Name: a kinetic fluorescence-based ca2+ mobilization assay to identify g protein-coupled receptor agonists, antagonists, and allosteric modulators
Uploaded: 2018-02-20T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Kinetic Fluorescence-based Ca2+ Mobilization Assay to Identify G Protein-coupled Receptor Agonists, Antagonists, and Allosteric Modulators at JoVE.com

Авторы хотели бы поблагодарить Эрик Фонтейн и Geert Schoofs за отличную техническую помощь. Эта работа была поддержана ку Лёвен (Грант нет. PF/10/018), фондах воор Wetenschappelijk институте (FWO, Грант нет. G.485.08) и Фонд Dormeur Вадуц.

Примечание: Все шаги, описанные в разделах 1 и 2 проводятся в стерильных условиях в поток Ламинарный шкаф.
1. поддержание U87. CD4.hCXCR4 клетки
<ol><li>Рост клеток в колбах T75 культуры при 37 ° C и 5% CO2 в увлажненные инкубатора. Примечание: В пробирке клеток линии использует...

<ol>
	<li>Pierce, K. L., Premont, R. T., Lefkowitz, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seven-transmembrane+receptors.">Seven-transmembrane receptors.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 3, 639-650 (2002).</li><li>Fredriksson, R., Lagerstrom, M. C., Lundin, L. G., Schioth, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+G-protein-coupled+receptors+in+the+human+genome+form+five+main+families.+Phylogenetic+analysis,+paralogon+groups,+and+fingerprints.">The G-protein-coupled receptors in the human genome form five main families. Phylogenetic analysis, paralogon groups, and fingerprints.</a> Mol Pharmacol. 63, 1256-1272 (2003).</li><li>Lappano, R., Maggiolini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G+protein-coupled+receptors:+novel+targets+for+drug+discovery+in+cancer.">G protein-coupled receptors: novel targets for drug discovery in cancer.</a> Nat Rev Drug Discov. 10, 47-60 (2011).</li><li>Zhang, R., Xie, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+for+GPCR+drug+discovery.">Tools for GPCR drug discovery.</a> Acta Pharmacol Sin. 33, 372-384 (2012).</li><li>Milligan, G., Kostenis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterotrimeric+G-proteins:+a+short+history.">Heterotrimeric G-proteins: a short history.</a> Br J Pharmacol. 147, S46-S55 (2006).</li><li>Tuteja, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+through+G+protein+coupled+receptors.">Signaling through G protein coupled receptors.</a> Plant Signal Behav. 4, 942-947 (2009).</li><li>Neves, S. R., Ram, P. T., Iyengar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G+protein+pathways.">G protein pathways.</a> Science. 296, 1636-1639 (2002).</li><li>Smith, J. S., Rajagopal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+beta-Arrestins:+Multifunctional+Regulators+of+G+Protein-coupled+Receptors.">The beta-Arrestins: Multifunctional Regulators of G Protein-coupled Receptors.</a> J Biol Chem. 291, 8969-8977 (2016).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+non-peptide+small+molecular+CXCR4+antagonists+as+anti-HIV+agents:+Recent+advances+and+future+opportunities.">Discovery of non-peptide small molecular CXCR4 antagonists as anti-HIV agents: Recent advances and future opportunities.</a> Eur J Med Chem. 114, 65-78 (2016).</li><li>Chatterjee, S., Behnam Azad, B., Nimmagadda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intricate+role+of+CXCR4+in+cancer.">The intricate role of CXCR4 in cancer.</a> Adv Cancer Res. 124, 31-82 (2014).</li><li>Debnath, B., Xu, S., Grande, F., Garofalo, A., Neamati, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecule+inhibitors+of+CXCR4.">Small molecule inhibitors of CXCR4.</a> Theranostics. 3, 47-75 (2013).</li><li>Tsou, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+CXCR4+antagonists+in+stem+cell+mobilization,+HIV+infection,+ischemic+diseases,+and+oncology.">Harnessing CXCR4 antagonists in stem cell mobilization, HIV infection, ischemic diseases, and oncology.</a> Med Res Rev. , (2017).</li><li>Keating, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plerixafor:+a+review+of+its+use+in+stem-cell+mobilization+in+patients+with+lymphoma+or+multiple+myeloma.">Plerixafor: a review of its use in stem-cell mobilization in patients with lymphoma or multiple myeloma.</a> Drugs. 71, 1623-1647 (2011).</li><li>DiPersio, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+III+prospective+randomized+double-blind+placebo-controlled+trial+of+plerixafor+plus+granulocyte+colony-stimulating+factor+compared+with+placebo+plus+granulocyte+colony-stimulating+factor+for+autologous+stem-cell+mobilization+and+transplantation+for+patients+with+non-Hodgkin's+lymphoma.">Phase III prospective randomized double-blind placebo-controlled trial of plerixafor plus granulocyte colony-stimulating factor compared with placebo plus granulocyte colony-stimulating factor for autologous stem-cell mobilization and transplantation for patients with non-Hodgkin's lymphoma.</a> J Clin Oncol. 27, 4767-4773 (2009).</li><li>Balabanian, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemokine+SDF-1/CXCL12+binds+to+and+signals+through+the+orphan+receptor+RDC1+in+T+lymphocytes.">The chemokine SDF-1/CXCL12 binds to and signals through the orphan receptor RDC1 in T lymphocytes.</a> J Biol Chem. 280, 35760-35766 (2005).</li><li>Burns, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+chemokine+receptor+for+SDF-1+and+I-TAC+involved+in+cell+survival,+cell+adhesion,+and+tumor+development.">A novel chemokine receptor for SDF-1 and I-TAC involved in cell survival, cell adhesion, and tumor development.</a> J Exp Med. 203, 2201-2213 (2006).</li><li>Van Hout, A., D'Huys, T., Oeyen, M., Schols, D., Van Loy, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+cell-based+assays+for+the+identification+and+evaluation+of+competitive+CXCR4+inhibitors.">Comparison of cell-based assays for the identification and evaluation of competitive CXCR4 inhibitors.</a> PLoS One. 12, e0176057 (2017).</li><li>Levoye, A., Balabanian, K., Baleux, F., Bachelerie, F., Lagane, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CXCR7+heterodimerizes+with+CXCR4+and+regulates+CXCL12-mediated+G+protein+signaling.">CXCR7 heterodimerizes with CXCR4 and regulates CXCL12-mediated G protein signaling.</a> Blood. 113, 6085-6093 (2009).</li><li>Wootten, D., Christopoulos, A., Sexton, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+paradigms+in+GPCR+allostery:+implications+for+drug+discovery.">Emerging paradigms in GPCR allostery: implications for drug discovery.</a> Nat Rev Drug Discov. 12, 630-644 (2013).</li><li>Burford, N. T., Watson, J., Bertekap, R., Alt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+the+identification+of+allosteric+modulators+of+G-protein-coupled+receptors.">Strategies for the identification of allosteric modulators of G-protein-coupled receptors.</a> Biochem Pharmacol. 81, 691-702 (2011).</li><li>Hendrix, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety,+pharmacokinetics,+and+antiviral+activity+of+AMD3100,+a+selective+CXCR4+receptor+inhibitor,+in+HIV-1+infection.">Safety, pharmacokinetics, and antiviral activity of AMD3100, a selective CXCR4 receptor inhibitor, in HIV-1 infection.</a> J Acquir Immune Defic Syndr. 37, 1253-1262 (2004).</li><li>Schols, D., Este, J. A., Henson, G., De Clercq, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bicyclams,+a+class+of+potent+anti-HIV+agents,+are+targeted+at+the+HIV+coreceptor+fusin/CXCR-4.">Bicyclams, a class of potent anti-HIV agents, are targeted at the HIV coreceptor fusin/CXCR-4.</a> Antiviral Res. 35, 147-156 (1997).</li><li>Perry, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maraviroc:+a+review+of+its+use+in+the+management+of+CCR5-tropic+HIV-1+infection.">Maraviroc: a review of its use in the management of CCR5-tropic HIV-1 infection.</a> Drugs. 70, 1189-1213 (2010).</li><li>Mehlin, C., Crittenden, C., Andreyka, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=No-wash+dyes+for+calcium+flux+measurement.">No-wash dyes for calcium flux measurement.</a> Biotechniques. 34, 164-166 (2003).</li><li>Zhao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CXCR4+over-expression+and+survival+in+cancer:+a+system+review+and+meta-analysis.">CXCR4 over-expression and survival in cancer: a system review and meta-analysis.</a> Oncotarget. 6, 5022-5040 (2015).</li><li>De Clercq, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+AMD3100+story:+the+path+to+the+discovery+of+a+stem+cell+mobilizer+(Mozobil).">The AMD3100 story: the path to the discovery of a stem cell mobilizer (Mozobil).</a> Biochem Pharmacol. 77, 1655-1664 (2009).</li><li>Milligan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constitutive+activity+and+inverse+agonists+of+G+protein-coupled+receptors:+a+current+perspective.">Constitutive activity and inverse agonists of G protein-coupled receptors: a current perspective.</a> Mol Pharmacol. 64, 1271-1276 (2003).</li><li>Kenakin, T., Miller, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seven+transmembrane+receptors+as+shapeshifting+proteins:+the+impact+of+allosteric+modulation+and+functional+selectivity+on+new+drug+discovery.">Seven transmembrane receptors as shapeshifting proteins: the impact of allosteric modulation and functional selectivity on new drug discovery.</a> Pharmacol Rev. 62, 265-304 (2010).</li><li>Conn, P. J., Christopoulos, A., Lindsley, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allosteric+modulators+of+GPCRs:+a+novel+approach+for+the+treatment+of+CNS+disorders.">Allosteric modulators of GPCRs: a novel approach for the treatment of CNS disorders.</a> Nat Rev Drug Discov. 8, 41-54 (2009).</li><li>Burford, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+positive+allosteric+modulators+and+silent+allosteric+modulators+of+the+mu-opioid+receptor.">Discovery of positive allosteric modulators and silent allosteric modulators of the mu-opioid receptor.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 10830-10835 (2013).</li><li>Bartfai, T., Wang, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positive+allosteric+modulators+to+peptide+GPCRs:+a+promising+class+of+drugs.">Positive allosteric modulators to peptide GPCRs: a promising class of drugs.</a> Acta Pharmacol Sin. 34, 880-885 (2013).</li><li>Hatse, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+CXCL12AF647+as+a+novel+probe+for+nonradioactive+CXCL12/CXCR4+cellular+interaction+studies.">Fluorescent CXCL12AF647 as a novel probe for nonradioactive CXCL12/CXCR4 cellular interaction studies.</a> Cytometry A. 61, 178-188 (2004).</li><li>Seifert, R., Wenzel-Seifert, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constitutive+activity+of+G-protein-coupled+receptors:+cause+of+disease+and+common+property+of+wild-type+receptors.">Constitutive activity of G-protein-coupled receptors: cause of disease and common property of wild-type receptors.</a> Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 366, 381-416 (2002).</li><li>Zhang, W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+point+mutation+that+confers+constitutive+activity+to+CXCR4+reveals+that+T140+is+an+inverse+agonist+and+that+AMD3100+and+ALX40-4C+are+weak+partial+agonists.">A point mutation that confers constitutive activity to CXCR4 reveals that T140 is an inverse agonist and that AMD3100 and ALX40-4C are weak partial agonists.</a> J Biol Chem. 277, 24515-24521 (2002).</li><li>Tamamura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+low-molecular-weight+inhibitor+against+the+chemokine+receptor+CXCR4:+a+strong+anti-HIV+peptide+T140.">A low-molecular-weight inhibitor against the chemokine receptor CXCR4: a strong anti-HIV peptide T140.</a> Biochem Biophys Res Commun. 253, 877-882 (1998).</li><li>Wang, Z. -. x., Neote, K., Letts, G. L., Moser, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Chemokine Biology - Basic Research and Clinical Application: Volume II: Pathophysiology of Chemokines. , 61-77 (2007).</li></ol>

Ca2 +-пробирного мобилизации, описанных ранее было показано, быть ценным инструментом для выявления и характеризуют антагонисты рецепторов, ориентация CXCR417. Однако, ожидается что этот метод может в целом применяться к большой группе других GPCR, которые вызывают цитозол?...

GPCR являются важным надсемейства клеток поверхности белков, которые активируют каскады трансдукции сигнала внеклеточных лигандов привязки. Они могут быть активированы широкий спектр стимулов, включая пептиды, белки гормоны, биогенные амины и липиды, что приводит к инициации различных внутриклеточных сигнальных путей и в конечном итоге биологических реакций1,2 . Кроме того GPCR участвуют во многих, если не все, развития и физиологических процессов и многих заболеваний человека связаны с неблагополучной GPCR сигнализации или рецептор гиперэкспрессия. GPCR, поэтому среди самых проверенных фармакологических целей в медицине1,3.
Как правило рабочий процесс обнаружения наркотиков ХВГФ начинается с сотовой скрининг анализов, способствующих выявлению соединений, таких как малые молекулы, моноклональных антител и пептиды, которые можно модулировать активность конкретного GPCR. В GPCR лекарств, что существует множество различных типов анализов для поиска таких соединений большинство из которых являются совместимыми с середины - для высокопроизводительного скрининга кампаний. Наиболее часто используемые анализы включают в себя эксперименты связывания рецептора, флуоресценции или свечения на основе обнаружения колебания уровня так называемых вторичных посыльных (например, Ca2 +, циклический аденозинмонофосфат (AMP)), фенотипические анализы отбор проб и β-arrestin набора assays4. Выбор для конкретного типа assay может зависеть от нескольких факторов, но также определяется предварительного знания, касающиеся сигнальных свойства данного GPCR. Агонист, привязка к ХВГФ вызывает конформационные изменения, катализирующих обмена дифосфат (ВВП) гуанидина для гуанидина трифосфата (GTP) на α-субъединица гетеротримерные G белков. Впоследствии Gα-GTP Субблок дистанцируется от субъединицаβγ G, и оба подразделения будут инициировать дальнейшие сигнальных путей. Гидролиз GTP-молекулы и последующего повторного ассоциации Gα- ВВП и Gβγ подразделений будет восстановить G-белка в ее неактивной конформации5,6. Основываясь на последовательность сходства субъединицы Gα определены различные типы G белков (Gs, G,i, Gq, G12/13)7. Сигнализации через Gα Субблок дает подняться несколько типичных ответы, такие как увеличение (через Gs) или уменьшить (через G,я) ЦАМФ производства и внутриклеточных Ca2 + мобилизации (через Gq)5 ,7. Gβγ субблоков могут также заставить внутриклеточные эффекторные пути. Например, после активации G,я-спаренных GPCR, Gβγ может непосредственно стимулировать фосфолипазы С (PLC-β) производить инозитол трифосфата (IP-3), который вызывает выпуск Ca2 + от внутриклеточного магазинов7 . После активации рецептора являются фосфорилированных GPCR, GPCR киназ (GRK), что способствует взаимодействию с β-arrestins. Этот процесс завершается G белка сигнализации и приводит к рецепторов десенсибилизации и в конечном итоге интернализации. Β-arrestins также возможность формирования различных молекулярных комплексов, которые могут вызвать другие сигнальные пути, независимо от сигнализации8G-белка.
В подсемейство хемокиновых рецепторов, Gя-спаренных CXCR4 является GPCR, вызвавший большой интерес как перспективные цели для обнаружения наркотиков. Учитывая ее созданы роль как основных ко-рецептор для вируса иммунодефицита человека 1 (HIV-1) вирусный вход и инфекции, соединений, ориентация CXCR4 были первоначально разработаны как анти-ВИЧ наркотиков кандидатов9. Совсем недавно растущее количество доказательств указал на важную роль для CXCR4 опухолей и рака метастаз, что делает его хорошо проверенных терапевтических цели в онкологии, а также в10. CXCR4 высоко выражается в более чем двадцати видов человеческих раковых и выживание клетки опухоли контроля, распространение и миграции, а также ангиогенез опухоли, относящиеся10. Антагонисты CXCR4 различных химических классов ранее были описаны11,,12, но только малые молекулы, которые AMD3100 в настоящее время одобрен для использования в клинике как агент мобилизации стволовых клеток, используемый во время лечения лимфомы и больных миеломой13,14. Клинические испытания проводятся для оценки безопасности и эффективности нескольких других антагонистов CXCR4 в различных заболеваний человека, но с особым упором на онкологии12. Учитывая многие потенциальные приложения CXCR4 антагонистов, поиск новых соединений с улучшенные фармакокинетические свойства, повышение биодоступности или потенциально меньше побочных эффектов является оправданным.
Здесь, кинетическая на основе флуоресценции сотовой пробирного главным образом используется для экрана для соединений, способных ингибирующих CXCR4 описан. Флуоресцентный измерение этого метода основано на преходящее повышение концентрации внутриклеточного Ca2 + вызывали после активации CXCR4 к его эндогенного агонист, хемокиновых лигандом CXCL12 (ранее известный как стромальные клетки получены фактор 1α ( SDF1-α)) и потенциальные ингибирование этой CXCL12-индуцированной Ca2 + ответ конкретных соединений. В этот assay клетки человека глиобластома U87, стабильно выражая человека рецептор CXCR4 используются. В то же время эти клетки отсутствие эндогенного выражение CXCR7, связанной с хемокиновых рецепторов, которая также связывает CXCL1215,16,17. CXCR7 ранее также доказано быть способны формировать гетеродимерами с CXCR4, тем самым модуляции сигналов свойства этой последней рецептор18. Колебания уровня внутриклеточного Ca2 + опосредовано CXCR4 контролируются путем загрузки CXCR4+ клеток с эфира fluo-2 acetoxymethyl (AM), клетки проницаемой высоким сродством флуоресцентные Ca2 +-привязка красителя. FLUO-2 утра является одной длины волны флуоресцентные молекула, которая может быть возбужден в 490 Нм, в то время как его флуоресценции выбросов измеряется в 520 Нм. Этот флуоресценции выбросов увеличивает Ca2 + привязки, с большим динамическим диапазоном между Ca2 +-связанные и свободные государства. Увеличение флуоресцентного сигнала преходящими, происходящих в течение интервала времени несколько минут и потом будет распадаться. Пик высота Флуоресцентные выбросов еще коррелирует с уровнем активации рецептора. Сам генотипирования с помощью Считыватель микропланшетов флуоресценции, оснащена камерой активизировались CCD (ICCD), которая обладает интегрированной системы дозирования, которая позволяет стандартизация дозирования шаги в assay (см. Таблицу материалы) . Кроме того одновременное измерение флуоресцентного сигнала на всех скважинах Гонав является еще одним ключевым преимуществом флуоресценции Reader, которая используется. Во время первой частью соединений под следствием (например, группа малых молекул в фиксированной концентрации или в серии разрежения) добавляются к fluo-2 утра assay загружен CXCR4+ U87 клетки следуют ~ 10 мин инкубационный период во время которой потенциальные агонистических эффект соединений непрерывно измеряется в режиме реального времени. Затем, эндогенного агонистов (т.е., CXCL12) добавляется к клетки вызывают CXCR4-опосредованной преходящее повышение уровня внутриклеточного Ca2 +. В ходе этой части assay может оцениваться потенциальной антагонистической активности проверенных соединений. Схематический обзор общего процесса анализа представлена на рисунке 1.
Хотя этот Ca2 + мобилизации assay главным образом были использованы для выявления и определения ингибирующее потенции конкурентоспособных CXCR4 антагонистов (например, соединения, препятствующие эндогенного агониста для привязки и стимулировать рецептор), он также можно определить агонистами рецепторов и, Кроме того, соединения, прилагать свои функции путем связывания на аллостерический участках (например, сайты, которые топографически отличается от привязки сайта orthosteric, оккупирована эндогенного агонист). К последней категории соединений примеры аллостерический агонисты и пам и NAMs19,20. Тогда как антагонисты рецепторов конкретных, а также NAMs будет препятствовать CXCL12-индуцированной Ca2 + ответ, СМУУ усилит этот ответ (см. также обсуждение раздела). Хотя assay описаного конкретно цели CXCR4, предполагается, что этот метод может применяться для других GPCR с минимальным оптимизации усилий, по крайней мере если они сигнала через освобождение внутриклеточных Ca2 +.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Fluo-2 AM</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab142775</td>
			<td>fluorescent Ca2+ sensitive dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2443-250G</td>
			<td>pluronic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMD3100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5602-5 mg</td>
			<td>specific CXCR4 antagonist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maraviroc</td>
			<td>kind gift of AnorMed</td>
			<td></td>
			<td>antiretroviral drug, CCR5 antagonist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemokine ligand CXCL12</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-28A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemokine ligand CCL5</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gibco (Life Technologies)</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A1933-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco (Life Technologies)</td>
			<td>41965-039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS (10 x), calcium, magnesium, no phenol red</td>
			<td>Gibco (Life Technologies)</td>
			<td>14065-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1 M)</td>
			<td>Gibco (Life Technologies)</td>
			<td>15630-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0,25 %), phenol red</td>
			<td>Gibco (Life Technologies)</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (DPBS)</td>
			<td>Gibco (Life Technologies)</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes, 50 mL</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>227 261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture flask (T75)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black plate, 96-well, clear bottom, with lid</td>
			<td>Costar/Fisher Scientific</td>
			<td>10530753</td>
			<td>assay plate (96-well), for cell seeding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene (PP) plates</td>
			<td>Thermo Scientific (VWR)</td>
			<td>732-2661</td>
			<td>plates used to prepare the compound plates and chemokine plates, round bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLIPR Tetra high throughput cellular screening system</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>Fluorescent plate reader with integrated pipettor head and ICCD camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLIPR Tetra LED Module 470 - 495 nm</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>0200-6128</td>
			<td>Light emitting diodes for excitation of the fluorescent Ca2+ sensitive dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLIPR Tetra Emission Filter 515 - 575 nm</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>0200-6203</td>
			<td>emission filter compatible with the fluorescent dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLIPR Tetra 96 Head</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>0310-4536</td>
			<td>96-well pipettor head, integrated within the fluorescent plate reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ScreenWorks</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>software package used for data analysis and visualization on the FLIPR Tetra</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vi-CELL</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>cell viability analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning CellBIND 96 Well Flat Clear Bottom Black Polystyrene Microplates, with Lid, Sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3340</td>
			<td>Pre-coated 96-well assay plates that may represent an alternative for manual coating of the assay plate.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a kinetic fluorescence-based ca2+ mobilization assay to identify g protein-coupled receptor agonists, antagonists, and allosteric modulators

G белок рецепторы (GPCR) имеют большое значение для фармацевтической промышленности, как они участвуют в многих болезней человека и включают в себя хорошо проверенных цели для терапевтической интервенции. Открытие соединений свинца, включая малые синтетические молекулы, которые специально препятствуют функции рецепторов, является важным первым шагом в разработке лекарств и опирается на чувствительных, конкретные и надежный анализов на основе ячеек. Здесь, мы описать кинетические сотовой пробирного с флуоресцентные индикация, предназначена главным образом для выявления рецептор специфических антагонистов, которые тормозят внутриклеточных Ca2 + релиз вызывали после активации КЭС хемокиновых рецепторов 4 (CXCR4) путем его эндогенного лиганда, КЭС хемокиновых лигандом 12 (CXCL12). Основным преимуществом этого метода является, что он также позволяет скрининг соединений, наделенных агонистических свойств (например, соединения, вызывая увеличение внутриклеточной Ca2 + концентрации в отсутствие CXCL12) или соединений Модулирует функции рецепторов через взаимодействие с аллостерический привязки сайтов (то есть, положительные и отрицательные аллостерический модуляторы (ПАМС и NAMs, соответственно)). С другой стороны autofluorescent соединений может мешать пробирного индикация, препятствуя интерпретации надежных данных. Скорее этот assay может осуществляться, с минимальной адаптации, как открытие assay дженериков для многих других GPCR, из которых Активация приводит к выбросу внутриклеточных Ca2 +.

Эффект CXCL12 стимуляция внутриклеточных Ca2 + мобилизации в U87. CD4.CXCR4+ и U87. CD4 клеток проводилась с Ca2 + мобилизации assay. Вместо 20 мкл, комплекса тестов, обычно будет добавлен на первом шаге дозирования протокола (рис. 1), аналитический буфер бы?...

Watch this Scientific Journal Video about A Kinetic Fluorescence-based Ca2+ Mobilization Assay to Identify G Protein-coupled Receptor Agonists, Antagonists, and Allosteric Modulators at JoVE.com

A Kinetic Fluorescence-based Ca2+ Mobilization Assay to Identify G Protein-coupled Receptor Agonists, Antagonists, and Allosteric Modulators

Описанные сотовой assay предназначен для идентификации КЭС хемокиновых рецепторов 4 (CXCR4)-взаимодействующих агентов, которые подавляют или стимулировать, либо конкурсной или allosterically, внутриклеточный Ca2 + релиз, инициированных CXCR4 активации.

Кинетическая на основе флуоресценции Ca2 + мобилизации Assay для определения G белка в сочетании рецепторов агонистов, антагонисты и аллостерический модуляторы

G protein-coupled receptors (GPCRs) are of great importance to the pharmaceutical industry as they are involved in many human diseases and include ...

Research

JoVE Journal

Medicine

A Kinetic Fluorescence-based Ca2+ Mobilization Assay to Identify G Protein-coupled Receptor Agonists, Antagonists, and Allosteric Modulators

A Strategy to Identify de Novo Mutations in Common Disorders such as Autism and Schizophrenia

Стратегии для определения де Ново Мутации в общих расстройств, таких как аутизм и шизофрения

There are several lines of evidence supporting the role of de novo mutations as a mechanism for common disorders, such as autism and schizophrenia. First, ...

5/6th Nephrectomy in Combination with High Salt Diet and Nitric Oxide Synthase Inhibition to Induce Chronic Kidney Disease in the Lewis Rat

5/6th нефрэктомии в сочетании с высоким содержанием соли и азотной ингибирование синтазы, чтобы побудить хронического заболевания почек у крыс Льюиса

Chronic kidney disease (CKD) is a global problem. Slowing CKD progression is a major health priority. Since CKD is characterized by complex derangements ...

High-throughput Flow Cytometry Cell-based Assay to Detect Antibodies to N-Methyl-D-aspartate Receptor or Dopamine-2 Receptor in Human Serum

Высокая пропускная проточной цитометрии Клеточная Анализ для выявления антител к N-метил-D-аспартат рецепторов или допамин-2 рецепторов в сыворотке человека

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases ...

Dynamic Visual Tests to Identify and Quantify Visual Damage and Repair Following Demyelination in Optic Neuritis Patients

Динамические визуальные тесты для выявления и количественной оценки видимых повреждений и ремонт После демиелинизации в неврит зрительного нерва пациентов

In order to follow optic neuritis patients and evaluate the effectiveness of their treatment, a handy, accurate and quantifiable tool is required to ...

Utilization of the Soft Agar Colony Formation Assay to Identify Inhibitors of Tumorigenicity in Breast Cancer Cells

Использование мягких агар колонии Формирование анализе для идентификации ингибиторов туморогенности в клетках рака молочной железы

Given the inherent difficulties in investigating the mechanisms of tumor progression in vivo, cell-based assays such as the soft agar colony formation ...

A Rat Carotid Balloon Injury Model to Test Anti-vascular Remodeling Therapeutics

Крыса Каротидное шар Травма Модель для тестирования Anti-сосудистое ремоделирование Therapeutics

The rat carotid balloon injury is a well-established surgical model that has been used to study arterial remodeling and vascular cell proliferation. It is ...

Isolation and Culture of Primary Endothelial Cells from Canine Arteries and Veins

Выделение и культуры первичных эндотелиальных клеток от клыка артериями и венами

Cardiovascular disease is studied in both human and veterinary medicine. Endothelial cells have been used extensively as an in vitro model to study ...

A Clinical Trial Assessing the Safety, Efficacy, and Delivery of Olive-Oil-Based Three-Chamber Bags for Parenteral Nutrition

Клиническое испытание Оценка безопасности, эффективности и доставки оливкового масла основе трехкамерных мешков для парентерального питания

Limited evidence exists to precisely estimate efficacy and safety differences between parenteral nutrition (PN) prepared using olive-oil-based ...

A Fluorescence-based Assay for Characterization and Quantification of Lipid Droplet Formation in Human Intestinal Organoids

Флуоресценция основе анализа для характеристики и количественной оценки образования липидных капель в кишечных органоидов человека

Dietary lipids are taken up as free fatty acids (FAs) by the intestinal epithelium. These FAs are intracellularly converted into triglyceride (TG) ...

Analysis of Cardiac Contractile Dysfunction and Ca2+ Transients in Rodent Myocytes

Analysis of Cardiac Contractile Dysfunction and Ca2+ Transients in Rodent Myocytes

Анализ сердечной сократительной дисфункции и транзиторов Ca2+ в миоцитах грызунов

Contractile dysfunction and Ca2+ transients are often analyzed at the cellular level as part of a comprehensive assessment of cardiac-induced injury ...