Name: in vivo monitoring of circadian clock gene expression in the mouse suprachiasmatic nucleus using fluorescence reporters
Uploaded: 2018-07-04T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Monitoring of Circadian Clock Gene Expression in the Mouse Suprachiasmatic Nucleus Using Fluorescence Reporters at JoVE.com

Мы благодарим членов в Чжан лаборатории для обеспечения стимулирования обсуждений и членов в Чжань лаборатории для оказания технической помощи. Это исследование было поддержано грантов 31500860 (чтобы циркон) NSFC, 2012CB837700 (для E.E.Z. и циркон) 973 программы от M.O.S.T. Китая и финансирование от Пекина муниципального правительства. E.E.Z. было поддержано китайской «Программа набора глобальных молодежных экспертов».

Все процедуры в этом протоколе были проведены с одобрения институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC) Национальный институт биологических наук, Пекин, в соответствии с положениями правительства Китая.
1. Строительство Cry1 флуоресценции репортер
<p ...

<ol>
	<li>Welsh, D. K., Takahashi, J. S., Kay, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suprachiasmatic+nucleus:+cell+autonomy+and+network+properties.">Suprachiasmatic nucleus: cell autonomy and network properties.</a> Annual Review of Physiology. 72, 551-577 (2010).</li><li>Zhang, E. E., Kay, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clocks+not+winding+down:+unravelling+circadian+networks.">Clocks not winding down: unravelling circadian networks.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11, 764-776 (2010).</li><li>Takahashi, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+architecture+of+the+mammalian+circadian+clock.">Transcriptional architecture of the mammalian circadian clock.</a> Nature Reviews Genetics. 18, 164-179 (2017).</li><li>Yoo, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PERIOD2::LUCIFERASE+real-time+reporting+of+circadian+dynamics+reveals+persistent+circadian+oscillations+in+mouse+peripheral+tissues.">PERIOD2::LUCIFERASE real-time reporting of circadian dynamics reveals persistent circadian oscillations in mouse peripheral tissues.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 101, 5339-5346 (2004).</li><li>Davidson, A. J., Castanon-Cervantes, O., Leise, T. L., Molyneux, P. C., Harrington, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+jet+lag+in+the+mouse+suprachiasmatic+nucleus+and+peripheral+circadian+timing+system.">Visualizing jet lag in the mouse suprachiasmatic nucleus and peripheral circadian timing system.</a> European Journal of Neuroscience. 29, 171-180 (2009).</li><li>Savelyev, S. A., Larsson, K. C., Johansson, A. S., Lundkvist, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slice+preparation,+organotypic+tissue+culturing+and+luciferase+recording+of+clock+gene+activity+in+the+suprachiasmatic+nucleus.">Slice preparation, organotypic tissue culturing and luciferase recording of clock gene activity in the suprachiasmatic nucleus.</a> Journal of Visualized Experiments. (48), (2011).</li><li>Yamaguchi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression:+View+of+a+mouse+clock+gene+ticking.">Gene expression: View of a mouse clock gene ticking.</a> Nature. 409, 684-684 (2001).</li><li>Ono, D., Honma, K. I., Honma, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+and+ultradian+rhythms+of+clock+gene+expression+in+the+suprachiasmatic+nucleus+of+freely+moving+mice.">Circadian and ultradian rhythms of clock gene expression in the suprachiasmatic nucleus of freely moving mice.</a> Science Reports. 5, 12310 (2015).</li><li>Ono, D., Honma, S., Honma, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+PER2::LUC+rhythms+in+the+olfactory+bulb+of+freely+moving+mice+depend+on+the+suprachiasmatic+nucleus+but+not+on+behaviour+rhythms.">Circadian PER2::LUC rhythms in the olfactory bulb of freely moving mice depend on the suprachiasmatic nucleus but not on behaviour rhythms.</a> European Journal of Neuroscience. 42, 3128-3137 (2015).</li><li>Ono, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissociation+of+Per1+and+Bmal1+circadian+rhythms+in+the+suprachiasmatic+nucleus+in+parallel+with+behavioral+outputs.">Dissociation of Per1 and Bmal1 circadian rhythms in the suprachiasmatic nucleus in parallel with behavioral outputs.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 114, E3699-E3708 (2017).</li><li>Reppert, S. M., Weaver, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordination+of+circadian+timing+in+mammals.">Coordination of circadian timing in mammals.</a> Nature. 418, 935-941 (2002).</li><li>Liu, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redundant+function+of+REV-ERBalpha+and+beta+and+non-essential+role+for+Bmal1+cycling+in+transcriptional+regulation+of+intracellular+circadian+rhythms.">Redundant function of REV-ERBalpha and beta and non-essential role for Bmal1 cycling in transcriptional regulation of intracellular circadian rhythms.</a> PLoS Genetics. 4, e1000023 (2008).</li><li>Maywood, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+core+circadian+feedback+loop+in+suprachiasmatic+nucleus+of+mCry1-luc+transgenic+reporter+mouse.">Analysis of core circadian feedback loop in suprachiasmatic nucleus of mCry1-luc transgenic reporter mouse.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110, 9547-9552 (2013).</li><li>Ukai-Tadenuma, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delay+in+feedback+repression+by+cryptochrome+1+is+required+for+circadian+clock+function.">Delay in feedback repression by cryptochrome 1 is required for circadian clock function.</a> Cell. 144, 268-281 (2011).</li><li>McClure, C., Cole, K. L., Wulff, P., Klugmann, M., Murray, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+titering+of+recombinant+adeno-associated+viral+vectors.">Production and titering of recombinant adeno-associated viral vectors.</a> Journal of Visualized Experiments. 57, e3348 (2011).</li><li>Yamaguchi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mice+genetically+deficient+in+vasopressin+V1a+and+V1b+receptors+are+resistant+to+jet+lag.">Mice genetically deficient in vasopressin V1a and V1b receptors are resistant to jet lag.</a> Science. 342, 85-90 (2013).</li><li>Nagano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+abrupt+shift+in+the+day/night+cycle+causes+desynchrony+in+the+mammalian+circadian+center.">An abrupt shift in the day/night cycle causes desynchrony in the mammalian circadian center.</a> Journal of Neuroscience. 23, 6141-6151 (2003).</li><li>Golombek, D. A., Rosenstein, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiology+of+Circadian+Entrainment.">Physiology of Circadian Entrainment.</a> Physiological Reviews. 90, 1063-1102 (2010).</li><li>Mei, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+in+vivo+recording+of+circadian+rhythms+in+brains+of+freely+moving+mice.">Long-term in vivo recording of circadian rhythms in brains of freely moving mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 115, 4276-4281 (2018).</li></ol>

В отличие от ex vivo методы, такие, как кусок культуры4,5, RT-PCR16и в situ гибридизация17, которые требуют убитых животных, в естественных условиях записи метод позволяет следователей для изучения экспрессии генов суточного ...

В млекопитающих Супрахиазмальное ядро (SCN) регулирует суточный ритм всего тела для координации реагирования индивида на экзогенных экологических изменений (например, свет, температура, напряжение и т.д.)1. Основные компоненты часы состоят из Per1-3, Cry1-2, будильники Bmal1и играть центральную роль в регулировании суточного часов каждой ячейки. Каждая ячейка в ППП содержит transcriptional активатор, часы/BMAL1, который действует как гетеродимера побудить выражение % и ПЛАКАТЬ. PER / CRY комплекс затем угнетает функции часы/BMAL1 для формирования обратной транскрипции перевод, что занимает около 24 ч до полного2,3.
Предыдущие исследования на СКС главным образом использовали ex vivo SCN ломтик культуры метод4,5,6 , и, хотя этот подход предоставляет ценную информацию, ее ограничения препятствуют нашей способности получение данных относительно влияния других ядер головного мозга на СКС, а также воздействия внешних раздражителей (например, свет) на клетки, проживающих в этой критической области. В 2001 году Хитоси Окамура группы был первым для использования системы биолюминесценции в vivo экспрессии генов монитор суточного часов в ППП в свободно перемещающихся мышей7. Кен ити Хонма группы провел за последние несколько лет, развивая биолюминесценции в vivo система записи в SCN8,9,10. Вместе эти исследования предоставили исследователям возможность контролировать суточного часов в постоянной темноты или после светового импульса. Однако потому что биолюминесценция слишком тусклыми, чтобы обеспечить непрерывный мониторинг во время цикла свет/темно, в сочетании с тем фактом, что свет является преобладающим сигнал, необходимые для СКС опосредованной уноса суточного часы11, есть растущий спрос на разработки экспериментальных методов, которые преодолеть ограничения, связанные с записью биолюминесценции. Текущий отчет описывает флуоресценции балльной системе, которая была построена для мониторинга суточного часов ППП в естественных условиях в свободно перемещающихся мышей. Этот простой в использовании метод позволяет непрерывный мониторинг во время цикла свет/темно и позволяет для долгосрочного наблюдения транскрипцию генов суточного часов в ППП в режиме реального времени и с высоким временным разрешением.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1408px;" width="1408">
	<tbody>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:627px;">KOD Plus Neo</td>
			<td style="width:403px;">TOYOBO</td>
			<td style="width:133px;">KOD-401</td>
			<td style="width:245px;">Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">pVENUS-N1</td>
			<td>addgene</td>
			<td>#61854</td>
			<td>Plasmid</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">pcDNA3.3_d2eGFP</td>
			<td>addgene</td>
			<td>#26821</td>
			<td>Plasmid</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">pAAV-EF1a-double floxed-hChR2(H134R)-mCherry-WPRE-HGHpA</td>
			<td>addgene</td>
			<td>#20297</td>
			<td>Plasmid</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">MluI</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>FD0564</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">EcoRI</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>FD0274</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Gibson Assembly Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E2611s</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Lipofectamine 2000</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12566014</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Syringe Filter</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>SLHV033RS</td>
			<td>0.45&#160;&#181;m&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">HiTrap heparin columns</td>
			<td>gelifesciences</td>
			<td>17-0406-01</td>
			<td>1 mL&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Amicon ultra-4 centrifugal filter</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>&#160;UFC810024</td>
			<td>100,000 MWCO</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Benzonase nuclease</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E1014</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5670</td>
			<td>Make fresh solution for each batch</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">mouse stereotaxic apparatus</td>
			<td>B&#38;E TEKSYSTEMS LTD</td>
			<td>#SR-5M/6M</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">pentobarbital</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>#1507002</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">mouse stereotaxic apparatus</td>
			<td>B&#38;E TEKSYSTEMS LTD</td>
			<td>#SR-5M/6M</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Hydrogen peroxide solution</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>#216763</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Optical Fiber</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>FT200EMT</td>
			<td>0.39 NA, &#216;200 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">microsyringe pump</td>
			<td>Nanoliter 2000 Injector, WPI</td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">ceramic ferrule</td>
			<td>Shanghai Fiblaser</td>
			<td></td>
			<td>230&#8201;&#956;m I.D., 2.5 mm O.D.</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Gene Observer</td>
			<td>BiolinkOptics</td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo monitoring of circadian clock gene expression in the mouse suprachiasmatic nucleus using fluorescence reporters

Этот метод сочетает в себе опосредованного волоконно-оптических флуоресценции записей с точной доставки рекомбинантных аденоассоциированный вирус на основе гена репортеров. Этот новый и простой в использовании в vivo флюоресценция системы мониторинга была разработана для записи transcriptional ритм часы гена, Cry1, в Супрахиазмальное ядро (SCN), свободно движущихся мышей. Чтобы сделать это, репортер флуоресценции транскрипции Cry1 был разработан и упакованы в аденоассоциированный вирус. Очищенных, концентрированных вирус был введен в ППП, следуют вставки оптического волокна, который затем был установлен на поверхности мозга мыши. Животные были возвращены их дома клетки и позволило послеоперационное восстановление 1-месячный период для обеспечения достаточной репортер выражение. Флуоресценции затем был записан в свободно перемещающихся мышей через в vivo система мониторинга, которая была построена в нашем заведении. В естественных условиях система записи 488 нм лазер был увязан с 1 × 4-splitter луча, разделить четыре лазерного возбуждения выходы равной силы света. Эта установка позволила нам запись из четырех животных одновременно. Каждый из сигналов испускаемого флуоресценции была собрана через трубу фотоэлектронный умножитель и сбор данных карты. В отличие от предыдущих биолюминесценции в естественных условиях технике суточного часов записи, этот флуоресценции в vivo система записи допускается запись выражения гена суточного часов во время свет цикла.

Флуоресценции репортер дизайн Cry1 был Показать на рисунке 1A. Используя подход подробно говорилось выше, 500 nL rAAV-P (Cry1) - intron336 - Венера-NLS-D2 был успешно введен в SCN взрослой мыши и выставлены надежные Венера выражение (рис. 1B, 1 C</str...

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Monitoring of Circadian Clock Gene Expression in the Mouse Suprachiasmatic Nucleus Using Fluorescence Reporters at JoVE.com

In Vivo Monitoring of Circadian Clock Gene Expression in the Mouse Suprachiasmatic Nucleus Using Fluorescence Reporters

Этот недавно разработанный на основе флуоресценции технология позволяет долгосрочный мониторинг транскрипцию генов суточного часов в Супрахиазмальное ядро (SCN) свободно перемещения мыши в режиме реального времени и с высоким временным разрешением.

В естественных условиях Мониторинг суточного часов экспрессии генов в мыши Супрахиазмальное ядро с помощью флуоресценции Репортеры

This technique combines optical fiber mediated fluorescence recordings with the precise delivery of recombinant adeno-associated virus based gene ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In Vivo Monitoring of Circadian Clock Gene Expression in the Mouse Suprachiasmatic Nucleus Using Fluorescence Reporters

Slice Preparation, Organotypic Tissue Culturing and Luciferase Recording of Clock Gene Activity in the Suprachiasmatic Nucleus

Подготовка фрагментов, органотипической культивирования тканей и люциферазы Запись часы активность генов в супрахиазматическое ядро

A central circadian (~24 hr) clock coordinating daily rhythms in physiology and behavior resides in the suprachiasmatic nucleus (SCN) located in the ...

Spinal Cord Electrophysiology II: Extracellular Suction Electrode Fabrication

Спинной мозг электрофизиологии II: внеклеточной изготовление электродов Всасывающая

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate ...

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Трансфекция Мышь ганглиозных клеток сетчатки при В естественных условиях Электропорация

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling  |

Номера для лазерной микроскопии Захват подход к микродиссекция дискретных областей мозга мыши для полной изоляции РНК и переработки нового поколения Секвенирование и профилирование экспрессии генов

As technological platforms, approaches such as next-generation sequencing, microarray, and qRT-PCR have great promise for expanding our understanding of ...

High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium

Высокое разрешение изображений Онлайн-клеточной поведения в развивающихся нейроэпителия

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Функциональные нейровизуализации с использованием ультразвуковых Гематоэнцефалический Разрушение барьеров и марганца-МРТ

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Recording and Analysis of Circadian Rhythms in Running-wheel Activity in Rodents

Запись и анализ циркадных ритмов в рабочем колеса деятельность в Грызуны

When rodents have free access to a running wheel in their home cage, voluntary use of this wheel will depend on the time of day1-5. Nocturnal rodents, ...

Micromanipulation of Gene Expression in the Adult Zebrafish Brain Using Cerebroventricular Microinjection of Morpholino Oligonucleotides

Микроманипуляция экспрессии генов в головном мозге взрослых данио рерио Использование церебровентрикулярных Микроинъекции олигонуклеотиды Морфолино

Manipulation of gene expression in tissues is  required to perform functional studies. In this paper, we demonstrate the  cerebroventricular ...

Simultaneous Electrophysiological Recording and Calcium Imaging of Suprachiasmatic Nucleus Neurons

Одновременное электрофизиологические записи и Кальций изображений супрахиазматического ядра нейронов

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in ...

Analysis of Gene Expression Changes in the Rat Hippocampus After Deep Brain Stimulation of the Anterior Thalamic Nucleus

Анализ изменений экспрессии генов в гиппокампе крыс после глубокого мозга стимуляции передней ядра таламуса

Deep brain stimulation (DBS) surgery, targeting various regions of the brain such as the basal ganglia, thalamus, and subthalamic regions, is an effective ...