Name: in vivo monitoring of circadian clock gene expression in the mouse suprachiasmatic nucleus using fluorescence reporters
Uploaded: 2018-07-04T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Monitoring of Circadian Clock Gene Expression in the Mouse Suprachiasmatic Nucleus Using Fluorescence Reporters at JoVE.com

Nous remercions les membres du laboratoire de Zhang pour prévoyant la fourniture d’assistance technique de stimuler les discussions et les membres du laboratoire de Zhan. Cette recherche a été financée par des subventions 31500860 (de C.Z.) de la FNSC, 2012CB837700 (de C.E.A et C.Z.) du programme 973 de le M.O.S.T. de Chine et par le financement de l’administration municipale de Pékin. C.E.A a été appuyée par les chinois « Programme de recrutement d’Experts de jeunesse Global ».

Toutes les procédures dans le présent protocole ont été effectués avec l’approbation de l’animalier institutionnel et utilisation Comité (IACUC) de l’Institut National des Sciences biologiques, Pékin, conformément à la réglementation gouvernementale de la Chine.
1. construction du Reporter Cry1 Fluorescence
Remarque : Des études antérieures de rythme circadiens en utilisant le système de bioluminescence2,...

<ol>
	<li>Welsh, D. K., Takahashi, J. S., Kay, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suprachiasmatic+nucleus:+cell+autonomy+and+network+properties.">Suprachiasmatic nucleus: cell autonomy and network properties.</a> Annual Review of Physiology. 72, 551-577 (2010).</li><li>Zhang, E. E., Kay, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clocks+not+winding+down:+unravelling+circadian+networks.">Clocks not winding down: unravelling circadian networks.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11, 764-776 (2010).</li><li>Takahashi, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+architecture+of+the+mammalian+circadian+clock.">Transcriptional architecture of the mammalian circadian clock.</a> Nature Reviews Genetics. 18, 164-179 (2017).</li><li>Yoo, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PERIOD2::LUCIFERASE+real-time+reporting+of+circadian+dynamics+reveals+persistent+circadian+oscillations+in+mouse+peripheral+tissues.">PERIOD2::LUCIFERASE real-time reporting of circadian dynamics reveals persistent circadian oscillations in mouse peripheral tissues.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 101, 5339-5346 (2004).</li><li>Davidson, A. J., Castanon-Cervantes, O., Leise, T. L., Molyneux, P. C., Harrington, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+jet+lag+in+the+mouse+suprachiasmatic+nucleus+and+peripheral+circadian+timing+system.">Visualizing jet lag in the mouse suprachiasmatic nucleus and peripheral circadian timing system.</a> European Journal of Neuroscience. 29, 171-180 (2009).</li><li>Savelyev, S. A., Larsson, K. C., Johansson, A. S., Lundkvist, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slice+preparation,+organotypic+tissue+culturing+and+luciferase+recording+of+clock+gene+activity+in+the+suprachiasmatic+nucleus.">Slice preparation, organotypic tissue culturing and luciferase recording of clock gene activity in the suprachiasmatic nucleus.</a> Journal of Visualized Experiments. (48), (2011).</li><li>Yamaguchi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression:+View+of+a+mouse+clock+gene+ticking.">Gene expression: View of a mouse clock gene ticking.</a> Nature. 409, 684-684 (2001).</li><li>Ono, D., Honma, K. I., Honma, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+and+ultradian+rhythms+of+clock+gene+expression+in+the+suprachiasmatic+nucleus+of+freely+moving+mice.">Circadian and ultradian rhythms of clock gene expression in the suprachiasmatic nucleus of freely moving mice.</a> Science Reports. 5, 12310 (2015).</li><li>Ono, D., Honma, S., Honma, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+PER2::LUC+rhythms+in+the+olfactory+bulb+of+freely+moving+mice+depend+on+the+suprachiasmatic+nucleus+but+not+on+behaviour+rhythms.">Circadian PER2::LUC rhythms in the olfactory bulb of freely moving mice depend on the suprachiasmatic nucleus but not on behaviour rhythms.</a> European Journal of Neuroscience. 42, 3128-3137 (2015).</li><li>Ono, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissociation+of+Per1+and+Bmal1+circadian+rhythms+in+the+suprachiasmatic+nucleus+in+parallel+with+behavioral+outputs.">Dissociation of Per1 and Bmal1 circadian rhythms in the suprachiasmatic nucleus in parallel with behavioral outputs.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 114, E3699-E3708 (2017).</li><li>Reppert, S. M., Weaver, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordination+of+circadian+timing+in+mammals.">Coordination of circadian timing in mammals.</a> Nature. 418, 935-941 (2002).</li><li>Liu, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redundant+function+of+REV-ERBalpha+and+beta+and+non-essential+role+for+Bmal1+cycling+in+transcriptional+regulation+of+intracellular+circadian+rhythms.">Redundant function of REV-ERBalpha and beta and non-essential role for Bmal1 cycling in transcriptional regulation of intracellular circadian rhythms.</a> PLoS Genetics. 4, e1000023 (2008).</li><li>Maywood, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+core+circadian+feedback+loop+in+suprachiasmatic+nucleus+of+mCry1-luc+transgenic+reporter+mouse.">Analysis of core circadian feedback loop in suprachiasmatic nucleus of mCry1-luc transgenic reporter mouse.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110, 9547-9552 (2013).</li><li>Ukai-Tadenuma, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delay+in+feedback+repression+by+cryptochrome+1+is+required+for+circadian+clock+function.">Delay in feedback repression by cryptochrome 1 is required for circadian clock function.</a> Cell. 144, 268-281 (2011).</li><li>McClure, C., Cole, K. L., Wulff, P., Klugmann, M., Murray, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+titering+of+recombinant+adeno-associated+viral+vectors.">Production and titering of recombinant adeno-associated viral vectors.</a> Journal of Visualized Experiments. 57, e3348 (2011).</li><li>Yamaguchi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mice+genetically+deficient+in+vasopressin+V1a+and+V1b+receptors+are+resistant+to+jet+lag.">Mice genetically deficient in vasopressin V1a and V1b receptors are resistant to jet lag.</a> Science. 342, 85-90 (2013).</li><li>Nagano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+abrupt+shift+in+the+day/night+cycle+causes+desynchrony+in+the+mammalian+circadian+center.">An abrupt shift in the day/night cycle causes desynchrony in the mammalian circadian center.</a> Journal of Neuroscience. 23, 6141-6151 (2003).</li><li>Golombek, D. A., Rosenstein, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiology+of+Circadian+Entrainment.">Physiology of Circadian Entrainment.</a> Physiological Reviews. 90, 1063-1102 (2010).</li><li>Mei, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+in+vivo+recording+of+circadian+rhythms+in+brains+of+freely+moving+mice.">Long-term in vivo recording of circadian rhythms in brains of freely moving mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 115, 4276-4281 (2018).</li></ol>

Contrairement à l’ex vivo des méthodes, telles que la tranche culture4,5, RT-PCR16et in situ hybridation17, qui exigent que les animaux soient tuées, l' in vivo enregistrement méthode permet chercheurs pour étudier l’expression des gènes circadiens chez un animal vivant. Ainsi, cette technologie offre la possibilité d’évaluer l’effet des différentes perturbations physiques...

Chez les mammifères, le noyau suprachiasmatique (SCN) régit les rythme circadien de l’organisme entier pour coordonner la réponse de l’individu à exogène de changements environnementaux (p. ex., lumière, température, stress, etc.)1. Composants d’horloge de base se composent de PAR1-3, 2-Cry1, horlogeet Bmal1et jouent un rôle central dans la régulation de l’horloge circadienne de chaque cellule. Chaque cellule dans le SCN contient l’activateur de la transcription, horloge/BMAL1, qui agit comme un hétérodimère pour induire l’expression de PER et CRY. Le PER / CRY complexe inhibe alors la fonction d’horloge/BMAL1 pour former une boucle de rétroaction de transcription-traduction qui prend environ 24h au complet2,3.
Des études antérieures sur le RCS ont principalement employé l’ex vivo SCN tranche culture méthode4,5,6 et, bien que cette approche a fourni des renseignements précieux, ses limites ont entravé notre capacité à obtenir des données concernant l’influence des autres noyaux du cerveau sur le RCS, ainsi que l’effet de stimuli exogènes (par exemple, lumière) sur cellules résidant dans cette région critique. En 2001, groupe de Hitoshi Okamura fut le premier à utiliser le système de bioluminescence de l’expression génique in vivo moniteur horloge circadienne dans le SCN en se déplaçant librement souris7. Groupe de Ken-ichi Honma a passé les dernières années développer davantage la bioluminescence in vivo système d’enregistrement dans le SCN8,9,10. Ensemble, ces études ont fourni des chercheurs avec la possibilité de surveiller l’horloge circadienne dans l’obscurité totale ou après une impulsion de lumière. Cependant, parce que la bioluminescence est trop faible pour permettre une surveillance continue durant le cycle de lumière/obscurité, associée au fait que la lumière est le signal prédominant requis pour l’entraînement de SCN-mediated des horloges circadiennes11, il est demande croissante pour le développement de méthodes expérimentales qui surmonter les limitations associées à enregistrement de bioluminescence. Le présent rapport décrit un système basés sur la fluorescence qui a été construit pour surveiller l’horloge circadienne du SCN en vivo en se déplaçant librement des souris. Cette méthode facile à utiliser permet une surveillance continue durant le cycle de lumière/obscurité et permet l’observation à long terme de la transcription des gènes de l’horloge circadienne dans le SCN en temps réel et à haute résolution temporelle.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1408px;" width="1408">
	<tbody>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:627px;">KOD Plus Neo</td>
			<td style="width:403px;">TOYOBO</td>
			<td style="width:133px;">KOD-401</td>
			<td style="width:245px;">Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">pVENUS-N1</td>
			<td>addgene</td>
			<td>#61854</td>
			<td>Plasmid</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">pcDNA3.3_d2eGFP</td>
			<td>addgene</td>
			<td>#26821</td>
			<td>Plasmid</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">pAAV-EF1a-double floxed-hChR2(H134R)-mCherry-WPRE-HGHpA</td>
			<td>addgene</td>
			<td>#20297</td>
			<td>Plasmid</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">MluI</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>FD0564</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">EcoRI</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>FD0274</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Gibson Assembly Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E2611s</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Lipofectamine 2000</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12566014</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Syringe Filter</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>SLHV033RS</td>
			<td>0.45&#160;&#181;m&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">HiTrap heparin columns</td>
			<td>gelifesciences</td>
			<td>17-0406-01</td>
			<td>1 mL&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Amicon ultra-4 centrifugal filter</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>&#160;UFC810024</td>
			<td>100,000 MWCO</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Benzonase nuclease</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E1014</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5670</td>
			<td>Make fresh solution for each batch</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">mouse stereotaxic apparatus</td>
			<td>B&#38;E TEKSYSTEMS LTD</td>
			<td>#SR-5M/6M</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">pentobarbital</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>#1507002</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">mouse stereotaxic apparatus</td>
			<td>B&#38;E TEKSYSTEMS LTD</td>
			<td>#SR-5M/6M</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Hydrogen peroxide solution</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>#216763</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Optical Fiber</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>FT200EMT</td>
			<td>0.39 NA, &#216;200 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">microsyringe pump</td>
			<td>Nanoliter 2000 Injector, WPI</td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">ceramic ferrule</td>
			<td>Shanghai Fiblaser</td>
			<td></td>
			<td>230&#8201;&#956;m I.D., 2.5 mm O.D.</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Gene Observer</td>
			<td>BiolinkOptics</td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo monitoring of circadian clock gene expression in the mouse suprachiasmatic nucleus using fluorescence reporters

Cette technique combine fibre optique médiée par fluorescence enregistrements avec la livraison précise de reporters de gène recombinant virus adeno-associé basé. Cet nouvelle et facile à utiliser en vivo fluorescence surveillance système a été développé pour enregistrer le rythme transcriptionnel du gène de l’horloge, Cry1, dans le noyau suprachiasmatique (SCN) de déplacer librement les souris. Pour ce faire, un journaliste de fluorescence de transcription Cry1 a été conçu et emballé en virus Adeno-associé. Purifié, concentré de virus a été injecté dans la SCN, suivie de l’introduction d’une fibre optique, qui a été ensuite fixée sur la surface du cerveau de la souris. Les animaux ont été retournés à leurs cages maison et jouir d’un délai de 1 mois de convalescence postopératoire assurer suffisamment expression du Rapporteur. Fluorescence a été enregistré puis en se déplaçant librement souris via un en vivo surveillance système qui a été construit dans notre établissement. Pour l' en vivo système d’enregistrement, un laser à 488 nm a été couplé avec un 1 × 4-séparateur de faisceau qui divise la lumière en quatre sorties d’excitation de laser de puissance égale. Cette configuration a permis d’enregistrer simultanément des quatre animaux. Chacun des signaux émis par fluorescence ont été recueillie via un tube photomultiplicateur et une carte d’acquisition de données. En revanche à la précédente bioluminescence in vivo horloge circadienne technique d’enregistrement, cette fluorescence in vivo système d’enregistrement permet l’enregistrement de l’expression génique horloge circadienne pendant le cycle de lumière.

Fluorescence journaliste Cry1 était Voir la Figure1 a. En utilisant l’approche détaillée ci-dessus, 500 nL du rAAV-P (Cry1) - intron336 - Venus-NLS-D2 a été injecté avec succès dans le SCN d’une souris adulte et exposé expression robuste de Vénus (Figure 1 b, 1C). Les signaux de fluorescence enregistrés dans des conditions de foncé/dark (DD) (Figure 2...

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In Vivo Monitoring of Circadian Clock Gene Expression in the Mouse Suprachiasmatic Nucleus Using Fluorescence Reporters

Cette technologie nouvellement développée basés sur la fluorescence permet une surveillance à long terme de la transcription des gènes de l’horloge circadienne dans le noyau suprachiasmatique (SCN) de se déplaçant librement les souris en temps réel et à une haute résolution temporelle.

In Vivo Suivi de l’Expression génique horloge circadienne dans le noyau suprachiasmatique de souris à l’aide de Reporters de Fluorescence

This technique combines optical fiber mediated fluorescence recordings with the precise delivery of recombinant adeno-associated virus based gene ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In Vivo Monitoring of Circadian Clock Gene Expression in the Mouse Suprachiasmatic Nucleus Using Fluorescence Reporters

Slice Preparation, Organotypic Tissue Culturing and Luciferase Recording of Clock Gene Activity in the Suprachiasmatic Nucleus

Préparation Trancher, culture de tissus organotypiques et enregistrement de la luciférase de l&#39;activité des gènes d&#39;horloge dans le noyau suprachiasmatique

A central circadian (~24 hr) clock coordinating daily rhythms in physiology and behavior resides in the suprachiasmatic nucleus (SCN) located in the ...

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