Name: retrograde neuroanatomical tracing of phrenic motor neurons in mice
Uploaded: 2018-02-22T14:00:00
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Nós estamos gratos ao Robert Graffin e Pauline Duhant pelo apoio técnico.

O protocolo experimental foi realizado em conformidade com as directivas do Conselho das Comunidades Europeias para o experimento Animal (2010/63/UE, 86/609/CEE e 87-848/CEE) e foi aprovado pelo Animal ética Comissão de Universidade de Namur (ética projeto n ° 17-284 ). A Figura 1 descreve as duas abordagens respectivas: transdiaphragmatic ou injeções transtorácicos. Usar camundongos C57bl/6J machos (n = 18), a idade de 3 a 4 meses no estudo.
1. preparação ...

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	<li>Webber, C. L., Wurster, R. D., Chung, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cat+phrenic+nucleus+architecture+as+revealed+by+horseradish+peroxidase+mapping.">Cat phrenic nucleus architecture as revealed by horseradish peroxidase mapping.</a> Exp Brain Res. 35 (3), 395-406 (1979).</li><li>Goshgarian, H. G., Rafols, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phrenic+nucleus+of+the+albino+rat:+a+correlative+HRP+and+Golgi+study.">The phrenic nucleus of the albino rat: a correlative HRP and Golgi study.</a> J Comp Neurol. 201 (3), 441-456 (1981).</li><li>Gordon, D. C., Richmond, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topography+in+the+phrenic+motoneuron+nucleus+demonstrated+by+retrograde+multiple-labelling+techniques.">Topography in the phrenic motoneuron nucleus demonstrated by retrograde multiple-labelling techniques.</a> J Comp Neurol. 292 (3), 424-434 (1990).</li><li>Mantilla, C. B., Zhan, W. Z., Sieck, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrograde+labeling+of+phrenic+motoneurons+by+intrapleural+injection.">Retrograde labeling of phrenic motoneurons by intrapleural injection.</a> J Neurosci Methods. 182 (2), 244-249 (2009).</li><li>Nicaise, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+phrenic+motor+neuron+loss+and+transient+respiratory+abnormalities+after+unilateral+cervical+spinal+cord+contusion.">Early phrenic motor neuron loss and transient respiratory abnormalities after unilateral cervical spinal cord contusion.</a> J Neurotrauma. 30 (12), 1092-1099 (2013).</li><li>Nicaise, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phrenic+motor+neuron+degeneration+compromises+phrenic+axonal+circuitry+and+diaphragm+activity+in+a+unilateral+cervical+contusion+model+of+spinal+cord+injury.">Phrenic motor neuron degeneration compromises phrenic axonal circuitry and diaphragm activity in a unilateral cervical contusion model of spinal cord injury.</a> Exp Neurol. 235 (2), 539-552 (2012).</li><li>Nicaise, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Degeneration+of+phrenic+motor+neurons+induces+long-term+diaphragm+deficits+following+mid-cervical+spinal+contusion+in+mice.">Degeneration of phrenic motor neurons induces long-term diaphragm deficits following mid-cervical spinal contusion in mice.</a> J Neurotrauma. 29 (18), 2748-2760 (2012).</li><li>Qiu, K., Lane, M. A., Lee, K. Z., Reier, P. J., Fuller, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phrenic+motor+nucleus+in+the+adult+mouse.">The phrenic motor nucleus in the adult mouse.</a> Exp Neurol. 226 (1), 254-258 (2010).</li><li>Laskowski, M. B., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topographic+mapping+of+motor+pools+onto+skeletal+muscles.">Topographic mapping of motor pools onto skeletal muscles.</a> J Neurosci. 7 (1), 252-260 (1987).</li><li>Feldman, J. L., Loewy, A. D., Speck, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Projections+from+the+ventral+respiratory+group+to+phrenic+and+intercostal+motoneurons+in+cat:+an+autoradiographic+study.">Projections from the ventral respiratory group to phrenic and intercostal motoneurons in cat: an autoradiographic study.</a> J Neurosci. 5 (8), 1993-2000 (1985).</li><li>Gottschall, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+diaphragm+of+the+rat+and+its+innervation.+Muscle+fiber+composition;+perikarya+and+axons+of+efferent+and+afferent+neurons.">The diaphragm of the rat and its innervation. Muscle fiber composition; perikarya and axons of efferent and afferent neurons.</a> Anat Embryol (Berl). 161 (4), 405-417 (1981).</li><li>Lai, B. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholera+Toxin+B+Subunit+Shows+Transneuronal+Tracing+after+Injection+in+an+Injured+Sciatic+Nerve.">Cholera Toxin B Subunit Shows Transneuronal Tracing after Injection in an Injured Sciatic Nerve.</a> PLoS One. 10 (12), e0144030 (2015).</li><li>Torgersen, M. L., Skretting, G., van Deurs, B., Sandvig, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Internalization+of+cholera+toxin+by+different+endocytic+mechanisms.">Internalization of cholera toxin by different endocytic mechanisms.</a> J Cell Sci. 114 (Pt 20), 3737-3747 (2001).</li><li>Chinnapen, D. J., Chinnapen, H., Saslowsky, D., Lencer, W. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rafting+with+cholera+toxin:+endocytosis+and+trafficking+from+plasma+membrane+to+ER.">Rafting with cholera toxin: endocytosis and trafficking from plasma membrane to ER.</a> FEMS Microbiol Lett. 266 (2), 129-137 (2007).</li><li>Fujinaga, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gangliosides+that+associate+with+lipid+rafts+mediate+transport+of+cholera+and+related+toxins+from+the+plasma+membrane+to+endoplasmic+reticulm.">Gangliosides that associate with lipid rafts mediate transport of cholera and related toxins from the plasma membrane to endoplasmic reticulm.</a> Mol Biol Cell. 14 (12), 4783-4793 (2003).</li><li>Badizadegan, K., Wheeler, H. E., Fujinaga, Y., Lencer, W. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trafficking+of+cholera+toxin-ganglioside+GM1+complex+into+Golgi+and+induction+of+toxicity+depend+on+actin+cytoskeleton.">Trafficking of cholera toxin-ganglioside GM1 complex into Golgi and induction of toxicity depend on actin cytoskeleton.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 287 (5), C1453-C1462 (2004).</li><li>Abbott, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+axonal+transport+in+the+rat+visual+pathway.">Imaging axonal transport in the rat visual pathway.</a> Biomed Opt Express. 4 (2), 364-386 (2013).</li><li>Li, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+the+astrocyte+glutamate+transporter+GLT1+exacerbates+phrenic+motor+neuron+degeneration,+diaphragm+compromise,+and+forelimb+motor+dysfunction+following+cervical+contusion+spinal+cord+injury.">Overexpression of the astrocyte glutamate transporter GLT1 exacerbates phrenic motor neuron degeneration, diaphragm compromise, and forelimb motor dysfunction following cervical contusion spinal cord injury.</a> J Neurosci. 34 (22), 7622-7638 (2014).</li><li>Lepore, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraspinal+cell+transplantation+for+targeting+cervical+ventral+horn+in+amyotrophic+lateral+sclerosis+and+traumatic+spinal+cord+injury.">Intraspinal cell transplantation for targeting cervical ventral horn in amyotrophic lateral sclerosis and traumatic spinal cord injury.</a> J Vis Exp. (55), (2011).</li><li>Llado, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Degeneration+of+respiratory+motor+neurons+in+the+SOD1+G93A+transgenic+rat+model+of+ALS.">Degeneration of respiratory motor neurons in the SOD1 G93A transgenic rat model of ALS.</a> Neurobiol Dis. 21 (1), 110-118 (2006).</li><li>Lepore, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focal+transplantation-based+astrocyte+replacement+is+neuroprotective+in+a+model+of+motor+neuron+disease.">Focal transplantation-based astrocyte replacement is neuroprotective in a model of motor neuron disease.</a> Nat Neurosci. 11 (11), 1294-1301 (2008).</li><li>Sieck, G. C., Fournier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diaphragm+motor+unit+recruitment+during+ventilatory+and+nonventilatory+behaviors.">Diaphragm motor unit recruitment during ventilatory and nonventilatory behaviors.</a> J Appl Physiol. 66 (6), 2539-2545 (1989).</li><li>Janicot, M., Clot, J. P., Desbuquois, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+of+cholera+toxin+with+isolated+hepatocytes.+Effects+of+low+pH,+chloroquine+and+monensin+on+toxin+internalization,+processing+and+action.">Interactions of cholera toxin with isolated hepatocytes. Effects of low pH, chloroquine and monensin on toxin internalization, processing and action.</a> Biochem J. 253 (3), 735-743 (1988).</li></ol>

O protocolo descrito neste documento pode ser aplicado a qualquer tipo de ratos adultos ou qualquer paradigma experimental em que a integridade do diafragma-PhMN circuito deve ser avaliada. Por exemplo, a esclerose lateral amiotrófica (ela) e lesão medular cervical (cSCI) são condições associadas com perda de PhMN, anterógrada degeneração dos axônios frênico e subsequente compromisso respiratório. Modelos animais de ALS ou cSCI imitam histopatológicos e funcionais respiratórios déficits observados em doenç...

O objetivo do estudo é apresentar um método confiável para identificar os neurônios motores frênico (PhMN) em seções de rato da medula espinhal. Injeção de um traçador fluorescente neuroanatômica na cavidade pleural foi escolhida como o método de entrega para alcançar as projeções frênica neuromusculares sobre o diafragma e usar o transporte retrógrado ao longo dos axônios frênico para rótulo frênico corpos celulares. Duas técnicas de entrega intrapleural são descritas: transdiaphragmatic versus transtorácica.
Frênico neurônios são células de relé espinhal cujos axônios convergem em nervos frênico, que em última análise, inervam o diafragma. Estes são os neurônios motores inferiores recebendo o drive inspiratório do centro respiratório bulbar e retransmitindo-as junções de diafragma neuro-muscular (JNM). PhMN estão estruturados em duas colunas de motor, uma para cada hemicord, correndo ao longo da espinha meados-cervical. Na maioria das espécies mamíferas, incluindo os seres humanos, as colunas de motor frênica espalhar de níveis C3 a C61,2,3. Nós e os outros confirmaram que PhMN concentrada nos níveis C3-C5 no rato e o rato da medula espinhal4,5,6,7,8. A distribuição topográfica das células frênica não é ao acaso; os neurônios motores que inervam a parte esternal do diafragma são mais densamente distribuídos na parte cranial da frota de veículos frênica (C3), Considerando que os neurônios motores que inervam a parte crural são mais caudal (C5)9. Além disso, PhMN estão agrupadas vària no Corno ventral cinzenta. A nível de C3, os clusters de células frênico minto lateralmente, então eles se deslocar em uma direção ventrolateral e encontram-se ventromedially com a mais caudal níveis10,11.
Dado o seu papel vital durante a inspiração, é de extrema importância para identificar com precisão a PhMN na medula espinhal saudável mas também seguir seu destino durante condições patológicas, tais como doenças degenerativas ou lesões traumáticas da medula espinhal. Desde que PhMN não diferem morfologicamente outros neurônios motor cervicais, identificação de PhMN baseia-se na entrega alvo dos marcadores neuroanatômica, tanto ao nível dos centros respiratórios primária8, ou diafragma MNJ7 ou em o nervo frênico4. O tracer é retomado pelas fibras nervosas e transportado até os frênico corpos celulares na coluna cervical, onde ele pode ser visualizado usando sistemas de deteção direta ou indireta. Retrógrada ou anterógrada traçadores são comercialmente disponíveis com uma ampla gama de conjugados. Notável, cada marcador é dotado não, baixas ou altas habilidades para rastreamento sináptica trans.
No estudo atual, nós escolhemos a subunidade beta a toxina da cólera (CTB) acrescida com Alexa Fluor 555 (doravante referido como CTB-fluoróforo) como uma etiqueta fluorescente, permitindo uma visualização directa de PhMN em seções congeladas da medula espinhal. CTB normalmente é descrito como um tracer monosynaptic embora dados experimentais tendem a mostrar uma passagem de transneuronal12. CTB tem a capacidade de vincular o gangliosídeo GM1 na membrana plasmática do fim do nervo. CTB é internalizada através de Clatrina dependente ou - independente mecanismos e tráfegos através da rede trans-Golgi em retículo endoplasmático em uma moda retrógrada13,14. A internalização e o transporte retrógrado parecem ser dependente sobre o citoesqueleto de actina15,16 , bem como sobre a rede de microtúbulos17.
Para demonstrar a utilidade do CTB como um traçador neuroanatômica retrógrada rotulagem diafragma-PhMN circuitos, CTB-fluoróforo foi entregue intrapleurally. CTB foi administrado usando duas técnicas: a primeira que incluía uma laparotomia e múltiplas injecções de transdiaphragmatic; o segundo, menos invasiva, usado uma única injeção transtorácica. Quatro dias mais tarde, fluorescente-etiquetadas PhMNs foram quantificados na medula espinhal cervical de ambos de saudável e de feridas spinally (C4) animais.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Glass-bead sterilizer Steri 250</td>
			<td>Keller</td>
			<td>31-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small scissors</td>
			<td>F.S.T.</td>
			<td>14058-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soft tweezers</td>
			<td>F.S.T.</td>
			<td>11042-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blades</td>
			<td>Swann Morton</td>
			<td>No.11 or 15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera toxin subunit beta conjugated to Alexa Fluor 555</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>C22843</td>
			<td>Bring at room temperature before use&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10ul Hamilton syringue, removable needle</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>701RN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>33-gauge needle for Hamilton syringue, 20mm length, point style 4</td>
			<td>Filter Service</td>
			<td>7803-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500ul insulin syringue MyJector, 27-gauge</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>BS05M2713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orientable LED lamp</td>
			<td>V.W.R.</td>
			<td>631-0995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resorbable 4/0 sutures</td>
			<td>S.M.I. AG</td>
			<td>15151519</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle holder</td>
			<td>F.S.T.</td>
			<td>12002-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9mm autoclips</td>
			<td>Bioseb</td>
			<td>205016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclip 9mm applier</td>
			<td>Bioseb</td>
			<td>MikRon 9mm</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

retrograde neuroanatomical tracing of phrenic motor neurons in mice

Frênico neurônios motores são cervicais neurônios motores provenientes de C3 a C6 níveis em espécies de mamíferos mais. Axonal projeções convergem em nervos frênico que inervam o diafragma respiratório. Em fatias de medula espinhal, neurônios frênico não pode ser identificados de outros neurônios motores em critérios morfológicos ou bioquímicos. Nós fornecemos a descrição dos procedimentos para a visualização do neurônio motor frênico corpos celulares em camundongos, seguir intrapleural injeções de beta cólera toxina subunidade (CTB) conjugada com um fluoróforo. Este marcador fluorescente neuroanatômica tem a capacidade de ser pego na junção neuromuscular de diafragma, efectuar-se retrogradely ao longo dos axônios frênico e alcançar os frênico corpos celulares. Duas abordagens metodológicas da entrega CTB intrapleural são comparadas: transdiaphragmatic versus transtorácicos injeções. Ambas as abordagens são bem sucedidas e resultam em número semelhante de CTB-rotulado frênico neurônios motores. Em conclusão, essas técnicas podem ser aplicadas para visualizar ou quantificar os neurônios motores frênico em vários estudos experimentais tais como aqueles focados no circuito frênico-diafragma.

Camundongos C57bl/6J machos (n = 18), com idade de 3 a 4 meses foram incluídos no estudo. No dia 0 do experimento, 8 ratos sofreram uma contusão unilateral do C4, lado direito, de acordo com o protocolo publicado7,18. Como procedimento de Souza, 10 ratos foi submetido a uma laminectomia em cima C4 sem contusão. No dia 3, os ratos estavam preparados para as injeções intrapleural do CTB-fluoróforo de acordo com os dois procedi...

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Retrograde Neuroanatomical Tracing of Phrenic Motor Neurons in Mice

Aqui, descrevemos um protocolo para identificar frênico neurônios em ratos após entrega intrapleural de fluoróforo conjugado beta de subunidade de toxina de cólera. Duas técnicas são comparadas para injetar a cavidade pleural: transdiaphragmatic versus transtorácicos abordagens.

Rastreamento neuroanatômica retrógrado do frênico neurônios em ratos

Phrenic motor neurons are cervical motor neurons originating from C3 to C6 levels in most mammalian species. Axonal projections converge into phrenic ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Assessment of Motor Balance and Coordination in Mice using the Balance Beam

Avaliação do Equilíbrio e Coordenação Motor em camundongos usando o feixe de equilíbrio

Brain injury, genetic manipulations, and pharmacological treatments can result in alterations of motor skills in mice.  Fine motor coordination and ...

Neurociência

Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging

Múltiplas mouse-Imagem por Ressonância Magnética neuroanatômicos

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and ...

Measuring Motor Coordination in Mice

Medindo Coordenação Motora em Ratos

Mice are increasingly being used in behavioral neuroscience, largely replacing rats as the behaviorist's animal of choice. Before aspects of behavior such ...

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Labeling fluorescentes retrógrada Permite alvejado Extracelular Gravação Single-unidade dos neurônios identificados<em&gt; In vivo</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

Extracellularly Identifying Motor Neurons for a Muscle Motor Pool in Aplysia californica

Extracellularly Identifying Motor Neurons for a Muscle Motor Pool in Aplysia californica

Extracelularmente Identificar os neurônios motores de um pool do motor muscular em<em&gt; Aplysia californica</em

In animals with large  identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using  intracellular techniques1,2,3,4. Recently,  we developed ...

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Funcional e morfológica de Avaliação de Diafragma Innervation por frênico Neurônios Motores

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