Name: establishment of a primary culture of patient-derived soft tissue sarcoma
Uploaded: 2018-04-11T13:00:00
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Os autores gostaria de agradecer Gráinne Tierney assistência editorial.

Células de STS são isoladas um tumor extirpado cirurgicamente massa de pacientes com STS. O protocolo foi aprovado pelo Comitê de ética Local e é realizado de acordo com as diretrizes de boas práticas clínicas e a declaração de Helsinque. Todos os pacientes deram consentimento escrito para participar no estudo. Os espécimes cirúrgicos são analisados por um patologista experiente sarcoma e processados dentro de 3 horas de cirurgia.
1. tumor colheita e processamento:
<ol><li>Colete...

<ol>
	<li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+statistics.">Cancer statistics.</a> CA Cancer J Clin. 66 (1), 7-30 (2016).</li><li>Linch, M., Miah, A. B., Thway, K., Judson, I. R., Benson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+treatment+of+soft-tissue+sarcoma+gold+standard+and+novel+therapies.">Systemic treatment of soft-tissue sarcoma gold standard and novel therapies.</a> Nat Rev Clin Oncol. 11 (4), 187-202 (2014).</li><li>Fletcher, C. 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Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+vegf+gene+knockdown+on+growth+of+the+murine+sarcoma+cell+line+MS-K.">Effect of vegf gene knockdown on growth of the murine sarcoma cell line MS-K.</a> Cells. 16 (6), 625-638 (2011).</li><li>Kidani, T., Yasuda, R., Miyawaki, J., Oshima, Y., Miura, H., Masuno, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bisphenol+A+Inhibits+Cell+Proliferation+and+Reduces+the+Motile+Potential+of+Murine+LM8+Osteosarcoma+Cells.">Bisphenol A Inhibits Cell Proliferation and Reduces the Motile Potential of Murine LM8 Osteosarcoma Cells.</a> Anticancer Res. 37 (4), 1711-1722 (2017).</li><li>Sugiyasu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radio-sensitization+of+the+murine+osteosarcoma+cell+line+LM8+with+parthenolide,+a+naturalinhibitor+of+NF-&#954;B.">Radio-sensitization of the murine osteosarcoma cell line LM8 with parthenolide, a naturalinhibitor of NF-&#954;B.</a> Oncol Lett. 2 (3), 407-412 (2011).</li><li>Daigeler, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneous+in+vitro+effects+of+doxorubicin+on+gene+expression+in+primary+human+liposarcoma+cultures.">Heterogeneous in vitro effects of doxorubicin on gene expression in primary human liposarcoma cultures.</a> BMC Cancer. 29 (8), 313 (2008).</li></ol>

Modelos pré-clínicos bem definidos são necessários para elucidar o fundo molecular de tumores, prever o prognóstico pobre e desenvolver novas estratégias terapêuticas para pacientes com câncer. Isto é especialmente importante para tumores raros como STS cuja alta heterogeneidade em termos de morfologia, comportamento agressivo em potencial e clínico desafia nossa compreensão da biologia do STS e gestão paciente21. Além disso, poucas linhas celulares sarcoma comerciais disponíveis lim...

Sarcomas de partes moles (STS) incluem um espectro de lesões heterogêneas de contabilidade de origem mesenquimal para 1% de todos os tumores sólidos1,2, e a nova classificação da Organização Mundial de saúde reconhece a presença de mais de 50 Subtipos diferentes3. Entre estes, os histotypes mais comuns são sarcoma de adipócitos ou Lipossarcoma e Leiomiossarcoma, representando 15% e 11% de todos os adultos STS, respectivamente de4,5. Embora o STS podem desenvolver em diferentes partes do corpo, as extremidades e retroperitoneal são os locais mais comuns, ocorrendo em 60% e 20% dos casos, respectivamente6.
A pedra angular da terapia para doença localizada é a ressecção cirúrgica ampla, Considerando que os benefícios da quimioterapia adjuvante e neoadjuvante não são ainda claras e são considerados apenas em casos selecionados7. Na configuração da metastática, quimioterapia é o tratamento padrão, mas mostra resultados limitados8. Uma melhor compreensão da biologia molecular da STS contribuiria para melhorar o diagnóstico atual, otimizar os tratamentos disponíveis e identificar novos alvos para a terapia.
Dentro deste contexto, foi realizada pesquisa em câncer por muitos anos usando linhas de célula imortalizado9. Esses modelos experimentais são normalmente cultivados em monocamada padrão suporta ou implantados em imunodeficientes roedores estabelecer na vivo xenoenxertos modelos10. Linha celular imortalizado representa um gerenciável e fácil-para-loja material com o qual um amplo número de experimentos de pesquisa pode ser realizado. Eles são, na verdade, os menos dispendiosos e mais amplamente utilizado a ferramenta em estudos pré-clínicos11.
No entanto, célula-linha com base em modelos de câncer também têm algumas limitações, por exemplo, prolongada de cultura em um sistema de monocamada juntamente com um número crescente de passagens induz fenotípica e deriva genética, fazendo as células menos provável para recapitular o tumor chave características. Além disso, culturas de células linha deixam de reproduzir a interação célula a célula e sinalização diafonia molécula que imitam o comportamento biológico dos tumores e caracterizar o microambiente do tumor. Estas questões formam a base do fosso existente entre os resultados clínicos e pré-clínicos12.
Dado o acima, o interesse no paciente-derivado de culturas primárias aumentou13. Com efeito, a excisão do tecido normal e maligno reduz o risco de perder o fenótipo de células de câncer e heterogeneidade, oferecendo assim uma matéria-prima que é o mais representativo do microambiente do tumor. Além disso, o uso de amostras de tumor frescas colhidas de pacientes submetidos à ressecção cirúrgica nos permite investigar tumores única e comparar diferentes lesões da mesma parte do corpo de14 um paciente. Pelas razões acima expostas, culturas de células derivadas de tecido proporcionam um valioso material para estudar o tumor fisiopatologia e farmacologia15,16,17, especialmente no STS em quais linhas de células de sarcoma comercialmente disponível são limitados,18. Nós aperfeiçoamos, portanto, um método para estabelecer uma paciente-derivado STS cultura de célula primária a partir de2019,13,do tecido tumor cirurgicamente extirpado. Nosso método consiste em desagregar o espécime de tumor em pequenos fragmentos de tecido seguidos de dissociação de tecido enzimática durante a noite para obter uma suspensão de célula única. No dia seguinte, a digestão enzimática é interrompido pela adição de meio de cultura fresco e a suspensão obtida é filtrada para remover fragmentos de tecido, célula-agregados e material de matriz em excesso ou detritos. Finalmente, uma fração de células tumorais isoladas é cytospinned em lâminas de vidro, fixo e armazenados para jusante análise visado confirmando o estabelecimento da cultura primária de STS por cytomorphological, imuno-histoquímica e avaliação citogenética molecular (por exemplo, análise de peixe de MDM2 amplificação representa o padrão diagnóstico diferencial para uma Lipossarcoma bem diferenciada e a condrossarcoma Lipossarcoma) 4. as células restantes são semeadas em uma cultura padrão monocamada para estudos farmacológicos e de criação de perfil de expressão genética. Todos os experimentos são realizados usando baixa passagem culturas primárias para evitar a seleção dos subclones de câncer específicos e analisaram por um patologista experiente sarcoma. Assim, criamos um humano totalmente STS ex-vivo modelo13,19,20. Esta altamente versátil, fácil de punho modelo poderia representar uma ferramenta útil para diferentes tipos de pesquisa pré-clínica, por exemplo, para identificar novos marcadores moleculares para diagnóstico e prognóstico ou para ganhar uma compreensão mais profunda da atividade e mecanismos de ação de padrão e novos fármacos utilizados na gestão do STS.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:599px;" width="597">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:163px;">DMEM High Glucose</td>
			<td style="width:180px;">EuroClone</td>
			<td style="width:111px;">ECB7501L</td>
			<td style="width:145px;"></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:163px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:180px;">EuroClone</td>
			<td style="width:111px;">ECS0180D</td>
			<td style="width:145px;"></td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:163px;">Glutamine</td>
			<td style="width:180px;">Gibco</td>
			<td style="width:111px;">25030-024</td>
			<td style="width:145px;"></td>
		</tr>
		<tr height="112">
			<td height="112" style="height:112px;width:163px;">Paraformaldehyde 4% aqueous solution, EM grade</td>
			<td style="width:180px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:111px;">157-4-100</td>
			<td style="width:145px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:163px;">Penicillin streptomycin</td>
			<td style="width:180px;">Gibco</td>
			<td style="width:111px;">15140122</td>
			<td style="width:145px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:163px;">Triazol reagent</td>
			<td style="width:180px;">Ambion Life-Technologies</td>
			<td style="width:111px;">15596018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;">Trypsin</td>
			<td>EuroClone</td>
			<td style="width:111px;">ECB3052D</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishment of a primary culture of patient-derived soft tissue sarcoma

Sarcomas de partes moles (STS) representam um espectro de malignidades heterogêneos com difícil diagnóstico, classificação e de gestão. Até à data, foram identificados mais de 50 subtipos histológicos destes raros tumores sólidos. Assim, devido à sua extraordinária diversidade e baixa incidência, nossa compreensão da biologia desses tumores é ainda limitado. Paciente-derivado de culturas representam a plataforma ideal para estudar farmacologia e fisiopatologia do STS. Assim, desenvolvemos um modelo humano pré-clínicos de STS a partir de amostras de tumor colhidas de pacientes submetidos à ressecção cirúrgica. Culturas de células do paciente-derivado STS foram obtidas a partir dos espécimes cirúrgicos por digestão de colagenase e isoladas por filtração. As células foram contadas, semeadas e deixou por 14 dias em culturas padrão monocamada e processadas por análise a jusante. Antes de executar análises moleculares ou farmacêuticas, o estabelecimento de culturas primárias de STS foi confirmado através da avaliação das características de cytomorphologic e, quando disponível, marcadores imuno-histoquímicos. Este método representa uma ferramenta útil 1) para estudar a história natural destas malignidades mal exploradas e 2) para testar os efeitos de diferentes drogas em um esforço para aprender mais sobre seus mecanismos de ação.

Nós projetamos um método simples para obter o estabelecimento de uma cultura primária de sarcoma macio do tecido derivado de paciente e apresente-se aqui um exemplo dos resultados obtidos em um específico STS histotype13. O protocolo foi utilizado para o estabelecimento de culturas primárias de diferentes histotypes STS, incluindo Lipossarcoma bem diferenciada, condrossarcoma Lipossarcoma Lipossarcoma mixoide, Lipossarcoma pleomórfica, myxofibrosarcoma, indif...

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Establishment of a Primary Culture of Patient-derived Soft Tissue Sarcoma

O seguinte protocolo incide sobre o estabelecimento de uma cultura primária de sarcoma de tecidos moles paciente-derivado (STS). Este modelo pode nos ajudar a compreender melhor o fundo molecular e perfil farmacológico destas malignidades raras e poderia representar um ponto de partida para novas pesquisas que visam melhorar a gestão do STS.

Estabelecimento de uma cultura primária de Sarcoma macio do tecido derivado de paciente

Soft tissue sarcomas (STS) represent a spectrum of heterogeneous malignancies with a difficult diagnosis, classification, and management. To date, more ...

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Development and Maintenance of a Preclinical Patient Derived Tumor Xenograft Model for the Investigation of Novel Anti-Cancer Therapies

Desenvolvimento e manutenção de um tumor do paciente pré-clínica Derivado Xenoenxerto Modelo de Investigação de Novel Anti-Cancer Therapies

Patient derived tumor xenograft (PDTX) models provide a necessary platform in facilitating anti-cancer drug development prior to human trials. Human tumor ...

Pesquisa do câncer

Labeling of Breast Cancer Patient-derived Xenografts with Traceable Reporters for Tumor Growth and Metastasis Studies

Rotulagem de cancro da mama xenoenxertos derivados do paciente com rastreáveis ​​Repórteres para o crescimento de tumores e metástases Estudos

The use of preclinical models to study tumor biology and response to treatment is central to cancer research. Long-established human cell lines, and many ...

Isolation and Characterization of Tumor-initiating Cells from Sarcoma Patient-derived Xenografts

Isolamento e caracterização de células iniciantes tumorais de sarcoma de xenoenxertos derivados do paciente

The existence and importance of tumor-initiating cells (TICs) have been supported by increasing evidence during the past decade. These TICs have been ...

Modeling Osteosarcoma Using Li-Fraumeni Syndrome Patient-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Modelagem de osteossarcoma usando síndrome de Li-Fraumeni paciente-derivado induzido Pluripotent Stem Cells

Li-Fraumeni syndrome (LFS) is an autosomal dominant hereditary cancer disorder. Patients with LFS are predisposed to a various type of tumors, including ...

A Melanoma Patient-Derived Xenograft Model

Um modelo de Xenoenxerto derivado do paciente com melanoma

Accumulating evidence suggests that molecular and biological properties differ in melanoma cells grown in traditional two-dimensional tissue culture ...

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

Estabelecimento de modelos de xenoenxertos derivados de câncer gástrico e linhas celulares primárias

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish

Triagem de drogas de xenoenxertos tumorais derivados do paciente primário em zebrafish

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the ...

The Establishment and Utilization of Patient Derived Xenograft Models of Central Nervous System Metastasis

Estabelecimento e Utilização de Modelos de Xenoenxerto de Metástases do Sistema Nervoso Central Derivados de Pacientes

The development of novel therapies for central nervous system (CNS) metastasis has been hindered by the lack of preclinical models that accurately ...

Establishment and Culture of Patient-Derived Breast Organoids

Estabelecimento e Cultura de Organoides Mamários Derivados da Paciente

Breast cancer is a complex disease that has been classified into several different histological and molecular subtypes. Patient-derived breast tumor ...

Establishment of Zebrafish Patient-Derived Xenografts from Pancreatic Cancer for Chemosensitivity Testing

Estabelecimento de Xenoenxertos Derivados de Pacientes com Zebrafish de Câncer de Pâncreas para Teste de Quimiosensibilidade

Cancer is one of the main causes of death worldwide, and the incidence of many types of cancer continues to increase. Much progress has been made in terms ...