell+transplantation+for+targeting+cervical+ventral+horn+in+amyotrophic+lateral+sclerosis+and+traumatic+spinal+cord+injury.">Intraspinal cell transplantation for targeting cervical ventral horn in amyotrophic lateral sclerosis and traumatic spinal cord injury.</a> J Vis Exp. (55), (2011).</li><li>Llado, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Degeneration+of+respiratory+motor+neurons+in+the+SOD1+G93A+transgenic+rat+model+of+ALS.">Degeneration of respiratory motor neurons in the SOD1 G93A transgenic rat model of ALS.</a> Neurobiol Dis. 21 (1), 110-118 (2006).</li><li>Lepore, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focal+transplantation-based+astrocyte+replacement+is+neuroprotective+in+a+model+of+motor+neuron+disease.">Focal transplantation-based astrocyte replacement is neuroprotective in a model of motor neuron disease.</a> Nat Neurosci. 11 (11), 1294-1301 (2008).</li><li>Sieck, G. C., Fournier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diaphragm+motor+unit+recruitment+during+ventilatory+and+nonventilatory+behaviors.">Diaphragm motor unit recruitment during ventilatory and nonventilatory behaviors.</a> J Appl Physiol. 66 (6), 2539-2545 (1989).</li><li>Janicot, M., Clot, J. P., Desbuquois, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+of+cholera+toxin+with+isolated+hepatocytes.+Effects+of+low+pH,+chloroquine+and+monensin+on+toxin+internalization,+processing+and+action.">Interactions of cholera toxin with isolated hepatocytes. Effects of low pH, chloroquine and monensin on toxin internalization, processing and action.</a> Biochem J. 253 (3), 735-743 (1988).</li></ol>

Il protocollo descritto nel presente documento può essere applicato a qualsiasi ceppo di topi adulti o a qualsiasi paradigma sperimentale in cui l'integrità della circuiteria diaframma-PhMN dovrebbe essere valutato. Per esempio, sclerosi laterale amiotrofica (ALS) e lesioni del midollo spinale cervicale (cSCI) sono condizioni associate alla perdita di PhMN, anterograda degenerazione degli assoni frenici e successivo compromesso respiratorio. Modelli animali di ALS o cSCI imitano istopatologico e funzionale respiratorio...

Lo scopo dello studio è quello di presentare un metodo affidabile per identificare frenici motoneuroni (PhMN) su sezioni di midollo spinale di topo. L'iniezione di un tracciante fluorescente neuroanatomical nella cavità pleurica è stato scelto come metodo di consegna per raggiungere le proiezioni neuromuscolare frenica sulla membrana del e utilizzare trasporto retrogrado lungo gli assoni frenici per etichettare frenici corpi cellulari. Vengono descritte due tecniche di consegna intrapleural: transdiaphragmatic versus transtoracica.
Frenici motoneuroni sono cellule spinali relè cui assoni convergono in nervi frenici, che in definitiva innervano il diaframma. Si tratta di neuroni motori inferiori beneficiano l'unità inspiratorio i centri respiratori bulbari e l'inoltro alle giunzioni neuro-muscolari del diaframma (NMJ). PhMN sono strutturati in due colonne motore, uno per ogni hemicord, che corre lungo la spina dorsale di metà di-cervicali. Nella maggior parte delle specie di mammiferi compreso gli esseri umani, le colonne motore frenica si è diffusa da livelli C3 C61,2,3. Noi ed altri abbiamo confermato che PhMN concentrata in livelli C3-C5 in ratti e topi del midollo spinale4,5,6,7,8. La distribuzione topografica delle cellule frenica non è a caso; motoneuroni che innervano la parte sternale del diaframma sono distribuiti più densamente nella parte craniale della piscina motore frenica (C3), mentre i motoneuroni che innervano la parte crurale sono più caudale (C5)9. Inoltre, PhMN sono raggruppati variamente nella materia grigia corno ventrale. A livello di C3, i mazzi delle cellule frenico si trovano lateralmente, poi spostare in senso ventrolateral e ventromedially si trovano presso la più caudale di livelli10,11.
Dato il loro ruolo vitale durante l'inspirazione, è della massima importanza per identificare con precisione PhMN nel midollo spinale sano, ma anche seguire il loro destino durante condizioni patologiche, come le malattie degenerative o lesioni traumatiche del midollo spinale. Poiché PhMN non differiscono morfologicamente da altri motoneuroni cervicali, identificazione di PhMN si basa sulla somministrazione mirata di traccianti neuroanatomici sia a livello dei centri respiratori primario8, o presso il diaframma NMJ7 o in il nervo frenico4. Il tracciante è ripreso da fibre nervose e trasportato fino ai corpi cellulari frenici del rachide cervicale, dove possono essere visualizzato utilizzando sistemi di rilevazione diretta o indiretta. Retrograda o anterograda traccianti sono commercialmente disponibili con una vasta gamma di coniugati. Degno di nota, ogni elemento tracciante è dotato di no, bassa o alta capacità per la trans sinaptica traccia.
Nello studio corrente, abbiamo scelto la subunità beta della tossina colerica (CTB) funzionalizzata con Alexa Fluor 555 (d'ora in poi denominato CTB-fluoroforo) come un'etichetta fluorescente, che permette una visualizzazione diretta del PhMN sulle sezioni congelate del midollo spinale. CTB è solitamente descritto come un tracciante monosinaptica, anche se i dati sperimentali tendono a mostrare un transneuronal passaggio12. CTB ha la capacità di legare il ganglioside GM1 alla membrana del plasma della terminazione nervosa. CTB è interiorizzato via clathrin-dipendente o - indipendente meccanismi e traffici attraverso la rete trans-Golgi nel reticolo endoplasmico in un modo retrogrado13,14. L'interiorizzazione e trasporto retrogrado sembrano essere legate il citoscheletro di actina15,16 , nonché sulla rete dei microtubuli17.
Per dimostrare l'utilità di CTB come tracciante retrogrado neuroanatomical diaframma-PhMN circuiti di etichettatura, CTB-fluoroforo è stato consegnato intrapleurally. CTB è stata amministrata usando due tecniche: quella prima comprendeva una laparotomia e iniezioni multiple di transdiaphragmatic; il secondo, meno invasivo, utilizzato un'iniezione unica transtoracica. Quattro giorni più tardi, con etichetta fluorescente PhMNs sono stati quantificati nel midollo spinale cervicale da entrambi da sano e da animali (C4) livello spinale-danneggiati.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Glass-bead sterilizer Steri 250</td>
			<td>Keller</td>
			<td>31-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small scissors</td>
			<td>F.S.T.</td>
			<td>14058-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soft tweezers</td>
			<td>F.S.T.</td>
			<td>11042-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blades</td>
			<td>Swann Morton</td>
			<td>No.11 or 15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera toxin subunit beta conjugated to Alexa Fluor 555</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>C22843</td>
			<td>Bring at room temperature before use&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10ul Hamilton syringue, removable needle</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>701RN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>33-gauge needle for Hamilton syringue, 20mm length, point style 4</td>
			<td>Filter Service</td>
			<td>7803-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500ul insulin syringue MyJector, 27-gauge</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>BS05M2713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orientable LED lamp</td>
			<td>V.W.R.</td>
			<td>631-0995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resorbable 4/0 sutures</td>
			<td>S.M.I. AG</td>
			<td>15151519</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle holder</td>
			<td>F.S.T.</td>
			<td>12002-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9mm autoclips</td>
			<td>Bioseb</td>
			<td>205016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclip 9mm applier</td>
			<td>Bioseb</td>
			<td>MikRon 9mm</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

retrograde neuroanatomical tracing of phrenic motor neurons in mice

Frenici motoneuroni sono motoneuroni cervicali provenienti da C3 a C6 livelli in specie di mammiferi più. Proiezioni axonal convergono in nervo frenico che innerva il diaframma respiratorio. A fettine di midollo spinale, frenici motoneuroni non può essere identificati da altri neuroni di motore su criteri morfologici o biochimici. Forniamo la descrizione delle procedure per la visualizzazione di corpi cellulari del neurone di motore frenico in topi, seguente intrapleural iniezioni di colera tossina subunità beta (CTB) coniugata con un fluoroforo. Questo tracciante fluorescente neuroanatomical ha la capacità di essere presi alla giunzione neuromuscolare diaframma, essere retrogradely trasportato lungo gli assoni frenici e raggiungere i corpi cellulari frenici. Vengono confrontati due approcci metodologici di consegna CTB intrapleural: transdiaphragmatic versus transtoracica iniezioni. Entrambi gli approcci sono successo e risultare in numero simile di CTB-labeled frenici motoneuroni. In conclusione, queste tecniche possono essere applicate per visualizzare o quantificare i motoneuroni frenici in vari studi sperimentali come quelli focalizzati sulla circuitazione diaframma-frenico.

I topi C57bl/6J maschii (n = 18), età da 3 a 4 mesi sono stati inclusi nello studio. Al giorno 0 dell'esperimento, 8 topi ha subito una contusione C4 unilaterale, destra-parteggiata, secondo protocollo pubblicato7,18. Come procedura sham, 10 topi ha subito un laminectomy sopra C4 senza contusione. Al giorno 3, topi sono stati preparati per le iniezioni di intrapleurica di CTB-fluoroforo secondo le due diverse procedure sopra desc...

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Retrograde Neuroanatomical Tracing of Phrenic Motor Neurons in Mice

Qui, descriviamo un protocollo per l'identificazione dei motoneuroni frenici in topi dopo intrapleural consegna del fluoroforo coniugati beta unità secondaria di colera tossina. Due tecniche vengono confrontati per iniettare la cavità pleurica: transdiaphragmatic versus approcci transtoracico.

Analisi Neuroanatomical retrogrado dei motoneuroni frenico in topi

Phrenic motor neurons are cervical motor neurons originating from C3 to C6 levels in most mammalian species. Axonal projections converge into phrenic ...

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