Name: two-photon calcium imaging in neuronal dendrites in brain slices
Uploaded: 2018-03-15T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices at JoVE.com

Detta arbete stöds av kanadensiska institut för hälsa forskning, naturvetenskaplig och teknisk forskning rådet (NSERC Discovery Grant) och stiftelsen Savoy. OC stöddes av en Ph.D. stipendium från NSERC.

Alla experimenten utfördes enligt riktlinjerna som djurskydd djur skydd kommittén av Université Lavaldomen och kanadensiska rådets på djur vård.
1. inledande förberedelser (tillval: förbereda 1 dag i förväg)
<ol><li>Förbered tre typer av konstgjorda cerebrospinalvätska (ACSF) lösning (Normal, sackaros och återställningslösningar, 1 L varje, se tabell 1). Justera osmolalitet av lösningar till 300 ± 10 mOsm25 och cool ACSF-sackaros ner...

<ol>
	<li>Williams, S. R., Mitchell, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+measurement+of+somatic+voltage+clamp+errors+in+central+neurons.">Direct measurement of somatic voltage clamp errors in central neurons.</a> Nat Neurosci. 7, 790-798 (2008).</li><li>Denk, W., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photon+upmanship:+why+multiphoton+imaging+is+more+than+a+gimmick.">Photon upmanship: why multiphoton imaging is more than a gimmick.</a> Neuron. 18, 351-357 (1997).</li><li>Yuste, R., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+spines+as+basic+functional+units+of+neuronal+integration.">Dendritic spines as basic functional units of neuronal integration.</a> Nature. 375, 682-684 (1995).</li><li>Nimchinsky, E. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+Function+of+Dendritic+Spines.">Structure and Function of Dendritic Spines.</a> Annu Rev Physiol. 64, 313-353 (2002).</li><li>Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+calcium+channels+in+single+spines+using+optical+fluctuation+analysis.">Analysis of calcium channels in single spines using optical fluctuation analysis.</a> Nature. 408, 589-593 (2000).</li><li>Mainen, Z. F., Malinow, R., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+calcium+transients+in+single+spines+indicate+that+NMDA+receptors+are+not+saturated.">Synaptic calcium transients in single spines indicate that NMDA receptors are not saturated.</a> Nature. 399, 151-155 (1999).</li><li>Yasuda, R., Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+of+calcium+channels+in+dendritic+spines.">Plasticity of calcium channels in dendritic spines.</a> Nat Neurosci. 6, 948-955 (2003).</li><li>Carter, A. G., Sabatini, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=State-dependent+calcium+signaling+in+dendritic+spines+of+striatal+medium+spiny+neurons.">State-dependent calcium signaling in dendritic spines of striatal medium spiny neurons.</a> Neuron. 44, 483-493 (2004).</li><li>Topolnik, L., Congar, P., Lacaille, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+of+metabotropicglutamate+receptor-+and+AMPA+receptor-mediated+dendritic+Ca2++signals+by+presynaptic+and+postsynaptic+activity+in+hippocampal+interneurons.">Differential regulation of metabotropicglutamate receptor- and AMPA receptor-mediated dendritic Ca2+ signals by presynaptic and postsynaptic activity in hippocampal interneurons.</a> J Neurosci. 25, 990-1001 (2005).</li><li>Topolnik, L., Chamberland, S., Pelletier, J. G., Ran, I., Lacaille, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+compartmentalized+regulation+of+dendritic+Ca2++signaling+in+hippocampal+interneurons.">Activity-dependent compartmentalized regulation of dendritic Ca2+ signaling in hippocampal interneurons.</a> J Neurosci. 29, 4658-4663 (2009).</li><li>Camir&#233;, O., Topolnik, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+calcium+nonlinearities+switch+the+direction+of+synaptic+plasticity+in+fast-spiking+interneurons.">Dendritic calcium nonlinearities switch the direction of synaptic plasticity in fast-spiking interneurons.</a> J Neurosci. 34, 3864-3877 (2014).</li><li>Jaffe, D. B., Johnston, D., Lasser-Ross, N., Lisman, J. E., Miyakawa, H., Ross, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thespread+of+Na++spikes+determines+the+pattern+of+dendritic+Ca2++entry+into+hippocampal+neurons.">Thespread of Na+ spikes determines the pattern of dendritic Ca2+ entry into hippocampal neurons.</a> Nature. 357, 244-246 (1992).</li><li>Nakamura, T., Barbara, J. G., Nakamura, K., Ross, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+release+of+Ca2++from+IP3-sensitive+stores+evoked+by+synaptic+activation+of+mGluRs+paired+with+backpropagating+action+potentials.">Synergistic release of Ca2+ from IP3-sensitive stores evoked by synaptic activation of mGluRs paired with backpropagating action potentials.</a> Neuron. 24, 727-737 (1999).</li><li>Kovalchuk, Y., Eilers, J., Lisman, J., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMDA+receptor-mediated+subthreshold+Ca(2+)+signals+in+spines+of+hippocampal+neurons.">NMDA receptor-mediated subthreshold Ca(2+) signals in spines of hippocampal neurons.</a> J Neurosci. 20, 1791-1799 (2000).</li><li>Goldberg, J. H., Yuste, R., Tamas, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2++imaging+of+mouse+neocortical+interneurone+dendrites:+contribution+of+Ca2+-permeable+AMPA+and+NMDA+receptors+to+subthreshold+Ca2++dynamics.">Ca2+ imaging of mouse neocortical interneurone dendrites: contribution of Ca2+-permeable AMPA and NMDA receptors to subthreshold Ca2+ dynamics.</a> J Physiol. 551, 67-78 (2003).</li><li>Goldberg, J. H., Lacefield, C. O., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+dendritic+calcium+spikes+in+mouselayer+5+low+threshold+spiking+interneurones:+implications+for+control+of+pyramidal+cell+bursting.">Global dendritic calcium spikes in mouselayer 5 low threshold spiking interneurones: implications for control of pyramidal cell bursting.</a> J Physiol. 558, 465-478 (2004).</li><li>Oertner, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+imaging+of+single+synapses+in+brain+slices.">Functional imaging of single synapses in brain slices.</a> Exp Physiol. 87, 733-736 (2002).</li><li>Yasuda, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+calcium+concentration+dynamics+in+small+neuronal+compartments.">Imaging calcium concentration dynamics in small neuronal compartments.</a> Sci STKE. 219, pl5 (2004).</li><li>Maravall, M., Mainen, Z. F., Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimating+intracellular+calcium+concentrations+and+buffering+without+wavelength+rationing.">Estimating intracellular calcium concentrations and buffering without wavelength rationing.</a> Biophys J. 78, 2655-2667 (2000).</li><li>Camir&#233;, O., Topolnik, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+compartmentalization+and+regulation+of+postsynaptic+CaTs+in+inhibitory+interneurons.">Functional compartmentalization and regulation of postsynaptic CaTs in inhibitory interneurons.</a> Cell Calcium. 52, 339-346 (2012).</li><li>Guet-McCreight, A., Camir&#233;, O., Topolnik, L., Skinner, F. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+a+semi-automated+strategy+to+develop+multi-compartment+models+that+predict+biophysical+properties+of+interneuron-specific+3+(IS3)+cells+in+hippocampus.">Using a semi-automated strategy to develop multi-compartment models that predict biophysical properties of interneuron-specific 3 (IS3) cells in hippocampus.</a> eNeuro. 3, 1-26 (2016).</li><li>Evstratova, A., Chamberland, S., Topolnik, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+and+activity-dependent+dynamics+of+action+potential-evoked+Ca2++signals+in+dendrites+of+hippocampal+inhibitory+interneurons.">Cell type-specific and activity-dependent dynamics of action potential-evoked Ca2+ signals in dendrites of hippocampal inhibitory interneurons.</a> J Physiol. 589, 1957-1977 (2011).</li><li>Topolnik, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+calcium+mechanisms+and+long-term+potentiation+in+cortical+inhibitory+interneurons.">Dendritic calcium mechanisms and long-term potentiation in cortical inhibitory interneurons.</a> Eur J Neurosci. 35, 496-506 (2012).</li><li>Camir&#233;, O., Lacaille, J. C., Topolnik, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+Signaling+in+Inhibitory+Interneurons:+Local+Tuning+via+Group+I+Metabotropic+Glutamate+Receptors.">Dendritic Signaling in Inhibitory Interneurons: Local Tuning via Group I Metabotropic Glutamate Receptors.</a> Front Physiol. 3, 259 (2012).</li><li>Bourque, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+mechanisms+of+osmosensation+and+systemic+osmoregulation.">Central mechanisms of osmosensation and systemic osmoregulation.</a> Nat RevNeurosci. 9, 519-531 (2008).</li><li>Aghajanian, G. K., Rasmussen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+studies+in+the+facial+nucleus+illustrating+a+simple+new+method+for+obtaining+viable+motoneurons+in+adult+rat+brain+slices.">Intracellular studies in the facial nucleus illustrating a simple new method for obtaining viable motoneurons in adult rat brain slices.</a> Synapse. 3, 331-338 (1989).</li><li>Pettit, D. L., Wang, S. S., Gee, K. R., Augustine, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+two-photon+uncaging:+anovel+approach+to+mapping+glutamate+receptors.">Chemical two-photon uncaging: anovel approach to mapping glutamate receptors.</a> Neuron. 19, 465-471 (1997).</li><li>Salom&#233;, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+random-access+scanning+in+two-photon+microscopy+usingacousto-optic+deflectors.">Ultrafast random-access scanning in two-photon microscopy usingacousto-optic deflectors.</a> J Neurosci Methods. 154, 161-174 (2006).</li><li>Lechleiter, J. D., Lin, D. T., Sieneart, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-photon+laser+scanning+microscopy+using+an+acoustic+optical+deflector.">Multi-photon laser scanning microscopy using an acoustic optical deflector.</a> Biophys J. 83, 2292-2299 (2002).</li></ol>

Den metod som visas här visar hur kombinationen av två-photon Ca2 + imaging och patch-clamp elektrofysiologi kan användas för att studera dendritiska Ca2 + signalering i nervcellernas dendriter i akut hjärnskada skivor. Denna metod tillåter övervakning av både den lokala Ca2 + förhöjda frammanade av elektrisk stimulering eller backpropagating AP i dendritiska segment och cellens somatiska svar. Detta gör det ett utmärkt verktyg att studera hur olika delar av trädet dendritisk...

Bidraget av en neuron till nätverksaktivitet bestäms till stor del av den dynamiska karaktären av de synaptic ingångarna som det mottar. Traditionellt, åberopade den dominerande metoden för att karaktärisera synaptisk aktivitet i nervceller somatiska hela-cell patch-clamp inspelningar av postsynaptiska strömmar frammanade genom elektrisk stimulering av axoner av passagen. Enda verksamhet som proximalt belägna synapserna rapporteras dock sanningsenligt i detta fall1. Dessutom, för att bedöma de synaps-specifika mekanismerna, har inspelningar från par av nervceller och dendriter på en viss plats använts att rikta synapserna sevärdheter och mekanismerna för dendritiska integration, respektive. Ett stort genombrott i fältet i synaptic fysiologi uppnåddes genom ett äktenskap mellan optisk och elektrofysiologiska tekniker. Två-foton excitation laserscanning mikroskopi (2PLSM) i kombination med Ca2 + imaging och optogenetic verktyg kan avslöja enorma Detaljer för den dynamiska organisationen av synaptisk aktivitet på specifika neuronala anslutningar i hjärnan skivor i vitro och in-vivo.
Flera viktiga fördelar gjorde 2PLSM sticker ut från den konventionella, one-photon excitation mikroskopi2: (1) på grund av en ickelinjär natur av två-photon excitation, fluorescensen skapas endast i focal volymen och alla avgivna fotonerna representerar användbara signaler (inget behov för pinhole); (2) längre våglängder, används i 2PLSM, penetrera scattering vävnaden mer effektivt; spridda fotoner är dessutom alltför utspädd att producera två-photon excitation och bakgrunden fluorescens; (3) photodamage och fototoxicitet är också begränsad till fokalplanet. Trots den höga kostnaden av 2-foton system jämfört med konventionella confocal Mikroskop förblir 2PLSM därför en metod för val av högupplösta utredning av neuronala struktur och funktion i tjock levande vävnad.
Den första tillämpningen av 2PLSM i scattering vävnad var att bild struktur och funktion av Dendritutskotten3. 2PLSM i kombination med Ca2 + imaging har avslöjat att spines funktion som isolerade biokemiska fack. Sedan i många neuronala typer finns det en one-to-one överensstämmelse mellan ryggar och enskilda synapserna4, blev två-photon Ca2 + imaging snart ett användbart verktyg för rapportering av enskilda synapserna i intakt vävnad5, 6,7,8. 2PLSM-baserade Ca2 + imaging har dessutom framgångsrikt använts för att övervaka aktiviteten hos enda kalciumkanaler och ickelinjära samspelet mellan de inneboende och synaptic conductances, samt att bedöma den statliga - och aktivitet-beroende reglering av Ca2 + signalering i nervcellernas dendriter5,6,7,8,9,10,11.
Kalcium är en allestädes närvarande intracellulära andra budbärare, och dess subcellulär spatiotemporal organisation bestämmer riktningen av fysiologiska reaktioner, från förändringar i synaptisk styrka till regleringen av ion kanaler, dendrite och ryggraden tillväxt, som samt celldöd och överlevnad. Dendritiska Ca2 + höjder uppstå via aktivering av flera vägar. Handlingspänningar (APs), backpropagating till dendriter, öppnar spänningskänsliga kalcium kanaler12 och producera relativt globala Ca2 + transienter (katter) i dendriter och ryggar13. Synaptisk transmission är associerad med aktivering av postsynaptiska Ca2 +-permeable receptorer (NMDA, Ca2 +-genomsläpplig AMPA och kainate), utlöser synaptic katter6,14,15. Slutligen kan supralinear Ca2 + händelser genereras i dendriter enligt vissa villkor11,12,13,16.
Två-foton Ca2 + imaging i kombination med patch-clamp elektrofysiologiska inspelningar sysselsätter syntetiska Ca2 +-känsliga fluorescerande indikatorer som levereras vanligtvis via lapp elektroden under hela-cell recordings . En schablonmässig metod för kvantifiering av Ca2 + dynamics är baserad på den dubbla indikator metod17,18. Den använder två fluorophores med väl separerade utsläpp spectra (t.ex., en kombination av en röd Ca2 +-okänsliga färgämne med grön Ca2 + indikatorer, såsom Oregon grön BAPTA-1 eller Fluo-4) och har flera fördelar jämfört med den enskild indikator metod. Första, en Ca2 +-okänsliga dye används för att leta upp små strukturer av intresse (dendritiska grenar och taggar) där Ca2 + avbildning kommer att utföras. Det andra beräknas förhållandet mellan förändringen i grön och röd fluorescens (ΔG/R) som ett mått på [Ca2 +], vilket är i stort sett okänsliga för förändringar i baslinjen fluorescens på grund av fluktuationer i [Ca2 +]017 , 18. Dessutom fluorescens förändringar kan kalibreras när det gäller absoluta Ca2 + koncentrationer19.
En allmän oro när kör två-photon Ca2 + imaging experiment i akut skivor är cell hälsa och stabilitet av förvärvet bild på grund av den höga lasereffekt som vanligtvis används. Dessutom finns Ca2 + imaging experiment, oro om störning och betydande överskattning av subcellulär Ca2 + dynamics på grund av att Ca2 + indikatorer fungera som lättrörliga exogena Ca2 + buffertar. Alltså, valet av Ca2 + indikatorn och dess koncentration beror på typ av neuronala, förväntade amplituden av katter och på experimentell frågan.
Vi anpassat metoden för två-photon Ca2 + imaging för utredning av Ca2 + fluktuationer i dendriter GABAergic interneuroner9,10,11,20,21 , 22. medan huvuddelen av tidig Ca2 + imaging studier var gjort i huvudsakliga nervceller, hämmande interneuroner Visa upp en stor mängd funktionella Ca2 + mekanismer som skiljer sig från dem i pyramidala celler20 , 23 , 24. dessa interneuron-specifika mekanismer (t.ex., Ca2 + genomsläpplig AMPA-receptorer) kan spela specifika roller i reglera cellernas aktivitet. Dendritiska Ca2 + signalering i interneuronen är ett lockande mål för vidare utredning, presenterar två-photon Ca2 + imaging i dendriter av dessa celler ytterligare utmaningar, från en tunnare diameter av dendriter och avsaknaden av taggar till en särskilt hög endogen Ca2 + bindande kapacitet. Som vårt forskningsintresse fokuserar på studier av hippocampus interneuroner, anpassades följande protokoll, medan gäller för olika neuronala populationer, till ta itu med dessa utmaningar.
Detta protokoll avrättades med en kommersiell confocal två-foton Mikroskop, som var utrustad med två externa, icke-descanned detektorer (NPF), Elektro-optiska modulator (EOM) och en Dodt skanning gradient kontrast (SGC), och installeras på en optisk tabell. Mikroskopet var förenat med en multiphoton TI: safirlaser läge-låst vid 800 nm (> 3 W, 140 fs pulser, 80 Hz repetition rate). Bildsystem var utrustad med en standard elektrofysiologi rigg, inklusive en perfusion kammare med en översättning plattform med två micromanipulators, en digitizer, en datorstyrd mikroelektrod förstärkare, temperaturkontroll, en stimulering enheten, och data förvärv programvara.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="608">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:239px;">Animal Strain: Mouse CD1&#160;</td>
			<td style="width:148px;">Charles River</td>
			<td style="width:159px;">022</td>
			<td style="width:63px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:239px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:148px;">AbbVie Corporation</td>
			<td>0B506-099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">CGP 55845 hydrochloride&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab120337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Calcium chloride&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">D-(+)-Glucose&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Magnesium chloride&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>230391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Paraformaldehyde powder, 95%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Potassium chloride&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Potassium gluconate&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1847</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sodium azide&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sodium bicarbonate&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sodium chloride&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sucrose&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Triton X-100&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Trizma base&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Trizma hydrochloride&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T3253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sodium phosphate dibasic dihydrate&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:239px;"> 
			Sodium phosphate monobasic 
			monohydrate&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:239px;">Biocytin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:159px;">B4261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Alexa Fluor 594 Hydrazide</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:159px;">A10438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:239px;">SR95531 (Gabazine)&#160;</td>
			<td style="width:148px;">Abcam</td>
			<td style="width:159px;">ab120042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;"> 
			Adenosine triphosphate (ATP)-Tris</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:239px;"> 
			Guanosine (GTP)-Na+</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;"> 
			Oregon Green BAPTA-1</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>O6812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;"> 
			Phosphocreatine di(tris) salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;"> 
			Streptavidin-conjugated Alexa-546</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>S11225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:239px;"> 
			Patch Borosilicate Glass Capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>1B100F-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:239px;"> 
			Theta Borosilicate Glass Capillaries</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>BT-150-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:239px;"> 
			P-97 Flaming/Brown Micropipette puller</td>
			<td style="width:148px;">Sutter Instrument</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:239px;"> 
			TCS SP5 Confocal Multiphoton Microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:239px;"> 
			Chameleon Ultra II Ti:Sapphire multiphoton laser&#160;</td>
			<td>Coherent</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">LAS AF Imaging Acquisition Software</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;"> 
			Temperature Controller TC-324B</td>
			<td style="width:148px;">Warner Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:239px;"> 
			MultiClamp 700B Amplifier</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;"> 
			Digidata 1440A Digitizer</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;"> 
			Confocal Translator</td>
			<td style="width:148px;">Siskiyou</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;"> 
			Micromanipulator</td>
			<td style="width:148px;">Siskiyou</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;"> 
			pClamp Data Acquisition Software</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:239px;"> 
			A365 Constant Current Stimulus Isolator</td>
			<td style="width:148px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;"> 
			Vibraplane Optical Table</td>
			<td style="width:148px;">Kinetic Systems</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

two-photon calcium imaging in neuronal dendrites in brain slices

Kalcium (Ca2 +) bildbehandling är ett kraftfullt verktyg för att undersöka spatiotemporal dynamiken i intracellulära Ca2 + signaler i nervcellernas dendriter. Ca2 + fluktuationer kan uppstå genom en mängd olika membran och intracellulära mekanismer och spelar en avgörande roll i induktion av synaptisk plasticitet och reglering av dendritiska retbarhet. Därför är möjligheten att spela in olika typer av Ca2 + signaler i dendritiska grenar värdefulla för grupper studerar hur dendriter integrera information. Tillkomsten av 2-foton mikroskopi har gjort sådana studier betydligt lättare genom att lösa problem som är förbundna med imaging i levande vävnad, såsom ljusspridning och åldrad hud. Genom kombination av konventionella elektrofysiologiska tekniker med två-photon Ca2 + imaging, är det dessutom möjligt att undersöka lokala Ca2 + fluktuationer i nervcellernas dendriter parallellt med inspelningar av synaptisk aktivitet i Soma. Här beskrivs hur man använder denna metod för att studera dynamiken i lokala Ca2 + transienter (katter) i dendriter av GABAergic hämmande interneuroner. Metoden kan tillämpas även på studera dendritiska Ca2 + signalering i olika neuronala typer i akut hjärnskada skivor.

Med hjälp av protokollet som presenteras här, fick vi katter frammanade genom somatiska nuvarande injektion och elektrisk stimulering i dendriter av oriens/alveus interneuroner i området CA1 i hippocampus. Efter lapp en neuron, identifieras baserat på dess form och ställning, förvärvade vi linescans över en proximal dendrite på flera punkter givit avstånd från soma (figur 1A). Vi observerat en minskning av amplituden av katter som induceras av back...

Watch this Scientific Journal Video about Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices at JoVE.com

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Två-foton kalcium Imaging i nervcellernas dendriter i hjärnan skivor

Vi presenterar en metod som kombinerar hela-cell patch-clamp inspelningar och två-photon imaging för att spela in Ca2 + transienter i nervcellernas dendriter i akut hjärnskada skivor.

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices

Imaging Kalcium svar i GFP-märkta neuroner i hypotalamus skivor mushjärna

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the ...

Voltage-sensitive Dye Recording from Axons, Dendrites and Dendritic Spines of Individual Neurons in Brain Slices

Spänningskänsliga Dye Inspelning från axoner, dendriter och Dendritutskotten av enskilda nervceller i hjärnan skivor

Understanding the biophysical properties and functional organization of single neurons and how they process information is fundamental for understanding ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Dubbla Elektrofysiologiska Inspelningar av synaptiskt-framkallade astrogliala och neuronala svar i akut hippocampus skivor

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

In vivo Neuronal kalcium Imaging i C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Ablation of a Neuronal Population Using a Two-photon Laser and Its Assessment Using Calcium Imaging and Behavioral Recording in Zebrafish Larvae

Ablation av neuronala invånare använder en två-photon Laser och sin bedömning med kalcium Imaging och beteendemässiga inspelning i zebrafiskar larver

To identify the role of a subpopulation of neurons in behavior, it is essential to test the consequences of blocking its activity in living animals. Laser ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

In Vivo Två-foton avbildning av kortikala nervceller hos neonatala möss

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...

Two-photon Imaging of Microglial Processes' Attraction Toward ATP or Serotonin in Acute Brain Slices

Två-foton avbildning av mikrogliala processerna attraktion mot ATP eller Serotonin i akut hjärnskada skivor

Microglial cells are resident innate immune cells of the brain that constantly scan their environment with their long processes and, upon disruption of ...

Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina

Transpupillär tvåfotoner in vivo-avbildning av musens näthinna

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

In vivo Kalciumavbildning i mus underlägsen oliv

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the ...

In Vivo Wide-Field and Two-Photon Calcium Imaging from a Mouse Using a Large Cranial Window

In Vivo Wide-Field and Two-Photon Calcium Imaging from a Mouse Using a Large Cranial Window

In vivo Bredfälts- och tvåfotonkalciumavbildning från en mus med ett stort kranialfönster

Wide-field calcium imaging from the mouse&#39;s neocortex allows one to observe cortex-wide neural activity related to various brain functions. On the ...