Name: retrograde neuroanatomical tracing of phrenic motor neurons in mice
Uploaded: 2018-02-22T14:00:00
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テクニカル サポートのためロバート Graffin とポーリーン Duhant に感謝しております。

実験的プロトコル実験動物 (2010/63/EU、86/609/EEC および 87-848/EEC) の欧州社会理事会指令に準拠して実施され、動物倫理委員会のナミュール大学 (倫理プロジェクト n ° 17-284 によって承認されました。).図 1は、2 つのそれぞれのアプローチを示しています: 横隔膜や経皮的注射。男性の c57bl/6 j マウスを使用 (n = 18) における 4 ヶ月 3 から歳。
1. CTB 溶液の?...

<ol>
	<li>Webber, C. L., Wurster, R. D., Chung, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cat+phrenic+nucleus+architecture+as+revealed+by+horseradish+peroxidase+mapping.">Cat phrenic nucleus architecture as revealed by horseradish peroxidase mapping.</a> Exp Brain Res. 35 (3), 395-406 (1979).</li><li>Goshgarian, H. G., Rafols, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phrenic+nucleus+of+the+albino+rat:+a+correlative+HRP+and+Golgi+study.">The phrenic nucleus of the albino rat: a correlative HRP and Golgi study.</a> J Comp Neurol. 201 (3), 441-456 (1981).</li><li>Gordon, D. C., Richmond, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topography+in+the+phrenic+motoneuron+nucleus+demonstrated+by+retrograde+multiple-labelling+techniques.">Topography in the phrenic motoneuron nucleus demonstrated by retrograde multiple-labelling techniques.</a> J Comp Neurol. 292 (3), 424-434 (1990).</li><li>Mantilla, C. B., Zhan, W. Z., Sieck, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrograde+labeling+of+phrenic+motoneurons+by+intrapleural+injection.">Retrograde labeling of phrenic motoneurons by intrapleural injection.</a> J Neurosci Methods. 182 (2), 244-249 (2009).</li><li>Nicaise, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+phrenic+motor+neuron+loss+and+transient+respiratory+abnormalities+after+unilateral+cervical+spinal+cord+contusion.">Early phrenic motor neuron loss and transient respiratory abnormalities after unilateral cervical spinal cord contusion.</a> J Neurotrauma. 30 (12), 1092-1099 (2013).</li><li>Nicaise, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phrenic+motor+neuron+degeneration+compromises+phrenic+axonal+circuitry+and+diaphragm+activity+in+a+unilateral+cervical+contusion+model+of+spinal+cord+injury.">Phrenic motor neuron degeneration compromises phrenic axonal circuitry and diaphragm activity in a unilateral cervical contusion model of spinal cord injury.</a> Exp Neurol. 235 (2), 539-552 (2012).</li><li>Nicaise, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Degeneration+of+phrenic+motor+neurons+induces+long-term+diaphragm+deficits+following+mid-cervical+spinal+contusion+in+mice.">Degeneration of phrenic motor neurons induces long-term diaphragm deficits following mid-cervical spinal contusion in mice.</a> J Neurotrauma. 29 (18), 2748-2760 (2012).</li><li>Qiu, K., Lane, M. A., Lee, K. Z., Reier, P. J., Fuller, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phrenic+motor+nucleus+in+the+adult+mouse.">The phrenic motor nucleus in the adult mouse.</a> Exp Neurol. 226 (1), 254-258 (2010).</li><li>Laskowski, M. B., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topographic+mapping+of+motor+pools+onto+skeletal+muscles.">Topographic mapping of motor pools onto skeletal muscles.</a> J Neurosci. 7 (1), 252-260 (1987).</li><li>Feldman, J. L., Loewy, A. D., Speck, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Projections+from+the+ventral+respiratory+group+to+phrenic+and+intercostal+motoneurons+in+cat:+an+autoradiographic+study.">Projections from the ventral respiratory group to phrenic and intercostal motoneurons in cat: an autoradiographic study.</a> J Neurosci. 5 (8), 1993-2000 (1985).</li><li>Gottschall, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+diaphragm+of+the+rat+and+its+innervation.+Muscle+fiber+composition;+perikarya+and+axons+of+efferent+and+afferent+neurons.">The diaphragm of the rat and its innervation. Muscle fiber composition; perikarya and axons of efferent and afferent neurons.</a> Anat Embryol (Berl). 161 (4), 405-417 (1981).</li><li>Lai, B. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholera+Toxin+B+Subunit+Shows+Transneuronal+Tracing+after+Injection+in+an+Injured+Sciatic+Nerve.">Cholera Toxin B Subunit Shows Transneuronal Tracing after Injection in an Injured Sciatic Nerve.</a> PLoS One. 10 (12), e0144030 (2015).</li><li>Torgersen, M. L., Skretting, G., van Deurs, B., Sandvig, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Internalization+of+cholera+toxin+by+different+endocytic+mechanisms.">Internalization of cholera toxin by different endocytic mechanisms.</a> J Cell Sci. 114 (Pt 20), 3737-3747 (2001).</li><li>Chinnapen, D. J., Chinnapen, H., Saslowsky, D., Lencer, W. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rafting+with+cholera+toxin:+endocytosis+and+trafficking+from+plasma+membrane+to+ER.">Rafting with cholera toxin: endocytosis and trafficking from plasma membrane to ER.</a> FEMS Microbiol Lett. 266 (2), 129-137 (2007).</li><li>Fujinaga, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gangliosides+that+associate+with+lipid+rafts+mediate+transport+of+cholera+and+related+toxins+from+the+plasma+membrane+to+endoplasmic+reticulm.">Gangliosides that associate with lipid rafts mediate transport of cholera and related toxins from the plasma membrane to endoplasmic reticulm.</a> Mol Biol Cell. 14 (12), 4783-4793 (2003).</li><li>Badizadegan, K., Wheeler, H. E., Fujinaga, Y., Lencer, W. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trafficking+of+cholera+toxin-ganglioside+GM1+complex+into+Golgi+and+induction+of+toxicity+depend+on+actin+cytoskeleton.">Trafficking of cholera toxin-ganglioside GM1 complex into Golgi and induction of toxicity depend on actin cytoskeleton.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 287 (5), C1453-C1462 (2004).</li><li>Abbott, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+axonal+transport+in+the+rat+visual+pathway.">Imaging axonal transport in the rat visual pathway.</a> Biomed Opt Express. 4 (2), 364-386 (2013).</li><li>Li, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+the+astrocyte+glutamate+transporter+GLT1+exacerbates+phrenic+motor+neuron+degeneration,+diaphragm+compromise,+and+forelimb+motor+dysfunction+following+cervical+contusion+spinal+cord+injury.">Overexpression of the astrocyte glutamate transporter GLT1 exacerbates phrenic motor neuron degeneration, diaphragm compromise, and forelimb motor dysfunction following cervical contusion spinal cord injury.</a> J Neurosci. 34 (22), 7622-7638 (2014).</li><li>Lepore, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraspinal+cell+transplantation+for+targeting+cervical+ventral+horn+in+amyotrophic+lateral+sclerosis+and+traumatic+spinal+cord+injury.">Intraspinal cell transplantation for targeting cervical ventral horn in amyotrophic lateral sclerosis and traumatic spinal cord injury.</a> J Vis Exp. (55), (2011).</li><li>Llado, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Degeneration+of+respiratory+motor+neurons+in+the+SOD1+G93A+transgenic+rat+model+of+ALS.">Degeneration of respiratory motor neurons in the SOD1 G93A transgenic rat model of ALS.</a> Neurobiol Dis. 21 (1), 110-118 (2006).</li><li>Lepore, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focal+transplantation-based+astrocyte+replacement+is+neuroprotective+in+a+model+of+motor+neuron+disease.">Focal transplantation-based astrocyte replacement is neuroprotective in a model of motor neuron disease.</a> Nat Neurosci. 11 (11), 1294-1301 (2008).</li><li>Sieck, G. C., Fournier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diaphragm+motor+unit+recruitment+during+ventilatory+and+nonventilatory+behaviors.">Diaphragm motor unit recruitment during ventilatory and nonventilatory behaviors.</a> J Appl Physiol. 66 (6), 2539-2545 (1989).</li><li>Janicot, M., Clot, J. P., Desbuquois, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+of+cholera+toxin+with+isolated+hepatocytes.+Effects+of+low+pH,+chloroquine+and+monensin+on+toxin+internalization,+processing+and+action.">Interactions of cholera toxin with isolated hepatocytes. Effects of low pH, chloroquine and monensin on toxin internalization, processing and action.</a> Biochem J. 253 (3), 735-743 (1988).</li></ol>

記載プロトコルは、成体マウスの任意のひずみまたはダイヤフラム PhMN 回路の整合性を評価する必要がある任意の実験パラダイムを適用できます。例えば、筋萎縮性側索硬化症 (ALS)、脊髄損傷 (cSCI) は、横隔神経軸索と後続の呼吸の妥協の前向性変性 PhMN 損失に関連付けられている条件です。ALS または cSCI の動物モデルは人間の病気にみられる病理組織学的および機能の呼吸欠損を模倣しま?...

研究の目的は、横隔膜運動ニューロン (PhMN) マウスの脊髄のセクションを識別するために信頼性の高い方法を提示することです。胸腔内に蛍光の神経解剖学的トレーサーの注入は、横隔膜に横隔神経筋の予測をアクセスし、横隔細胞体のラベルに横隔神経軸索に沿って逆行性輸送を使用する配信方法として選ばれました。左胸腔内配信の 2 つのテクニックを説明: 経胸壁と横隔膜。
横隔膜の運動ニューロンは、脊髄の中継細胞の軸索が最終的に横隔膜を支配する横隔神経へ収束です。これらは、下位運動ニューロン延髄呼吸センターから吸気ドライブを受け取ると横隔膜神経-筋接合部 (NMJ) を中継します。PhMN は、半ば頸部の背骨に沿って実行している、各 hemicord の 1 つのモーター列に構成されています。人間を含む哺乳類の種のほとんどは、横隔膜運動列レベル C3 から C61,2,3に します。私たちと他の人は、PhMN がラットおよびマウス脊髄4,5,6,7、8に C3 ~ C5 レベルで集中してを確認しています。横隔細胞の地形の分布はランダム。横隔膜胸骨部を支配する運動ニューロンは、下腿の一部を支配する運動ニューロンがより尾側 (C5)9に対し横隔モーター プール (C3) の頭蓋の部分でより密分散されます。さらに、PhMN は脊髄前角の灰白質にいろいろクラスター化します。C3 レベルで横隔細胞のクラスターが横方向に, うそをつくし、腹の方向にシフトして、最も尾側レベル10、11ventromedially があります。
吸気時に重要な役割を与え、健康的な脊髄の PhMN を正確に識別するが、また変性疾患や脊髄の外傷などの病理学の条件の中に、彼らの運命に従う最も重要であるのです。以来、PhMN は他の頚椎の運動ニューロンから形態学的違いは、PhMN の同定は、神経解剖学的トレーサー レベル主に人工呼吸器センター8、またはダイヤフラム NMJ7またはのいずれかのターゲットを絞った配信横隔神経の4。トレーサーは、神経線維によってとられ、頸椎、横隔細胞体まで運ば直接的または間接的な検出システムを使用して視覚化することができますここ。逆行性または前向性トレーサー抱合体の広い範囲で市販されています。注目すべき、各トレーサーは無しで、恵まれているトランス シナプス トレースの低または高能力。
現在の研究では、我々 修飾と Alexa Fluor 555 (CTB fluorophore として今後呼ばれる) コレラ毒素 (CTB) の β サブユニットとして選んだ蛍光ラベル冷凍脊髄のセクションで PhMN の直接視覚化を許可します。CTB は、実験データは、シナプス通過12を表示する傾向があるが通常シナプスのトレーサーとして記述されます。CTB で神経終末の細胞膜ガングリオシド GM1 をバインドする機能があります。CTB がクラスリン依存または独立したメカニズムとトランスゴルジ ネットワークを介してトラフィックを介して逆行性ファッション13,14の小胞体に内部的なもの。インターナライゼーションと逆行輸送アクチン細胞骨格15,16だけでなく微小管ネットワーク17依存するようです。
CTB fluorophore は CTB のダイヤフラム PhMN 回路をラベリング逆行性神経解剖学的トレーサーとしての有用性を示すためには、intrapleurally を配信されました。CTB は、2 つの手法が投与された: 最初の 1 つに開腹し, と複数の横隔膜の注入; が含まれています。2 番目の 1 つ、低侵襲を使用独自の経胸壁射出。4 日後、蛍光標識した PhMNs は健康とする傷つけられた (C4) 動物からの両方から頚髄損傷の定量化されました。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Glass-bead sterilizer Steri 250</td>
			<td>Keller</td>
			<td>31-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small scissors</td>
			<td>F.S.T.</td>
			<td>14058-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soft tweezers</td>
			<td>F.S.T.</td>
			<td>11042-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blades</td>
			<td>Swann Morton</td>
			<td>No.11 or 15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera toxin subunit beta conjugated to Alexa Fluor 555</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>C22843</td>
			<td>Bring at room temperature before use&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10ul Hamilton syringue, removable needle</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>701RN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>33-gauge needle for Hamilton syringue, 20mm length, point style 4</td>
			<td>Filter Service</td>
			<td>7803-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500ul insulin syringue MyJector, 27-gauge</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>BS05M2713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orientable LED lamp</td>
			<td>V.W.R.</td>
			<td>631-0995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resorbable 4/0 sutures</td>
			<td>S.M.I. AG</td>
			<td>15151519</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle holder</td>
			<td>F.S.T.</td>
			<td>12002-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9mm autoclips</td>
			<td>Bioseb</td>
			<td>205016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclip 9mm applier</td>
			<td>Bioseb</td>
			<td>MikRon 9mm</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

retrograde neuroanatomical tracing of phrenic motor neurons in mice

横隔膜の運動ニューロンは、頚椎の運動ニューロンが C3 から C6 レベルほとんどの哺乳類の種への発信です。軸索投射は、呼吸の横隔膜を刺激する横隔神経に収束します。脊髄スライスでは、形態学的または生化学的基準に他の運動ニューロンから横隔膜の運動ニューロンを識別できません。マウス、コレラ毒素サブユニット β (CTB)、fluorophore に活用されるの次の左胸腔内注入で横隔膜の運動ニューロン細胞体を可視化するための手順の説明を提供します。この蛍光の神経解剖学的トレーサーは、横隔膜神経筋接合部に巻き込まれる、横隔神経軸索に沿って逆行性にされ、横隔膜の細胞体に到達する能力を持っています。胸腔テレ配信の 2 つの方法論的アプローチの比較: 経皮的注射と横隔膜。両方のアプローチは成功している、CTB ラベル横隔膜運動ニューロンの数がほぼ同じ結果します。結論としては、これらの技術は、可視化やダイヤフラム隔回路に焦点を当てたものなど様々 な実験的研究で横隔膜の運動ニューロンを定量化に適用できます。

男性の c57bl/6 j マウス (n = 18)、3 から 4 ヶ月に高齢者が研究に含まれていた。実験の日 0、8 マウスは公開プロトコル7,18によると一方的な C4 挫傷、右サイドを受けた。偽の手順としては、10 匹のマウスは、挫傷なし C4 の上に椎弓切除術を施行した.3 日目でマウスは上記で説明した 2 つの異なる手順によると CTB fluorophore の左?...

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Retrograde Neuroanatomical Tracing of Phrenic Motor Neurons in Mice

ここでは、蛍光体の左胸腔内配信共役コレラ毒素サブユニット β 後マウスにおける横隔膜の運動ニューロンを識別するためのプロトコルについて述べる.胸腔内を注入する 2 つの手法を比較: 横隔膜胸壁アプローチ対。

マウスにおける横隔膜の運動ニューロンの逆行性神経解剖学的トレーシング

Phrenic motor neurons are cervical motor neurons originating from C3 to C6 levels in most mammalian species. Axonal projections converge into phrenic ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Assessment of Motor Balance and Coordination in Mice using the Balance Beam

バランスビームを用いてマウスにおける運動バランスとコーディネーションの評価

Brain injury, genetic manipulations, and pharmacological treatments can result in alterations of motor skills in mice.  Fine motor coordination and ...

Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging

複数のマウスの神経解剖学的磁気共鳴イメージング

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and ...

Measuring Motor Coordination in Mice

マウスにおける運動協調性の測定

Mice are increasingly being used in behavioral neuroscience, largely replacing rats as the behaviorist's animal of choice. Before aspects of behavior such ...

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

逆行性蛍光標識は、特定された神経細胞から標的細胞外シングルユニット記録を可能にします<em生体内で&gt;</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

Extracellularly Identifying Motor Neurons for a Muscle Motor Pool in Aplysia californica

Extracellularly Identifying Motor Neurons for a Muscle Motor Pool in Aplysia californica

体外における筋モータープールのために運動ニューロンの識別<em&gt;アメフラシカリフォルニ</em

In animals with large  identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using  intracellular techniques1,2,3,4. Recently,  we developed ...

Functional and Morphological Assessment of Diaphragm Innervation by Phrenic Motor Neurons

横隔運動ニューロンによってダイヤフラム神経支配の機能的および形態学的評価

This protocol specifically focuses on tools for assessing phrenic motor neuron (PhMN) innervation of the diaphragm at both the electrophysiological and ...

Intramuscular Injections Along the Motor End Plates: A Minimally Invasive Approach to Shuttle Tracers Directly into Motor Neurons

モーターエンドプレートに沿って筋肉内注射：直接運動ニューロンへのシャトルトレーサーへの低侵襲アプローチ

Diseases affecting the integrity of spinal cord motor neurons are amongst the most debilitating neurological conditions. Over the last decades, the ...

Laser-guided Neuronal Tracing In Brain Explants

脳の外植片にレーザー誘導神経トレース

We present a technique which combines an in vitro tracer injection protocol, which uses a series of electrical and pressure pulses to increase dye uptake ...

Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

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胎児運動ニューロンの軸索突起パターンの視覚化<em&gt;ショウジョウバエ</em

The establishment of functional neuromuscular circuits relies on precise connections between developing motor axons and target muscles. Motor neurons ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

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生体内で新生仔マウスの大脳皮質ニューロンの 2 光子イメージング

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...