Name: two-photon calcium imaging in neuronal dendrites in brain slices
Uploaded: 2018-03-15T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי המועצה הקנדית מכוני הבריאות מחקר מדעי הטבע, מחקר הנדסי (NSERC גילוי גרנט) וקרן סבוי. OC נתמכה על ידי מלגת דוקטורט מ NSERC.

כל הניסויים בוצעו בהתאם להנחיות רווחת החיה הגנה הוועדה של אוניברסיטת לאוול והמועצה קנדי על טיפול בעלי חיים.
1. הכנה ראשונית (אופציונלי: להכין יום מראש)
<ol><li>הכינו שלושה סוגים של נוזל מוחי שדרתי מלאכותי (כלנית חדד) פתרון (רגילה, סוכרוז, התאוששות פתרונות, 1 ליטר לכל; ראה טבלה...

<ol>
	<li>Williams, S. R., Mitchell, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+measurement+of+somatic+voltage+clamp+errors+in+central+neurons.">Direct measurement of somatic voltage clamp errors in central neurons.</a> Nat Neurosci. 7, 790-798 (2008).</li><li>Denk, W., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photon+upmanship:+why+multiphoton+imaging+is+more+than+a+gimmick.">Photon upmanship: why multiphoton imaging is more than a gimmick.</a> Neuron. 18, 351-357 (1997).</li><li>Yuste, R., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+spines+as+basic+functional+units+of+neuronal+integration.">Dendritic spines as basic functional units of neuronal integration.</a> Nature. 375, 682-684 (1995).</li><li>Nimchinsky, E. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+Function+of+Dendritic+Spines.">Structure and Function of Dendritic Spines.</a> Annu Rev Physiol. 64, 313-353 (2002).</li><li>Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+calcium+channels+in+single+spines+using+optical+fluctuation+analysis.">Analysis of calcium channels in single spines using optical fluctuation analysis.</a> Nature. 408, 589-593 (2000).</li><li>Mainen, Z. F., Malinow, R., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+calcium+transients+in+single+spines+indicate+that+NMDA+receptors+are+not+saturated.">Synaptic calcium transients in single spines indicate that NMDA receptors are not saturated.</a> Nature. 399, 151-155 (1999).</li><li>Yasuda, R., Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+of+calcium+channels+in+dendritic+spines.">Plasticity of calcium channels in dendritic spines.</a> Nat Neurosci. 6, 948-955 (2003).</li><li>Carter, A. G., Sabatini, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=State-dependent+calcium+signaling+in+dendritic+spines+of+striatal+medium+spiny+neurons.">State-dependent calcium signaling in dendritic spines of striatal medium spiny neurons.</a> Neuron. 44, 483-493 (2004).</li><li>Topolnik, L., Congar, P., Lacaille, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+of+metabotropicglutamate+receptor-+and+AMPA+receptor-mediated+dendritic+Ca2++signals+by+presynaptic+and+postsynaptic+activity+in+hippocampal+interneurons.">Differential regulation of metabotropicglutamate receptor- and AMPA receptor-mediated dendritic Ca2+ signals by presynaptic and postsynaptic activity in hippocampal interneurons.</a> J Neurosci. 25, 990-1001 (2005).</li><li>Topolnik, L., Chamberland, S., Pelletier, J. G., Ran, I., Lacaille, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+compartmentalized+regulation+of+dendritic+Ca2++signaling+in+hippocampal+interneurons.">Activity-dependent compartmentalized regulation of dendritic Ca2+ signaling in hippocampal interneurons.</a> J Neurosci. 29, 4658-4663 (2009).</li><li>Camir&#233;, O., Topolnik, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+calcium+nonlinearities+switch+the+direction+of+synaptic+plasticity+in+fast-spiking+interneurons.">Dendritic calcium nonlinearities switch the direction of synaptic plasticity in fast-spiking interneurons.</a> J Neurosci. 34, 3864-3877 (2014).</li><li>Jaffe, D. B., Johnston, D., Lasser-Ross, N., Lisman, J. E., Miyakawa, H., Ross, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thespread+of+Na++spikes+determines+the+pattern+of+dendritic+Ca2++entry+into+hippocampal+neurons.">Thespread of Na+ spikes determines the pattern of dendritic Ca2+ entry into hippocampal neurons.</a> Nature. 357, 244-246 (1992).</li><li>Nakamura, T., Barbara, J. G., Nakamura, K., Ross, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+release+of+Ca2++from+IP3-sensitive+stores+evoked+by+synaptic+activation+of+mGluRs+paired+with+backpropagating+action+potentials.">Synergistic release of Ca2+ from IP3-sensitive stores evoked by synaptic activation of mGluRs paired with backpropagating action potentials.</a> Neuron. 24, 727-737 (1999).</li><li>Kovalchuk, Y., Eilers, J., Lisman, J., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMDA+receptor-mediated+subthreshold+Ca(2+)+signals+in+spines+of+hippocampal+neurons.">NMDA receptor-mediated subthreshold Ca(2+) signals in spines of hippocampal neurons.</a> J Neurosci. 20, 1791-1799 (2000).</li><li>Goldberg, J. H., Yuste, R., Tamas, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2++imaging+of+mouse+neocortical+interneurone+dendrites:+contribution+of+Ca2+-permeable+AMPA+and+NMDA+receptors+to+subthreshold+Ca2++dynamics.">Ca2+ imaging of mouse neocortical interneurone dendrites: contribution of Ca2+-permeable AMPA and NMDA receptors to subthreshold Ca2+ dynamics.</a> J Physiol. 551, 67-78 (2003).</li><li>Goldberg, J. H., Lacefield, C. O., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+dendritic+calcium+spikes+in+mouselayer+5+low+threshold+spiking+interneurones:+implications+for+control+of+pyramidal+cell+bursting.">Global dendritic calcium spikes in mouselayer 5 low threshold spiking interneurones: implications for control of pyramidal cell bursting.</a> J Physiol. 558, 465-478 (2004).</li><li>Oertner, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+imaging+of+single+synapses+in+brain+slices.">Functional imaging of single synapses in brain slices.</a> Exp Physiol. 87, 733-736 (2002).</li><li>Yasuda, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+calcium+concentration+dynamics+in+small+neuronal+compartments.">Imaging calcium concentration dynamics in small neuronal compartments.</a> Sci STKE. 219, pl5 (2004).</li><li>Maravall, M., Mainen, Z. F., Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimating+intracellular+calcium+concentrations+and+buffering+without+wavelength+rationing.">Estimating intracellular calcium concentrations and buffering without wavelength rationing.</a> Biophys J. 78, 2655-2667 (2000).</li><li>Camir&#233;, O., Topolnik, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+compartmentalization+and+regulation+of+postsynaptic+CaTs+in+inhibitory+interneurons.">Functional compartmentalization and regulation of postsynaptic CaTs in inhibitory interneurons.</a> Cell Calcium. 52, 339-346 (2012).</li><li>Guet-McCreight, A., Camir&#233;, O., Topolnik, L., Skinner, F. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+a+semi-automated+strategy+to+develop+multi-compartment+models+that+predict+biophysical+properties+of+interneuron-specific+3+(IS3)+cells+in+hippocampus.">Using a semi-automated strategy to develop multi-compartment models that predict biophysical properties of interneuron-specific 3 (IS3) cells in hippocampus.</a> eNeuro. 3, 1-26 (2016).</li><li>Evstratova, A., Chamberland, S., Topolnik, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+and+activity-dependent+dynamics+of+action+potential-evoked+Ca2++signals+in+dendrites+of+hippocampal+inhibitory+interneurons.">Cell type-specific and activity-dependent dynamics of action potential-evoked Ca2+ signals in dendrites of hippocampal inhibitory interneurons.</a> J Physiol. 589, 1957-1977 (2011).</li><li>Topolnik, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+calcium+mechanisms+and+long-term+potentiation+in+cortical+inhibitory+interneurons.">Dendritic calcium mechanisms and long-term potentiation in cortical inhibitory interneurons.</a> Eur J Neurosci. 35, 496-506 (2012).</li><li>Camir&#233;, O., Lacaille, J. C., Topolnik, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+Signaling+in+Inhibitory+Interneurons:+Local+Tuning+via+Group+I+Metabotropic+Glutamate+Receptors.">Dendritic Signaling in Inhibitory Interneurons: Local Tuning via Group I Metabotropic Glutamate Receptors.</a> Front Physiol. 3, 259 (2012).</li><li>Bourque, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+mechanisms+of+osmosensation+and+systemic+osmoregulation.">Central mechanisms of osmosensation and systemic osmoregulation.</a> Nat RevNeurosci. 9, 519-531 (2008).</li><li>Aghajanian, G. K., Rasmussen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+studies+in+the+facial+nucleus+illustrating+a+simple+new+method+for+obtaining+viable+motoneurons+in+adult+rat+brain+slices.">Intracellular studies in the facial nucleus illustrating a simple new method for obtaining viable motoneurons in adult rat brain slices.</a> Synapse. 3, 331-338 (1989).</li><li>Pettit, D. L., Wang, S. S., Gee, K. R., Augustine, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+two-photon+uncaging:+anovel+approach+to+mapping+glutamate+receptors.">Chemical two-photon uncaging: anovel approach to mapping glutamate receptors.</a> Neuron. 19, 465-471 (1997).</li><li>Salom&#233;, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+random-access+scanning+in+two-photon+microscopy+usingacousto-optic+deflectors.">Ultrafast random-access scanning in two-photon microscopy usingacousto-optic deflectors.</a> J Neurosci Methods. 154, 161-174 (2006).</li><li>Lechleiter, J. D., Lin, D. T., Sieneart, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-photon+laser+scanning+microscopy+using+an+acoustic+optical+deflector.">Multi-photon laser scanning microscopy using an acoustic optical deflector.</a> Biophys J. 83, 2292-2299 (2002).</li></ol>

השיטה המוצגת כאן מדגים כיצד ניתן להשתמש השילוב של שני הפוטונים Ca2 + הדמיה electrophysiology תיקון-קלאמפ ללמוד דנדריטים Ca2 + איתות של דנדריטים עצביים במוח חריפה פרוסות. שיטה זו מאפשרת ניטור של שניהם מקומי Ca2 + הגבהים עורר על ידי חשמל AP גירוי או backpropagating מקטעים דנדריטים, ואת התגובה סומ?...

התרומה של נוירון לפעילות הרשת נקבעת במידה רבה על ידי באופי הדינמי של הקלט סינפטית שהיא מקבלת. באופן מסורתי, השיטה הדומיננטית של אפיון פעילות סינפטיים בנוירונים הסתמך על תיקון שלם-תא הסומטית-קלאמפ הקלטות של זרמי postsynaptic עורר על ידי גירוי חשמלי של אקסונים של המעבר. עם זאת, הפעילות היחידה של הסינפסות ממוקם הציר הקרוב הוא דיווח בכנות במקרה הזה1. בנוסף, כדי להעריך את המנגנונים הספציפיים סינפסה, שימשו הקלטות זוגות נוירונים ומן דנדריטים במיקום ספציפי למטרה הסינפסות עניין ולפי המנגנון של אינטגרציה דנדריטים, בהתאמה. פריצת דרך בתחום הפיזיולוגיה סינפטית הושג באמצעות נישואים של טכניקות אופטי אלקטרופיזיולוגיות. סריקת מיקרוסקופ (2PLSM) בשילוב עם Ca2 + הדמיה וכלים optogenetic לייזר שני הפוטונים עירור עלול לחשוף פרטים עצומה של הארגון הדינאמי של פעילות סינפטית ספציפי חיבורים עצביים במוח פרוסות חוץ גופית ו ויוו.
מספר יתרונות מרכזיים שנעשו 2PLSM להתבלט מיקרוסקופ עירור קונבנציונאלי, פוטון אחד2: (1) בשל אופי לא לינארית של שני הפוטונים עירור, נוצר על ידי קרינה פלואורסצנטית רק באמצעי אחסון מוקד ולאחר כל הפוטונים הנפלטים מייצגים שימושי אותות (אין צורך חריר); (2) אורכי הגל, בשימוש 2PLSM, לחדור את הרקמה פיזור ביעילות רבה יותר; בנוסף, פוטונים מפוזר הם גם לדלל לייצר שני הפוטונים עירור, רקע זריחה; (3) נזקי phototoxicity מוגבלים גם למישור מוקד. לכן, למרות העלות הגבוהה של פוטון 2 מערכות בהשוואה מיקרוסקופ קונפוקלי קונבנציונאלי, נשאר 2PLSM שיטת הבחירה לחקירה ברזולוציה גבוהה של מבנה העצבית ותפקוד ברקמת החיים עבה.
היישום הראשון של 2PLSM ברקמות פיזור היתה תמונת המבנה והתפקוד של הדנדריטים3. 2PLSM בשילוב עם Ca2 + הדמיה חשפה שהפונקציה קוצים כמו תאים מבודדים הביוכימי. מאז בסוגי עצביים רבים יש התאמה של אחד לאחד בין קוצים בודדים הסינפסות4, שני הפוטונים Ca2 + הדמיה בקרוב הפך להיות כלי שימושי דיווח הפעילות של הפרט סינפסות רקמות ללא פגע5, 6,7,8. יתר על כן, Ca2 + דימות מבוסס 2PLSM שימש בהצלחה כדי לפקח על הפעילות של ערוצי סידן יחיד, יחסי גומלין לא לינארית conductances פנימי וסינפטית, כמו גם כדי להעריך את מצב פעילות ותלוי רגולציה של Ca2 + איתות דנדריטים עצביים5,6,7,8,9,10,11.
סידן הוא שליח השני תאיים בכל מקום, ייתכן האירגון subcellular קובע את הכיוון של תגובות פיזיולוגיות, מפני שינויים סינפטיים כוח ברגולציה של יון ערוצי, צמיחה דנדריט ועמוד השדרה, כמו כמו מוות של תאים, הישרדות. Ca דנדריטים2 + הגבהים להתרחש באמצעות הפעלה של נתיבים מרובים. פוטנציאל פעולה (APs), backpropagating אל דנדריטים, פתיחת ערוצי סידן ממותגת מתח12 ומפיקים יחסית הכללית Ca2 + תופעות מעבר (חתולים) דנדריטים, קוצים13. הסינאפסית מזוהה עם ההפעלה של Ca postsynaptic2 +-קולטנים חדיר (NMDA, Ca2 +-חדיר אמפא, kainate), מפעילה סינפטית חתולים14,6,15. לבסוף, ניתן להפיק supralinear Ca2 + אירועים של דנדריטים תחת מסוים התנאים11,12,13,16.
שני הפוטונים Ca2 + הדמיה בשילוב עם הקלטות אלקטרופיזיולוגיות תיקון-קלאמפ מעסיקה Ca סינתטי2 +-אינדיקטורים פלורסנט רגיש, אשר מועברים בדרך כלל דרך האלקטרודה תיקון במהלך הקלטות שלם-תא . שיטה סטנדרטית על כימות של Ca2 + דינמיקה מבוסס על כביש17,שיטת מחוון כפול18. הוא משתמש fluorophores שני עם ספקטרום הפליטה מופרדים היטב (למשל, שילוב של אדום Ca2 +-צבע אטום עם ירוק Ca2 + אינדיקטורים, כגון אורגון הירוקה BAPTA-1 או Fluo-4) יש מספר יתרונות בהשוואה שיטת אינדיקציה יחידה. ראשית, Ca2 +-צבע רגישות משמש כדי לאתר מבנים קטנים עניין (סניפים דנדריטי ואת עמוד השדרה) שבו יבוצעו Ca2 + הדמיה. שנית, היחס בין שינוי ירוק ואדום קרינה פלואורסצנטית (ΔG/R) מחושבת כאמצעי של [Ca2 +], המהווה במידה רבה רגישות לשינויים בסיסית פלורסצנטיות עקב תנודות [Ca2 +]017 , 18. יתר על כן, התפקיד פלורסצנטיות השינויים מבחינת מוחלטת Ca2 + ריכוזים19.
דאגה כללית בעת הפעלת שני הפוטונים Ca2 + הדמיה ניסויים בפרוסות חריפה היא בריאות ויציבות של רכישת התמונה עקב עוצמת הלייזר גבוהה משמש בדרך כלל. בנוסף, Ca2 + ניסויים הדמיה, קיים חשש על ההפרעות, ניכר מופרזת של Ca subcellular2 + דינמיקה בשל העובדה כי Ca2 + מחוונים לשמש ניידים במיוחד אקסוגני Ca2 + מאגרים. לכן, הבחירה של מחוון Ca2 + והריכוז שלו תלוי על סוג עצביים, משרעת הצפויה של חתולים, השאלה ניסיוני.
שינינו את שיטת שני הפוטונים Ca2 + הדמיה עבור חקירת Ca2 + תנודות דנדריטים של GABAergic interneurons9,10,11,20,21 , 22. בעוד עיקר מוקדם Ca2 + הדמיה מחקרים נעשו בו נוירונים העיקרי, interneurons מעכבות להציג לראווה מגוון גדול של תפקודי Ca2 + מנגנונים נבדלים אלה תאים כפירמידה20 , 23 , 24. מנגנונים אלה interneuron ספציפיים (למשל, Ca2 + חדיר אמפא רצפטורים) עשוי לשחק תפקידים ספציפיים בוויסות פעילות התאים. בעוד דנדריטים Ca2 + איתות ב interneurons הוא מטרה מפתה לחקירה נוספת, שני הפוטונים Ca2 + דימות in דנדריטים של תאים אלה מציגה אתגרים נוספים, מ בקוטר דק יותר של דנדריטים וחוסר קוצים כדי גבוהה במיוחד אנדוגני Ca2 + מחייב קיבולת. כל תחומי המחקר שלנו המחקר של interneurons בהיפוקמפוס, פרוטוקול הבאות, בעוד החלים על אוכלוסיות עצביים שונים, הותאם להתמודד עם האתגרים הללו.
פרוטוקול זה הוצא להורג עם מיקרוסקופ שני הפוטונים מסחרי קונפוקלי, אשר מצויד עם גלאים חיצוניים, שאינם descanned שני (NDDs), אפנן אלקטרו-אופטיים (לבחירות) Dodt סריקת צבע ניגודיות (מפקדת הסטארגייט), מותקן על טבלת אופטי. המיקרוסקופ היה בשילוב עם Ti:Sapphire לייזר multiphoton במצב נעול ב 800 nm (> 3 W, 140 פעימות fs, 80 הרץ חזרה שער). מערכת ההדמייה היה מצויד מעטה אלקטרופיזיולוגיה רגיל, כולל תא זלוף עם בקרת טמפרטורה, פלטפורמה תרגום עם שני micromanipulators, מגבר microelectrode מבוקרת מחשב, של התקן דיגיטציה, גירוי היחידה, הנתונים רכישת התוכנה.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="608">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:239px;">Animal Strain: Mouse CD1&#160;</td>
			<td style="width:148px;">Charles River</td>
			<td style="width:159px;">022</td>
			<td style="width:63px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:239px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:148px;">AbbVie Corporation</td>
			<td>0B506-099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">CGP 55845 hydrochloride&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab120337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Calcium chloride&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">D-(+)-Glucose&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Magnesium chloride&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>230391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Paraformaldehyde powder, 95%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Potassium chloride&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Potassium gluconate&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1847</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sodium azide&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sodium bicarbonate&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sodium chloride&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sucrose&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Triton X-100&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Trizma base&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Trizma hydrochloride&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T3253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sodium phosphate dibasic dihydrate&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:239px;"> 
			Sodium phosphate monobasic 
			monohydrate&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:239px;">Biocytin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:159px;">B4261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Alexa Fluor 594 Hydrazide</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:159px;">A10438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:239px;">SR95531 (Gabazine)&#160;</td>
			<td style="width:148px;">Abcam</td>
			<td style="width:159px;">ab120042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;"> 
			Adenosine triphosphate (ATP)-Tris</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:239px;"> 
			Guanosine (GTP)-Na+</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;"> 
			Oregon Green BAPTA-1</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>O6812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;"> 
			Phosphocreatine di(tris) salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;"> 
			Streptavidin-conjugated Alexa-546</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>S11225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:239px;"> 
			Patch Borosilicate Glass Capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>1B100F-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:239px;"> 
			Theta Borosilicate Glass Capillaries</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>BT-150-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:239px;"> 
			P-97 Flaming/Brown Micropipette puller</td>
			<td style="width:148px;">Sutter Instrument</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:239px;"> 
			TCS SP5 Confocal Multiphoton Microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:239px;"> 
			Chameleon Ultra II Ti:Sapphire multiphoton laser&#160;</td>
			<td>Coherent</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">LAS AF Imaging Acquisition Software</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;"> 
			Temperature Controller TC-324B</td>
			<td style="width:148px;">Warner Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:239px;"> 
			MultiClamp 700B Amplifier</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;"> 
			Digidata 1440A Digitizer</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;"> 
			Confocal Translator</td>
			<td style="width:148px;">Siskiyou</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;"> 
			Micromanipulator</td>
			<td style="width:148px;">Siskiyou</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;"> 
			pClamp Data Acquisition Software</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:239px;"> 
			A365 Constant Current Stimulus Isolator</td>
			<td style="width:148px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;"> 
			Vibraplane Optical Table</td>
			<td style="width:148px;">Kinetic Systems</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

two-photon calcium imaging in neuronal dendrites in brain slices

הדמיית סידן (Ca2 +) הוא כלי רב עוצמה כדי לחקור את הדינמיקה ייתכן של אותות תאיים2 + Ca בדנדריטים עצביים. Ca2 + תנודות יכול להתרחש באמצעות מגוון רחב של הממברנה, מנגנונים תאיים, לשחק תפקיד מכריע של אינדוקציה של פלסטיות סינפטית, ויסות דעתנית דנדריטים. מכאן, היכולת להקליט סוגים שונים של Ca2 + אותות בענפים דנדריטים הוא יקר עבור קבוצות לומדים איך דנדריטים לשלב מידע. כניסתו של מיקרוסקופ שני הפוטונים עשה מחקרים כאלה קל יותר באופן משמעותי על ידי פתרון הבעיות כדי הדמיה ברקמה חיה, כגון פיזור אור, נזקי. יתר על כן, באמצעות שילוב של שיטות אלקטרופיזיולוגיות קונבנציונאלי עם שני הפוטונים Ca2 + הדמיה, זה אפשרי לחקור המקומי Ca2 + תנודות דנדריטים עצביים במקביל עם הקלטות של פעילות סינפטית סומה. כאן, אנו נתאר כיצד להשתמש בשיטה זו כדי ללמוד את הדינמיקה של רשות מקומית2 + תופעות מעבר (חתולים) בדנדריטים של GABAergic interneurons מעכבות. השיטה ניתן להחיל גם ללמוד דנדריטים Ca2 + איתות סוגים עצביים במוח חריפה פרוסות.

באמצעות פרוטוקול המובאת כאן, השגנו חתולים עורר סומאטית נוכחי הזרקת ועל ידי גירוי חשמלי של דנדריטים של oriens/alveus interneurons באזור CA1 של ההיפוקמפוס. לאחר תיקון נוירון, מזוהה המבוסס על הצורה והמיקום שלה, השגנו linescans על פני דנדריט הפרוקסימלית נקודות מרובות-נתן מרחקים סומא (<strong class="x...

Watch this Scientific Journal Video about Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices at JoVE.com

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

שני הפוטונים סידן הדמיה של דנדריטים עצביים במוח פרוסות

אנו מציגים שיטת שילוב תאים כל תיקון-קלאמפ הקלטות והדמיה שני הפוטונים להקליט את Ca2 + שנחשולי דנדריטים עצביים במוח חריפה פרוסות.

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices

תגובות סידן הדמיה בנוירונים GFP-tagged של פרוסות מוח עכבר ההיפותלמוס

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the ...

Voltage-sensitive Dye Recording from Axons, Dendrites and Dendritic Spines of Individual Neurons in Brain Slices

הקלטת דיי מתח רגישה מהאקסונים, הדנדריטים וקוצים הדנדריטים של נוירונים בודדים בפרוסות מוח

Understanding the biophysical properties and functional organization of single neurons and how they process information is fundamental for understanding ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

קלטות אלקטרו כפולות של תגובות Astroglial ועצביות עוררו-synaptically בפרוסות ביפוקמפוס חריפות

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

בהדמיה עצבית סיד vivo ב C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Ablation of a Neuronal Population Using a Two-photon Laser and Its Assessment Using Calcium Imaging and Behavioral Recording in Zebrafish Larvae

אבלציה של אוכלוסיה עצביים באמצעות לייזר שני הפוטונים והערכה שלה באמצעות הדמיית סידן והקלטה התנהגותית הזחלים דג זברה

To identify the role of a subpopulation of neurons in behavior, it is essential to test the consequences of blocking its activity in living animals. Laser ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

אין ויוו שני הפוטונים הדמיה של נוירונים בקליפת המוח בעכברים Neonatal

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...

Two-photon Imaging of Microglial Processes' Attraction Toward ATP or Serotonin in Acute Brain Slices

שני הפוטונים הדמיה של תהליכים Microglial המשיכה לכיוון ATP או סרוטונין המוח חריפה פרוסות

Microglial cells are resident innate immune cells of the brain that constantly scan their environment with their long processes and, upon disruption of ...

Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina

הדמיה טרנס-אימונית של שני פוטונים In vivo של רשתית העכבר

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

אין ויוו הדמיית סידן בעכבר זית נחות

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the ...

In Vivo Wide-Field and Two-Photon Calcium Imaging from a Mouse Using a Large Cranial Window

In Vivo Wide-Field and Two-Photon Calcium Imaging from a Mouse Using a Large Cranial Window

אין ויוו הדמיית סידן בשדה רחב ושני פוטונים מעכבר באמצעות חלון גולגולתי גדול

Wide-field calcium imaging from the mouse&#39;s neocortex allows one to observe cortex-wide neural activity related to various brain functions. On the ...