Name: zika virus specific diagnostic epitope discovery
Uploaded: 2017-12-12T13:00:00
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Suporte atual é fornecido por uma concessão de suplemento administrativo SBIR (pequenos negócios inovação pesquisa) do NIDCRR44 DE024456. Concessão de NIDCR HIV que evoluiu fora NIDCR conceder U01 DE017855 para o desenvolvimento de um confirmação diagnóstico point-of-care para HIV. Reconhecemos com gratidão Silke Weisenburger(PEPperPRINT Heidelberg, Germany) para a assistência técnica e apoio gentil. Agradecemos também a NYU Langone Medical Center para o LI-COR Odyssey Imaging System.

Esses dados fazem parte de um estudo de investigação em curso realizado na New York University College of Dentistry e foram aprovados pelo Conselho de revisão institucional da New York University School of Medicine, IRB # H10-01894. Amostras clínicas utilizadas neste estudo foram identificadas de amostras anteriormente utilizadas para o diagnóstico e com a permissão de Wadsworth Center de Nova York Secretaria de estado da saúde, Albany, NY.
1. instalar o ZIKV de alta densidade de peptíde...

<ol>
	<li>Kelser, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meet+dengue's+cousin.">Meet dengue's cousin.</a> Zika. Microbes Infect. 18 (3), 163-166 (2016).</li><li>Musso, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+Zika+virus+in+saliva.">Detection of Zika virus in saliva.</a> J Clin Virol. 68, 53-55 (2015).</li><li>Siqueira, W. 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E., Aguero, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+Peptide+Discovery:+Prioritization+of+Pathogen+Diagnostic+Markers+Using+Multiple+Features.">Diagnostic Peptide Discovery: Prioritization of Pathogen Diagnostic Markers Using Multiple Features.</a> Plos One. 7 (12), e50748 (2012).</li><li>Lagatie, O., Van Dorst, B., Stuyver, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+three+immunodominant+motifs+with+atypical+isotype+profile+scattered+over+the+Onchocerca+volvulus+proteome.">Identification of three immunodominant motifs with atypical isotype profile scattered over the Onchocerca volvulus proteome.</a> PLoS Negl Trop Dis. 11 (1), e0005330 (2017).</li><li>Basile, A. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+screening+for+anti-CMV+biologics+identifies+a+broadly+neutralizing+epitope+of+an+essential+envelope+protein.">Functional screening for anti-CMV biologics identifies a broadly neutralizing epitope of an essential envelope protein.</a> Nat Commun. 7, (2016).</li><li>Nixon, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+protective+B-cell+epitopes+within+the+novel+malaria+vaccine+candidate+P.+falciparum+Schizont+Egress+Antigen-1.">Identification of protective B-cell epitopes within the novel malaria vaccine candidate P. falciparum Schizont Egress Antigen-1.</a> Clin Vaccine Immunol. , (2017).</li></ol>

Nós projetamos um protocolo utilizando um microarray de peptídeo de alta densidade contendo a toda sequência de proteína vírus Zika (estirpe da Polinésia francesa). O microarray foi fabricado pela impressão 3.423 diferentes sobreposição peptídeos lineares. Cada peptídeo foi 15 aminoácidos e variados por apenas um resíduo de seu vizinho mais próximo na sequência (ou seja, sobreposição de resíduo 14). Embora sobreposições mais curtas podem ser impressos, mapeamento de epítopo é mais preciso c...

Zika diagnóstico de vírus (ZIKV) com base nos sintomas clínicos é um desafio porque compartilha vetores, distribuição geográfica e sintomas de infecção de vírus Dengue e Chikungunya1. Dado o risco de resultados adversos da gravidez em mulheres infectadas com ZIKV durante a gravidez, é importante distinguir entre os 3 vírus. Embora os testes de diagnóstico moleculares atuais são específicos, eles são úteis apenas no sangue ou saliva durante o período relativamente curto de infecção aguda2,3. Ensaios sorológicos são essenciais para o diagnóstico fora deste período inicial de infecção4.
O desenvolvimento de um ensaio sorológico específico de ZIKV é um desafio por duas razões: primeiro, os antígenos Zika que o sistema imunológico humano responde não são atualmente conhecidos; e sequências de aminoácidos conservados, segundo flavivírus induzem reactividade cruzada do anticorpo. Nosso objetivo era descobrir exclusivos peptídeos ZIKV específicos para ser usado no diagnóstico. Diferentes abordagens têm sido desenvolvidos para bibliotecas de peptídeo de tela cobrindo toda proteínas incluindo fago, bacteriano, e superfície de levedura exibir5,6,7,8,9, 10. Nossa estratégia foi usar um microarray de peptídeo de alta densidade que permite rápida e barata elevado-throughput exames serológicos11,12 e posteriormente os peptídeos identificados podem ser usados para melhorar a corrente serológico ensaios para detecção da infecção por ZIKV.
Este protocolo permite a descoberta de Zika vírus específico diagnósticos peptídeos usando um microarray de peptídeo de alta densidade (Figura 1). O peptídeo high-density microarray foi produzido usando a tecnologia de impressão laser do peptide. A sequência de proteína inteira ZIKV constituído por resíduos de aminoácidos 3.423 baseia a estirpe da Polinésia francesa (GenBank: KJ776791.2), foi impresso em um slide de vidro padrão em blocos de 15 resíduos lineares com uma sobreposição de 14 resíduos de aminoácidos em duplicado para um total de 6.846 pontos de peptídeo. Além dos peptídeos de sequência de proteínas Zika todo, o microarray utiliza hemaglutinina gripe (HA) de peptídeos para controles internos.
Uma Zika validado positivos Obtida de Wadsworth Center (Albany, NY), de amostra de soro foi usada para identificar específicas imunoglobulina M (IgM) e imunoglobulina G (IgG) reativos peptídeos. Após a incubação com a amostra durante a noite, o microarray foi manchada com um anticorpo conjugado fluorocromo secundário (anti-humano IgM ou IgG anti-humano) e analisado em um scanner de microarray. Quantificação de intensidades local e anotação de peptídeo foi realizada com um software específico fornecido pela mesma empresa que fabricava o microarray.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>PEPperCHIP Custom Peptide Microarray</td>
			<td>PEPperPRINT</td>
			<td>PPC.001.001</td>
			<td>Custom peptide micarray: our microarray contains the entire Zika virus protein sequence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEPperCHIP incubation tray 3/1</td>
			<td>PEPperPRINT</td>
			<td>PPC.004.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEPperCHIP Staining Kit (680 nm) (anti-HA, DyLight labeling)</td>
			<td>PEPperPRINT</td>
			<td>PPC.037.002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PepSLide Analyzer</td>
			<td>PEPperPRINT</td>
			<td>PSA.004.001</td>
			<td>14-days free License for Windows</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rockland Blocking buffer</td>
			<td>Rockland</td>
			<td>MB-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-human IgM (mu chain) DyLight 800</td>
			<td>Rockland</td>
			<td>609-145-007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-human IgG Fc DyLight 680</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SA5-10138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LI-COR Odyssey Imaging System</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker device</td>
			<td>IKA</td>
			<td>MTS 2/4 digital microtiter shaker</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe Illustrator</td>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deltagraph</td>
			<td>Redrocks</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

zika virus specific diagnostic epitope discovery

High-density do peptide microarrays permitir rastreio de peptídeos de mais de seis mil em um slide de microscopia simples padrão. Esse método pode ser aplicado para a descoberta de medicamentos, identificação do alvo terapêutico e desenvolvimento de diagnósticos. Aqui, apresentamos um protocolo para descobrir específico Zika vírus (ZIKV) diagnósticos peptides usando um microarray de peptídeo de alta densidade. Uma amostra de soro humano validada para infecção ZIKV foi incubada com um microarray de peptídeo de alta densidade contendo a proteína inteira de ZIKV traduzida em 3.423 exclusivo 15 resíduos linear de aminoácidos (aa) com uma sobreposição de resíduo 14-aa impresso em duplicado. Coloração com anticorpos secundários diferentes dentro do mesmo conjunto, detectamos peptídeos que ligam a imunoglobulina M (IgM) e imunoglobulina G (IgG) anticorpos presentes no soro. Estes peptídeos foram selecionados para mais experiências de validação. Neste protocolo, descrevemos a estratégia adoptada para projetar, processar e analisar um microarray de peptídeo de alta densidade.

Os resultados obtidos utilizando o protocolo descrito são mostrados na Figura 2 e Figura 3. Não há interações de fundo foram observadas quando pre-manchando o microarray com anti-humano secundário IgM (dados não mostrados). Coloração com um anti-humano IgM conjugado resultou em diversas áreas acima as intensidades de fluorescência verde de fundo, indicando a ligação destes peptídeos com IgM na amos...

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Zika Virus Specific Diagnostic Epitope Discovery

Neste protocolo, descrevemos uma técnica para descobrir Zika vírus específico diagnósticos peptides usando um microarray de peptídeo de alta densidade. Este protocolo especialidade pode ser adaptado para outras doenças infecciosas emergentes.

Zika vírus específico diagnóstico Epitope Discovery

High-density peptide microarrays allow screening of more than six thousand peptides on a single standard microscopy slide. This method can be applied for ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Peptide:MHC Tetramer-based Enrichment of Epitope-specific T cells

Péptido: Enriquecimento tetrâmero com base MHC das células T específicas para epitopos

A  basic necessity for researchers studying adaptive immunity with in vivo experimental models is an  ability to identify T cells based on their T cell ...

Imunologia e Infecção

Assays for the Identification of Novel Antivirals against Bluetongue Virus

Ensaios para a identificação de novos antivirais contra a febre catarral ovina vírus

To identify potential antivirals against BTV, we have  developed, optimized and validated three assays presented here. The CPE-based  assay was the first ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Isolamento de neutrófilos e análise para determinar seu papel na linfoma sensibilidade das células a agentes terapêuticos

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Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

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Virus Zika sistema de cultura celular Infecciosas e do<em&gt; In Vitro</em&gt; Efeito profilático de interferões

Zika Virus (ZIKV) is an emerging pathogen that is linked to fetal developmental abnormalities such as microcephaly, eye defects, and impaired growth. ZIKV ...

Rescue and Characterization of Recombinant Virus from a New World Zika Virus Infectious Clone

Salvamento e Caracterização do Vírus Recombinante de um Clone Infeccioso do Vírus do Novo Mundo Zika

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral ...

A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum

A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum

A citometria de fluxo simples com base em ensaio para determinar In Vitro anticorpo dependente do realce do vírus da Dengue, usando soro convalescente vírus Zika

Antibody dependent enhancement of infection has been shown to play a major role in Dengue viral pathogenesis. Traditional assays that measure the capacity ...

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

Avaliação das respostas de células T Zika vírus específicos em órgãos Immunoprivileged de infectados Ifnar1- / - ratos

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Quantification of Antibody-dependent Enhancement of the Zika Virus in Primary Human Cells

Quantificação de realce dependente de anticorpo do vírus nas células humanas primárias Zika

The recent emergence of the flavivirus Zika and neurological complications, such as Guillain-Barr&#233; syndrome and microcephaly in infants, has brought ...

Rescue of Recombinant Zika Virus from a Bacterial Artificial Chromosome cDNA Clone

Resgate do vírus Zika recombinante de um clone de cDNA de cromossomo artificial bacteriano

The association of Zika virus (ZIKV) infection with neurological complications during the recent worldwide outbreak and the lack of approved vaccines ...

Isolation and Quantification of Zika Virus from Multiple Organs in a Mouse

Isolamento e quantificação do vírus Zika de múltiplos órgãos em um mouse

The methods being presented demonstrate laboratory procedures for the isolation of organs from Zika virus infected animals and the quantification of viral ...