Name: a quantitative dot blot assay for aav titration and its use for functional assessment of the adeno-associated virus assembly-activating proteins
Uploaded: 2018-06-12T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Quantitative Dot Blot Assay for AAV Titration and Its Use for Functional Assessment of the Adeno-associated Virus Assembly-activating Proteins at JoVE.com

हम हम pEMBL-सीएमवी-GFP प्लाज्मिड के साथ प्रदान करने के लिए चैपल हिल पर उत्तरी केरोलिना विश्वविद्यालय में जिओ जिओ धंयवाद । हम क्रिस्टोफर चेंग और शमूएल जे हुआंग पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए धंयवाद । इस कार्य को जन स्वास्थ्य सेवा अनुदान (NIH R01 NS088399 एण्ड T32 EY232113) द्वारा समर्थन दिया गया ।

नोट: इस प्रोटोकॉल के लिए आवश्यक समाधानों और बफ़र्स के लिए व्यंजन तालिका 1में प्रदान किए गए हैं । नीचे वर्णित प्रोटोकॉल उपाध्यक्ष के लिए है-aap पार पूरकता डॉट ब्लाटर परख के लिए कैप्सिड विधानसभा में aa...

<ol>
	<li>Sonntag, F., Schmidt, K., Kleinschmidt, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+viral+assembly+factor+promotes+AAV2+capsid+formation+in+the+nucleolus.">A viral assembly factor promotes AAV2 capsid formation in the nucleolus.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (22), 10220-10225 (2010).</li><li>Sonntag, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+assembly-activating+protein+promotes+capsid+assembly+of+different+adeno-associated+virus+serotypes.">The assembly-activating protein promotes capsid assembly of different adeno-associated virus serotypes.</a> J Virol. 85 (23), 12686-12697 (2011).</li><li>Naumer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+the+adeno-associated+virus+assembly-activating+protein.">Properties of the adeno-associated virus assembly-activating protein.</a> J Virol. 86 (23), 13038-13048 (2012).</li><li>Earley, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+nuclear+and+nucleolar+localization+signals+in+the+adeno-associated+virus+serotype+2+assembly-activating+protein.">Identification and characterization of nuclear and nucleolar localization signals in the adeno-associated virus serotype 2 assembly-activating protein.</a> J Virol. 89 (6), 3038-3048 (2015).</li><li>Kawano, Y., Neeley, S., Adachi, K., Nakai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+experimental+and+computational+evolution-based+method+to+study+a+mode+of+co-evolution+of+overlapping+open+reading+frames+in+the+AAV2+viral+genome.">An experimental and computational evolution-based method to study a mode of co-evolution of overlapping open reading frames in the AAV2 viral genome.</a> PLoS One. 8 (6), e66211 (2013).</li><li>Earley, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+Virus+(AAV)+Assembly-Activating+Protein+Is+Not+an+Essential+Requirement+for+Capsid+Assembly+of+AAV+Serotypes+4,+5,+and+11.">Adeno-associated Virus (AAV) Assembly-Activating Protein Is Not an Essential Requirement for Capsid Assembly of AAV Serotypes 4, 5, and 11.</a> J Virol. 91 (3), (2017).</li><li>Aurnhammer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+real-time+PCR+for+the+detection+and+quantification+of+adeno-associated+virus+serotype+2-derived+inverted+terminal+repeat+sequences.">Universal real-time PCR for the detection and quantification of adeno-associated virus serotype 2-derived inverted terminal repeat sequences.</a> Hum Gene Ther Methods. 23 (1), 18-28 (2012).</li><li>Clark, K. R., Liu, X., McGrath, J. P., Johnson, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+purified+recombinant+adeno-associated+virus+vectors+are+biologically+active+and+free+of+detectable+helper+and+wild-type+viruses.">Highly purified recombinant adeno-associated virus vectors are biologically active and free of detectable helper and wild-type viruses.</a> Hum Gene Ther. 10 (6), 1031-1039 (1999).</li><li>Samulski, R. J., Chang, L. S., Shenk, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helper-free+stocks+of+recombinant+adeno-associated+viruses:+normal+integration+does+not+require+viral+gene+expression.">Helper-free stocks of recombinant adeno-associated viruses: normal integration does not require viral gene expression.</a> J Virol. 63 (9), 3822-3828 (1989).</li><li>Wobus, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibodies+against+the+adeno-associated+virus+type+2+(AAV-2)+capsid:+epitope+mapping+and+identification+of+capsid+domains+involved+in+AAV-2-cell+interaction+and+neutralization+of+AAV-2+infection.">Monoclonal antibodies against the adeno-associated virus type 2 (AAV-2) capsid: epitope mapping and identification of capsid domains involved in AAV-2-cell interaction and neutralization of AAV-2 infection.</a> J Virol. 74 (19), 9281-9293 (2000).</li><li>Grimm, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Titration+of+AAV-2+particles+via+a+novel+capsid+ELISA:+packaging+of+genomes+can+limit+production+of+recombinant+AAV-2.">Titration of AAV-2 particles via a novel capsid ELISA: packaging of genomes can limit production of recombinant AAV-2.</a> Gene Ther. 6 (7), 1322-1330 (1999).</li><li>Sommer, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+adeno-associated+virus+particles+and+empty+capsids+by+optical+density+measurement.">Quantification of adeno-associated virus particles and empty capsids by optical density measurement.</a> Mol Ther. 7 (1), 122-128 (2003).</li><li>Fagone, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+errors+in+quantitative+polymerase+chain+reaction+titration+of+self-complementary+adeno-associated+viral+vectors+and+improved+alternative+methods.">Systemic errors in quantitative polymerase chain reaction titration of self-complementary adeno-associated viral vectors and improved alternative methods.</a> Hum Gene Ther Methods. 23 (1), 1-7 (2012).</li><li>Farkas, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+parvovirus+isolated+from+royal+python+(Python+regius)+is+a+member+of+the+genus+Dependovirus.">A parvovirus isolated from royal python (Python regius) is a member of the genus Dependovirus.</a> J Gen Virol. 85 (Pt 3), 555-561 (2004).</li><li>NEB, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> 2017-2018 Catalog &amp; Technical Reference. , 302-368 (2017).</li><li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular cloning: a laboratory manual. , (2012).</li><li>. Bacterial Transformation Available from: <a target="_blank" href="https://www.addgene.org/protocols/bacterial-transformation/">https://www.addgene.org/protocols/bacterial-transformation/</a> (2017)</li><li>. Sequence Analysis of your Addgene Plasmid Available from: <a target="_blank" href="https://www.addgene.org/recipient-instructions/sequence-analysis/">https://www.addgene.org/recipient-instructions/sequence-analysis/</a> (2017)</li><li>Burton, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coexpression+of+factor+VIII+heavy+and+light+chain+adeno-associated+viral+vectors+produces+biologically+active+protein.">Coexpression of factor VIII heavy and light chain adeno-associated viral vectors produces biologically active protein.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (22), 12725-12730 (1999).</li><li>Grimm, D., Pandey, K., Kay, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+vectors+for+short+hairpin+RNA+expression.">Adeno-associated virus vectors for short hairpin RNA expression.</a> Methods Enzymol. 392, 381-405 (2005).</li><li>Leonard, J. N., Ferstl, P., Delgado, A., Schaffer, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+preparation+of+adeno-associated+viral+vectors+by+using+high+hydrostatic+pressure+to+selectively+inactivate+helper+adenovirus.">Enhanced preparation of adeno-associated viral vectors by using high hydrostatic pressure to selectively inactivate helper adenovirus.</a> Biotechnol Bioeng. 97 (5), 1170-1179 (2007).</li><li>Lock, M., Alvira, M. R., Chen, S. J., Wilson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absolute+determination+of+single-stranded+and+self-complementary+adeno-associated+viral+vector+genome+titers+by+droplet+digital+PCR.">Absolute determination of single-stranded and self-complementary adeno-associated viral vector genome titers by droplet digital PCR.</a> Hum Gene Ther Methods. 25 (2), 115-125 (2014).</li><li>Werling, N. J., Satkunanathan, S., Thorpe, R., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+Comparison+and+Validation+of+Quantitative+Real-Time+PCR+Methods+for+the+Quantitation+of+Adeno-Associated+Viral+Products.">Systematic Comparison and Validation of Quantitative Real-Time PCR Methods for the Quantitation of Adeno-Associated Viral Products.</a> Hum Gene Ther Methods. 26 (3), 82-92 (2015).</li><li>Kafatos, F. C., Jones, C. W., Efstratiadis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+nucleic+acid+sequence+homologies+and+relative+concentrations+by+a+dot+hybridization+procedure.">Determination of nucleic acid sequence homologies and relative concentrations by a dot hybridization procedure.</a> Nucleic Acids Res. 7 (6), 1541-1552 (1979).</li><li>Reue, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+quantitation+techniques:+considerations+for+experimental+design+and+application.">mRNA quantitation techniques: considerations for experimental design and application.</a> J Nutr. 128 (11), 2038-2044 (1998).</li><li>Clementi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+PCR+and+RT-PCR+in+virology.">Quantitative PCR and RT-PCR in virology.</a> PCR Methods Appl. 2 (3), 191-196 (1993).</li><li>Mezzina, M., Merten, O. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+viruses.">Adeno-associated viruses.</a> Methods Mol Biol. 737, 211-234 (2011).</li><li>Chen, W. J., Liao, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+bovine+pancreatic+deoxyribonuclease+I.">Structure and function of bovine pancreatic deoxyribonuclease I.</a> Protein Pept Lett. 13 (5), 447-453 (2006).</li></ol>

इस रिपोर्ट में AAV AAPs का अध्ययन करने के लिए मात्रात्मक डॉट ब्लाट परख की उपयोगिता और कैप्सिड असेंबली में उनकी भूमिका का वर्णन किया गया है । इन अध्ययनों से प्राप्त ज्ञान AAV कैप्सिड विधानसभा की प्रक्रिया और व...

Adeno-एसोसिएटेड वायरस (AAV) लगभग ४.७ kilobases (केबी) के जीनोम के साथ एक छोटा, गैर-ढंक हुआ, सिंगल-कतरा हुआ डीएनए वायरस है । AAV जीनोम के प्रतिनिधि और टोपी जीन के लिए खुले पढ़ने फ्रेम (ORFs) शामिल हैं । २०१० में, एक पहले से अज्ञात गैर संरचनात्मक एक + 1 फ्रेम द्वारा इनकोडिंग प्रोटीन AAV2 कैप जीन के भीतर ओआरएफ स्थानांतरित Sonntag एट अल द्वारा की खोज की थी । और एक वायरल में AAV2 कैप्सिड वीपी मोनोमर प्रोटीन के विधानसभा में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा पाया कैप्सिड1. इस उपंयास प्रोटीन विधानसभा सक्रिय प्रोटीन का नाम दिया गया है (AAP) भूमिका के बाद यह कैप्सिड1विधानसभा को बढ़ावा देने में खेलता है ।
AAP के लिए ORFs जीनस Dependoparvovirusके भीतर सभी parvoviruses के जीनोम में bioinformatically की पहचान की गई है, लेकिन पीढ़ी परिवार के विभिन्न parvovirus के विषाणुओं के जीनोम के भीतर नहीं1,2. इस उपंयास प्रोटीन के कार्यात्मक अध्ययन शुरू में प्रोटोटाइप AAV2 (AAP2) है, जो अपने संचय और पूरी तरह से गठन के लिए nucleolus को जुदा वीपी प्रोटीन लक्ष्यीकरण में AAP2 की अनिवार्य भूमिका की स्थापना की है से AAP पर ध्यान केंद्रित किया गया इकट्ठे capsids१,३,४. AAP अभिव्यक्ति के अभाव में इकट्ठे होने की AAV2 capsids की अक्षमता को स्वतंत्र रूप से अनेक समूहों द्वारा पुष्ट किया गया है, जिनमें हमारा1,2,3,4,5 . AAV serotypes 1, 8, और 9 पर अनुवर्ती अध्ययन कैप्सिड विधानसभा में AAPs की महत्वपूर्ण भूमिका पुष्टि, VP3, 8, और 9 के मोनोमर AAV1 प्रोटीन के रूप में AAP2की सह-अभिव्यक्ति के अभाव में एक पूरी तरह से इकट्ठे कैप्सिड बनाने में असमर्थ थे.
हाल ही में, दृष्टिकोण है कि मात्रात्मक डॉट दाग परख के उपयोग को शामिल करने के माध्यम से, हम AAV1 की क्षमता की जांच की 12 VP3 मोनोमर को AAP अभिव्यक्ति के अभाव में capsids में इकट्ठे और AAP1 की क्षमता 12 से VP3 मोनोमर के विधानसभा को बढ़ावा देने के लिए heterologous serotypes. इस अध् ययन से पता चला है कि AAV4, 5, और 11 VP3 मोनोमर बिना AAP को असेंबल कर सकते हैं । इसके अतिरिक्त, यह पाया गया कि बारह AAP serotypes में से आठ हम (यानी, सभी लेकिन AAP4, 5, 11 और 12) की जांच की एक व्यापक क्षमता heterologous AAV सीरोटाइप capsids, जबकि AAP4, 5, 11 और 12 के कैप्सिड विधानसभा का समर्थन करने के लिए प्रदर्शित एक काफी इस संबंध में सीमित क्षमता6. ये चार serotypes दूसरे AAP serotypes2,3से phylogenetically दूर हैं. इसके अलावा, अध्ययन के विभिंन AAPs6के उपसेलुलर स्थानीयकरण में महत्वपूर्ण विविधता का पर्दाफाश किया है । इसके अलावा, अध्ययन का सुझाव दिया है कि capsids के साथ AAP के तंग एसोसिएशन और nucleolus, AAV2 कैप्सिड विधानसभा की पहचान, जरूरी serotypes, 8, और 9, जो AAV5 अपवर्जन प्रदर्शन सहित अंय nucleolar के लिए नहीं बढ़ाया जा सकता है इकट्ठे capsids6. इस प्रकार, किसी भी विशेष सीरोटाइप aap के अध्ययन से प्राप्त जानकारी मोटे तौर पर सभी aap बायोलॉजी पर लागू नहीं होती है. aap जीव विज्ञान की ऐसी puzzling प्रकृति प्रत्येक aap की भूमिका और कार्य दोनों से विहित और गैर-विहित AAV serotypes की जांच करने की आवश्यकता को रेखांकित करता है.
कैप्सिड असेंबली में aap की जैविक भूमिका का निर्धारण करके आकलन किया जा सकता है पूरी तरह से पैक AAV वायरल कण titers में उत्पादित मानव भ्रूण गुर्दे (HEK) २९३ कोशिकाओं, AAV वेक्टर उत्पादन के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल किया सेल लाइन, के साथ या बिना AAP प्रोटीन अभिव्यक्ति. AAV quantitation के लिए मानक तरीकों मात्रात्मक पीसीआर (qPCR)-परख7,8 और मात्रात्मक डॉट दाग-परख9आधारित हैं । AAV वायरल कण quantitation के लिए अन्य तरीकों जैसे एंजाइम से जुड़े immunosorbent परख10,11 या ऑप्टिकल घनत्व माप12 कई अलग AAV serotypes या नमूनों से व्युत्पंन नमूनों के लिए आदर्श नहीं हैं अशुद्धियों के साथ दूषित (क्रूड lysates या संस्कृति मीडिया), जो अक्सर AAV अनुसंधान के लिए इस्तेमाल किया नमूने हैं । वर्तमान में, qPCR सबसे व्यापक रूप से AAV quantitation के लिए प्रयोग किया जाता है; हालांकि, यह qPCR के संभावित निरंतर स्वीकार-परख आधारित आवश्यक है, के रूप में परख प्रणालीगत त्रुटियों और महत्वपूर्ण titer रूपांतरों में परिणाम कर सकते है13,14। पीसीआर आधारित परख संभावित कारकों की एक संख्या से प्रभावित हैं, ऐसी पीसीआर में covalently बंद टर्मिनल hairpins की उपस्थिति टेंपलेट्स कि13प्रवर्धन बाधित । यहां तक कि एक अनुभवी व्यक्ति एक qPCR में संभावित निराधार कारकों परिचय-परख अनजाने13आधारित कर सकते हैं । इसके विपरीत, मात्रात्मक डॉट दाग परख एक शास्त्रीय आणविक जीवविज्ञान तकनीक है कि जीनोम प्रवर्धन शामिल नहीं करता है और त्रुटियों का एक ंयूनतम जोखिम के साथ एक बहुत सरल सिद्धांत का उपयोग करता है के रूप में qPCR की तुलना में परख आधारित है । विधि कम तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण है; इसलिए, परख परिणाम काफी reproducible भी अनुभवहीन व्यक्तियों द्वारा कर रहे हैं ।
इस रिपोर्ट में, हम एक मात्रात्मक डॉट दाग परख हम नियमित रूप से AAV वेक्टर quantitation के लिए उपयोग के methodological विवरण का वर्णन और कैसे परख विधानसभा का अध्ययन करने के लिए लागू करने का एक उदाहरण प्रदान करने के लिए आम serotypes में AAPs की भूमिका को बढ़ावा देने (AAV5 और AAV9) और एक पहले सांप AAV14में से unचरित्रहीन AAP । प्रकृति में, AAV वीपी प्रोटीन और aap प्रोटीन एक एकल जीन से सीआईएस में व्यक्त कर रहे हैं (यानी, उपाध्यक्ष-aap सीआईएस-पूरक), जबकि यहाँ वर्णित परख में, वीपी और aap प्रोटीन दो अलग plasmids से ट्रांस में आपूर्ति कर रहे हैं (यानी, उपाध्यक्ष-aap ट्रांस पूरक) । चूंकि प्रत्येक उपाध्यक्ष या अलग serotypes से aap प्रोटीन प्रत्येक स्वतंत्र प्लाज्मिड से व्यक्त किया जा सकता है, यह कैप्सिड विधानसभा के लिए heterologous उपाध्यक्ष-aap युग्म का परीक्षण करने के लिए संभव हो जाता है (यानी, उपाध्यक्ष-aap पार-पूरक). संक्षेप में, विभिंन serotypes से AAV VP3 HEK २९३ कोशिकाओं में व्यक्त की है प्लाज्मिड डीएनए अभिकर्मक द्वारा AAV cognate aap की उपस्थिति या अनुपस्थिति में एक सीरोटाइप वेक्टर जीनोम पैकेज, या एक heterologous सीरोटाइप aap की उपस्थिति में । निंनलिखित उत्पादन, संस्कृति मीडिया और सेल lysates एक डॉट दाग परख के अधीन है कैप्सिड खोल के भीतर वायरल जीनोम यों तो । डॉट ब्लाटर परख के पहले कदम के नमूनों में दूषित प्लाज्मिड DNAs और unपैकेज्ड AAV जीनोम को दूर करने के लिए एक nuclease के साथ नमूनों का इलाज है । ऐसा करने में विफलता विशेष रूप से जब शुद्ध नमूनों परख रहे है पृष्ठभूमि संकेतों में वृद्धि होगी । यह तो नमूना समाधान में वायरल capsids और रिलीज nuclease-प्रतिरोधी वायरल जीनोम को तोड़ने के लिए एक चिढ़ा उपचार के बाद है । अगले, वायरल जीनोम विकृत कर रहे हैं, एक झिल्ली पर blotted, और quantitation के लिए एक वायरल जीनोम विशेष डीएनए जांच के साथ संकर । उदाहरण के लिए यहां रिपोर्ट में परख, हम प्रदर्शित करते है कि सांप AAV VP3 कैप्सिड विधानसभा के लिए सांप aap की आवश्यकता है और वह सांप aap से निकाले गए capsids के कई विपरीत AAV9 AAPs के विधानसभा को बढ़ावा नहीं देता है-serotypes पर निर्भर है कि भी विधानसभा का प्रचार कर सकते है heterologous सीरोटाइप capsids. अंत में, हम qPCR या डॉट दाग को एक महत्वपूर्ण चेतावनी-AAV quantitation परख आधारित है कि nuclease के चुनाव काफी परख परिणामों को प्रभावित करता है की रिपोर्ट ।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Benzonase</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>1016970001</td>
			<td>Referred to as Serratia marcescen endonuclease in the main text.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4716728001</td>
			<td>Referred to as DNase I Enzyme A in the main text.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18047019</td>
			<td>Referred to as DNase I Enzyme B in the main text.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0303L</td>
			<td>Referred to as DNase I Enzyme C in the main text.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Attached O-Ring Screw Cap Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Polypropylene Conical Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 M Sodium Acetate</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>S0298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Polypropylene Conical Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV-293 Cells</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>240073</td>
			<td>HEK-293 cell line optimized for the packaging of AAV virions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AccuGENE 0.5 M EDTA Solution</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>51234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AccuGENE 1 M Tris-HCl pH 8.0</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>51238</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AccuGENE 10% SDS</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>51213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AccuGENE 1X TE Buffer</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>51235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Dot Apparatus</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1706545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>A3294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Lifter</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>372978</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Extractor Kit</td>
			<td>Wako Pure Chemical Industries</td>
			<td>295-50201</td>
			<td>This is used for quantitative dot blots on purified virus. We use only a half volume of all the reagents in each step recommended for the Protocol Scheme 2 in the manual provided by the manufacturer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium (DMEM)-high glucose (4.5 g/L)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12-614F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ElectroMAX DH10B Cells</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>18290015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 200 Proof</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>2716</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>VWR</td>
			<td>1500-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll 400</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>B22095</td>
			<td>Referred to as Polysucrose 400.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence&#160;Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axiovert 40 CFL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10901393001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Herring Sperm DNA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15634-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization Tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13-247-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageQuant TL</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>ImageQuant TL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine 200 mM</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-605E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Choloride Hexahydrate</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>M0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroPulser Electroporator</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1652100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Quick Spin DNA Columns</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>11814419001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAAV-RC2 Vector</td>
			<td>Cell Biolabs Inc</td>
			<td>VPK-422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin 10K/10K</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-602E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-516F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphorimaging Exposure Cassette</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphorimaging Screen</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>12162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum Pfx DNA Polymerase</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11708013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine</td>
			<td>Polysciences Inc</td>
			<td>23966-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinylpyrrolidone</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>P5288</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prime-It II Random Primer Labeling Kit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>300385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer AAP Forward (N25 nucleotides from the 4th nucleotide in the AAP ORF, RE1 is a restriction enzyme site for cloning): CTAA-RE1-CACCATGGACTACAAGGACGACGATGACAAA-N25</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>Custom Primer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer AAP Reverse (N25 is the last 25 nucleotides of the AAP ORF, RE2 is a restriction enzyme site for cloning): TCTT-RE2-N25</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>Custom Primer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer VP3 Forward (N25 the first 25 nucleotides of the VP3 ORF, RE1 is a restriction enzyme site for cloning): CTAA-RE1-CACC-N25</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>Custom Primer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer VP3 Reverse (N25 is the last 25 nucleotides of the AAP ORF, RE2 is a restriction enzyme site for cloning): TCTT-RE2-N25</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>Custom Primer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K Solution</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25530-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restriction Enzymes</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Salmon Sperm DNA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15632011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological Pipettes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-11D / 13-678-11E / 13-678-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>S271-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Citrate Tribasic Dihydrate</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>C8532</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0203L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal Cycler</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>6321000515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-culture Treated 6-well Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Typhoon FLA 7000</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>28955809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Buffer-Saturated Phenol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15513-047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Crosslinker</td>
			<td>Spectroline</td>
			<td>XLE-1000</td>
			<td>Optimal Crosslink mode is used, providing a UV energy dosage of 120 mJ/cm2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeta-Probe Membrane</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>162-0165</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a quantitative dot blot assay for aav titration and its use for functional assessment of the adeno-associated virus assembly-activating proteins

जबकि adeno-एसोसिएटेड वायरस (AAV) व्यापक रूप से जीन थेरेपी के लिए एक आकर्षक वेक्टर के रूप में स्वीकार कर लिया है, यह भी वायरस जीव विज्ञान को समझने के लिए एक मॉडल वायरस के रूप में कार्य करता है । उत्तरार्द्ध में संमान, एक गैर संरचनात्मक AAV प्रोटीन की हाल ही की खोज, विधानसभा-प्रोटीन को सक्रिय (AAP), पर एक कैप्सिड में वायरल कैप्सिड उपाध्यक्ष प्रोटीन के विधानसभा में शामिल प्रक्रियाओं पर नए प्रकाश डाला है । हालांकि कई AAV serotypes विधानसभा के लिए AAP की आवश्यकता होती है, हम हाल ही में सूचना दी है कि AAV4, 5, और 11 इस नियम के अपवाद हैं । इसके अलावा, हम प्रदर्शन किया है कि AAPs और अलग serotypes के इकट्ठे capsids विभिंन उपसेलुलर डिब्बों को information । विभिन्न AAV serotypes के बीच जैविक गुणों और AAPs के कार्यात्मक भूमिकाओं में यह अप्रत्याशित विविधता विविध AAPs से व्युत्पंन serotypes पर अध्ययन के महत्व को रेखांकित करता है । यह पांडुलिपि विवरण AAV quantitation और उसके आवेदन के लिए एक सीधी बिंदी दाग परख के लिए AAP निर्भरता और कैप्सिड विधानसभा में सीरोटाइप विशिष्टता का आकलन । इस डॉट दाग परख की उपयोगिता को प्रदर्शित करने के लिए, हम बाहर सेट के लिए कैप्सिड विधानसभा और सांप AAV, एक पहले से लक्षण साँप AAV, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से AAV5 और AAV9 है, जो पहले से दिखाया गया है के लिए aap निर्भरता की विशेषताएं-स्वतंत्र और aap-निर्भर serotypes, क्रमशः । परख से पता चला कि स्नेक AAV कैप्सिड असेंबली को सांप AAP की आवश्यकता है और AAV5 और AAV9 से AAPs से प्रमोट नहीं किया जा सकता । परख भी पता चला है कि, आम सीरोटाइप AAPs के कई के विपरीत है कि परस्पर पूरक द्वारा heterologous कैप्सिड विधानसभा को बढ़ावा देने, सांप AAP AAV9 capsids के विधानसभा का प्रचार नहीं करता है । इसके अलावा, हम बताते है कि nuclease की पसंद काफी डॉट दाग परख के readout को प्रभावित करता है, और इस प्रकार, एक इष्टतम एंजाइम का चयन AAV titers के सफल आकलन के लिए महत्वपूर्ण है ।

एक बड़े पैमाने पर उत्पादित शुद्ध AAV वेक्टर स्टॉक्स के quantitation के लिए मात्रात्मक डॉट दाग का एक प्रतिनिधि परिणाम चित्रा 1में दिखाया गया है । इस डॉट ब्लाटर की परख के साथ-साथ एक डबल कतरा ti...

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A Quantitative Dot Blot Assay for AAV Titration and Its Use for Functional Assessment of the Adeno-associated Virus Assembly-activating Proteins

यह पांडुलिपि विवरण adeno के quantitation के लिए एक सीधी डॉट दाग परख-एसोसिएटेड वायरस (AAV) titers और उसके आवेदन के लिए विधानसभा की भूमिका-सक्रिय प्रोटीन (AAPs), गैर संरचनात्मक वायरल प्रोटीन के एक उपंयास वर्ग के अध्ययन के लिए सभी AAV में पाया serotypes, cognate और heterologous AAV serotypes से व्युत्पंन capsids के विधानसभा को बढ़ावा देने में ।

AAV अनुमापन और Adeno के कार्यात्मक आकलन के लिए इसके उपयोग के लिए एक मात्रात्मक डॉट दाग परख-संबंधित वायरस विधानसभा-सक्रिय प्रोटीन

While adeno-associated virus (AAV) is widely accepted as an attractive vector for gene therapy, it also serves as a model virus for understanding virus ...

Research

JoVE Journal

Biology

Use of Rotorod as a Method for the Qualitative Analysis of Walking in Rat

के गुणात्मक विश्लेषण के लिए एक विधि चूहा में चलना के रूप में Rotorod का प्रयोग

High speed videoanalysis of the details of movement can provide a source of information about qualitative aspects of walking movements. When walking on a ...

The Ladder Rung Walking Task: A Scoring System and its Practical Application.

सीढ़ी टास्क चलना सीढ़ी: एक स्कोरिंग प्रणाली और इसके व्यावहारिक अनुप्रयोग.

Progress in the development of animal models for/stroke, spinal cord injury, and other neurodegenerative disease requires tests of high sensitivity to ...

The Microfluidic Probe: Operation and Use for Localized Surface Processing

Microfluidic जांच: ऑपरेशन और स्थानीयकृत भूतल प्रसंस्करण के लिए प्रयोग

Microfluidic devices allow assays to be performed using minute amounts of sample and have recently been used to control the microenvironment of cells. ...

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

संरचना lipídic Mesophases का उपयोग कर निर्धारण के लिए झिल्ली प्रोटीन crystallizing

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

Multiplex PCR and Reverse Line Blot Hybridization Assay (mPCR/RLB)

Multiplex PCR and Reverse Line Blot Hybridization Assay mPCR/RLB

मल्टीप्लेक्स पीसीआर और रिवर्स रेखा ब्लाट संकरण परख (mPCR / RLB)

Multiplex PCR/Reverse Line Blot Hybridization assay allows the detection of up to 43 molecular targets in 43 samples using one multiplex PCR reaction ...

A Quantitative Assay for Insulin-expressing Colony-forming Progenitors

इंसुलिन व्यक्त कालोनी बनाने progenitors के लिए एक मात्रात्मक परख

The field of pancreatic stem and progenitor cell biology has been hampered by a lack of in vitro functional and quantitative assays that allow for the ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Lipidic Mesophases में उच्च throughput झिल्ली प्रोटीन का Crystallization के लिए एक रोबोट का प्रयोग

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

A Hybrid DNA Extraction Method for the Qualitative and Quantitative Assessment of Bacterial Communities from Poultry Production Samples

पोल्ट्री उत्पादन नमूनों से बैक्टीरियल समुदाय के गुणात्मक और मात्रात्मक मूल्यांकन के लिए एक हाइब्रिड डीएनए निष्कर्षण विधि

The efficacy of DNA extraction protocols can be highly dependent upon both the type of sample being investigated and the types of downstream analyses ...

A Protocol for Using Gene Set Enrichment Analysis to Identify the Appropriate Animal Model for Translational Research

जीन सेट संवर्धन विश्लेषण का उपयोग करने के लिए अनुवाद अनुसंधान के लिए उपयुक्त पशु मॉडल की पहचान के लिए एक प्रोटोकॉल

Recent studies that compared transcriptomic datasets of human diseases with datasets from mouse models using traditional gene-to-gene comparison ...

Immunofluorescent Labeling of Plant Virus and Insect Vector Proteins in Hemipteran Guts

हेमिप्टेरन गट्स में प्लांट वायरस और कीट वेक्टर प्रोटीन की इम्यूनोफ्लोरोसेंट लेबलिंग

Most plant viruses in nature are transmitted from one plant to another by hemipteran insects. A high population density of the vector insects that are ...