Name: a novel feeder-free system for mass production of murine natural killer cells in vitro
Uploaded: 2018-01-09T14:00:00
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Cette étude a été financée par la recherche subventions Conseil de Hong Kong (GRF 468513, CUHK3/CRF/12R) et de l’Innovation et fonds de technologie de Hong Kong (STI/227/15, ITS InP/164/16, STI-InP/242/16), subvention directe pour la recherche-CUHK (2016.035) et boursier de Hong Kong Programme.
H.-Y.L. conçu et supervisé toutes les expériences et ont contribué à la rédaction de manuscrits. H-K.T. effectué des expériences, ont analysé les données et a contribué à la rédaction de manuscrits. C.P.-T. T., J.Y.-C.F., J.S.-C., H., Q.-M.W., et G.-Y.L. ont prélevé des échantillons animaux et a participé à l’expérimentation animale. J.S., X.-R.H., et K.-F.T. a contribué à la rédaction de manuscrits.

Le protocole pour l’obtention et la différenciation des dérivés de la moelle osseuse NK cells (BM-NK) est basé sur les méthodes publiées antérieurement20,21,22. Toutes les procédures sur des souris ont été approuvés par l’Animal Ethics expérimental Comité (AEEC) à l’Université chinoise de Hong Kong.
1. préparation du milieu conditionnelle OP9
<ol><li>La culture de la lignée de...

<ol>
	<li>Schreiber, R. D., Old, L. J., Smyth, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+immunoediting:+integrating+immunity's+roles+in+cancer+suppression+and+promotion.">Cancer immunoediting: integrating immunity's roles in cancer suppression and promotion.</a> Science. 331 (6024), 1565-1570 (2011).</li><li>Junttila, M. R., de Sauvage, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+tumour+micro-environment+heterogeneity+on+therapeutic+response.">Influence of tumour micro-environment heterogeneity on therapeutic response.</a> Nature. 501 (7467), 346-354 (2013).</li><li>Rusakiewicz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+infiltrates+are+prognostic+factors+in+localized+gastrointestinal+stromal+tumors.">Immune infiltrates are prognostic factors in localized gastrointestinal stromal tumors.</a> Cancer Res. 73 (12), 3499-3510 (2013).</li><li>Mamessier, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+breast+cancer+cells+enhance+self+tolerance+by+promoting+evasion+from+NK+cell+antitumor+immunity.">Human breast cancer cells enhance self tolerance by promoting evasion from NK cell antitumor immunity.</a> J Clin Invest. 121 (9), 3609-3622 (2011).</li><li>Stern, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-emptive+immunotherapy+with+purified+natural+killer+cells+after+haploidentical+SCT:+a+prospective+phase+II+study+in+two+centers.">Pre-emptive immunotherapy with purified natural killer cells after haploidentical SCT: a prospective phase II study in two centers.</a> Bone Marrow Transplant. 48 (3), 433-438 (2013).</li><li>Miller, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+adoptive+transfer+and+in+vivo+expansion+of+human+haploidentical+NK+cells+in+patients+with+cancer.">Successful adoptive transfer and in vivo expansion of human haploidentical NK cells in patients with cancer.</a> Blood. 105 (8), 3051-3057 (2005).</li><li>Rubnitz, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NKAML:+a+pilot+study+to+determine+the+safety+and+feasibility+of+haploidentical+natural+killer+cell+transplantation+in+childhood+acute+myeloid+leukemia.">NKAML: a pilot study to determine the safety and feasibility of haploidentical natural killer cell transplantation in childhood acute myeloid leukemia.</a> J Clin Oncol. 28 (6), 955-959 (2010).</li><li>Curti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+transfer+of+alloreactive+haploidentical+KIR+ligand-mismatched+natural+killer+cells+after+infusion+in+elderly+high+risk+acute+myeloid+leukemia+patients.">Successful transfer of alloreactive haploidentical KIR ligand-mismatched natural killer cells after infusion in elderly high risk acute myeloid leukemia patients.</a> Blood. 118 (12), 3273-3279 (2011).</li><li>Bachanova, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clearance+of+acute+myeloid+leukemia+by+haploidentical+natural+killer+cells+is+improved+using+IL-2+diphtheria+toxin+fusion+protein.">Clearance of acute myeloid leukemia by haploidentical natural killer cells is improved using IL-2 diphtheria toxin fusion protein.</a> Blood. 123 (25), 3855-3863 (2014).</li><li>Stringaris, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukemia-induced+phenotypic+and+functional+defects+in+natural+killer+cells+predict+failure+to+achieve+remission+in+acute+myeloid+leukemia.">Leukemia-induced phenotypic and functional defects in natural killer cells predict failure to achieve remission in acute myeloid leukemia.</a> Haematologica. 99 (5), 836-847 (2014).</li><li>Rouce, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+TGF-&#946;/SMAD+pathway+is+an+important+mechanism+for+NK+cell+immune+evasion+in+childhood+B-acute+lymphoblastic+leukemia.">The TGF-&#946;/SMAD pathway is an important mechanism for NK cell immune evasion in childhood B-acute lymphoblastic leukemia.</a> Leukemia. 30 (4), 800-811 (2016).</li><li>Derynck, R., Akhurst, R. J., Balmain, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-&#946;+signaling+in+tumor+suppression+and+cancer+progression.">TGF-&#946; signaling in tumor suppression and cancer progression.</a> Nature Genet. 29 (2), 117-129 (2001).</li><li>Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGFbeta+in+cancer.">TGFbeta in cancer.</a> Cell. 134 (2), 215-230 (2008).</li><li>Ikushima, H., Miyazono, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGFbeta+signalling:+a+complex+web+in+cancer+progression.">TGFbeta signalling: a complex web in cancer progression.</a> Nat Rev Cancer. 10 (6), 415-424 (2010).</li><li>Pickup, M., Novitskiy, S., Moses, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+roles+of+TGF&#946;+in+the+tumour+microenvironment.">The roles of TGF&#946; in the tumour microenvironment.</a> Nat Rev Cancer. 13 (11), 788-799 (2013).</li><li>Rook, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+transforming+growth+factor+beta+on+the+functions+of+natural+killer+cells:+depressed+cytolytic+activity+and+blunting+of+interferon+responsiveness.">Effects of transforming growth factor beta on the functions of natural killer cells: depressed cytolytic activity and blunting of interferon responsiveness.</a> J Immunol. 136 (10), 3916-3920 (1986).</li><li>Bellone, G., Aste-Amezaga, M., Trinchieri, G., Rodeck, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+NK+cell+functions+by+TGF-beta+1.">Regulation of NK cell functions by TGF-beta 1.</a> J Immunol. 155 (3), 1066-1073 (1995).</li><li>Trotta, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-&#946;+utilizes+SMAD3+to+inhibit+CD16-mediated+IFN-&#947;+production+and+antibody-dependent+cellular+cytotoxicity+in+human+NK+cells.">TGF-&#946; utilizes SMAD3 to inhibit CD16-mediated IFN-&#947; production and antibody-dependent cellular cytotoxicity in human NK cells.</a> J Immunol. 181 (6), 3784-3792 (2008).</li><li>Shull, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+disruption+of+the+mouse+transforming+growth+factor-&#946;1+gene+results+in+multifocal+inflammatory+disease.">Targeted disruption of the mouse transforming growth factor-&#946;1 gene results in multifocal inflammatory disease.</a> Nature. 359 (6397), 693-699 (1992).</li><li>Chen, T. J., Kotecha, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytobank:+providing+an+analytics+platform+for+community+cytometry+data+analysis+and+collaboration.">Cytobank: providing an analytics platform for community cytometry data analysis and collaboration.</a> Curr Top Microbiol Immunol. 377, 127-157 (2014).</li><li>Williams, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+NK1.1+,+Ly49++NK+cells+from+flt3++multipotent+marrow+progenitor+cells.">Differentiation of NK1.1+, Ly49+ NK cells from flt3+ multipotent marrow progenitor cells.</a> J Immunol. 163 (5), 2648-2656 (1999).</li><li>Fathman, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+earliest+natural+killer+cell-committed+progenitor+in+murine+bone+marrow.">Identification of the earliest natural killer cell-committed progenitor in murine bone marrow.</a> Blood. 118 (20), 5439-5447 (2011).</li><li>Tang, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smad3+promotes+cancer+progression+by+inhibiting+E4BP4-mediated+NK+cell+development.">Smad3 promotes cancer progression by inhibiting E4BP4-mediated NK cell development.</a> Nat Commun. 6 (8), 14677 (2017).</li></ol>

Dans le présent travail, nous avons décrit une nouvelle méthode de production de dérivés de la moelle osseuse murine NK de cellules in vitro. Le chargeur de la cellule dans le système original21,22 est remplacé avec succès par la moyenne conditionnelle de cellules OP9, qui a largement augmenté la stabilité du système de différenciation. En outre, le système peut produire la quantité élevée et pureté du NK mature cellules pour in vitr...

La progression du cancer est largement tributaire de la tumeur microenvironnement1,2, y compris immunocytes hôte, par exemple, les cellules NK. Plusieurs études ont démontré que les cellules NK intratumorale sont négativement corrélées avec la tumeur progression3,4. En outre, des études cliniques ont montré qu’adoptif thérapie de cellules NK est une stratégie possible pour cancer5,6,7,8,9. Immunothérapie des cancers basés sur les cellules NK a été récemment proposé comme une option thérapeutique pour les tumeurs solides, mais il existe des défis en raison de la sécrétion de cytokines immunosuppresseur et la diminution de l’activation des ligands dans le micro-environnement des tumeurs solides 10,11. Facteur de croissance transformant β (TGF-β) a été proposé de jouer un rôle suppresseur dans la carcinogenèse, mais paradoxalement les cellules cancéreuses produisent également TGF-β1 pour prendre en charge la tumeur développement12,13,14 , 15. signalisation TGF-β peut supprimer l’activité cytolytique des cellules NK via bas réglementant la réactivité de l’interféron et CD16 médiée par l’interféron-gamma (IFN-γ) production in vitro16,17, 18.
Bien que la perturbation de la signalisation de TGF-β dans le microenvironnement tumoral peut être un moyen possible pour éliminer les cancers, bloquant complètement la signalisation TGF-β causera des maladies auto-immunes en raison de sa fonction anti-inflammatoire, comme en témoigne le développement de effets secondaires indésirables, y compris l’inflammation systémique, anomalies cardiovasculaires et l’auto-immunité dans des souris modèles19. Ainsi, comprendre le mécanisme de travail de l’immunosuppression TGF-β-mediated mènera à l’identification d’une cible thérapeutique accessible pour traiter le cancer.
Afin d’élucider les événements moléculaires nécessaires pour le développement des cellules NK, Williams et al. établi un système in vitro pour différencier murin de la moelle osseuse des cellules souches hématopoïétiques dans NK cellules20. Ce système facilite grandement l’étude mécanistique de développement des cellules NK, y compris l’identification de nouveaux géniteurs de NK cellules21. Toutefois, les ancêtres de la moelle osseuse doivent être mis en culture dans le système avec l’appui de cellules stromales OP9 comme une alimentation couche20,21, et cette population de cellules hétérogènes en grande partie limite l’application supplémentaire du gène perturbant outils (p. ex., siARN-mediated gene silencing) spécifiquement appliquées aux cellules NK différenciateur.
Nous décrivons ici un système sans conducteur qui a été développé par autres modifier le système in vitro de Williams et al.20. Dans notre système, les cellules stromales chargeur de OP9 ne sont pas tenus, et plutôt OP9 moyenne conditionnelle est utilisée sans affecter la différenciation des cellules NK in vitroet ceci récemment nous amènent à découvrir que le TGF-β est capable de promouvoir la progression du cancer via supprimant le développement des cellules NK E4bp4-dépendant dans le microenvironnement de tumeur22. Ce nouveau système fournit avec succès une méthode sans fond pour élucider les mécanismes moléculaires du développement des cellules NK dans des conditions particulières (p. ex., haute TGF-β1, siARN-mediated gene silencing, etc..) in vitro.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1113px;" width="1113">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:297px;">OP9 cell line</td>
			<td style="width:129px;">ATCC</td>
			<td style="width:344px;">ATCC&#174; CRL-2749&#8482;</td>
			<td style="width:343px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">MEM &#945;, no nucleosides</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>22561021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10500064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PBS, pH 7.4</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Recombinant Murine IL-7</td>
			<td>PEPROTECH</td>
			<td>217-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Recombinant Murine SCF</td>
			<td>PEPROTECH</td>
			<td>250-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Recombinant Murine Flt3-Ligand</td>
			<td>PEPROTECH</td>
			<td>250-31L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Recombinant Murine IL-2</td>
			<td>PEPROTECH</td>
			<td>212-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Lipofectamin RNAiMAX Transfection Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>1377815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">IC Fixation Buffer&#160;</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>00-8222-49</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Flow Cytometry Staining Buffer&#160;</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>00-4222-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PE-conjugated anti-mouse CD244</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-2441-83</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cy3-conjugated anti-mouse NKp46</td>
			<td>Bioss</td>
			<td>bs-2417R-cy3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Nonsense control (NC)</td>
			<td>Ribobio</td>
			<td>siN05815122147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">siRNA against mouse E4BP4 mRNA</td>
			<td>Ribobio</td>
			<td>N/A</td>
			<td>5&#8242;-GAUGAGGGUGUA 
			GUGGGCAAGUCUU-3&#8242;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a novel feeder-free system for mass production of murine natural killer cells in vitro

Natural killer (NK) cellules appartiennent au système immunitaire inné et sont une défense immunitaire de première ligne contre le cancer ; Cependant, ils sont supprimés dans le microenvironnement tumoral et le mécanisme sous-jacent est encore largement inconnu. L’absence d’une source fiable et constante des cellules NK limite les progrès de la recherche de l’immunité cellulaire NK. Nous rapportons ici un système in vitro qui peut fournir la qualité et la quantité de moelle osseuse murine NK cellules sous condition exempte d’engraissement. Plus important encore, nous démontrons que le silençage génique médiée par les siARN avec succès inhibe la maturation des cellules NK E4bp4-dépendante en utilisant ce système. Ainsi, cette cellule NK roman in vitro différenciant système est une solution de biomatériaux pour la recherche sur l’immunité.

Résultats représentatifs sont obtenus suivant le protocole décrit. Cellules en suspension totale de la moelle osseuse ont été cultivés en vertu du système de différenciation exempte d’engraissement pendant 11 jours ; jour 7 par rapport au nombre de cellules totales au jour 0 (Figure 1A) a observé une augmentation significative des taux de prolifération. Les cellules NK matures avec ratio nucléaire à cytoplasmique élevé et mor...

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A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Nous présentons ici un protocole pour produire en série-silençage génique des cellules NK en utilisant un système de différenciation exempte d’engraissement pour étude mécanistique in vitro et in vivo.

Un nouveau système exempt d’alimentation pour la Production de masse des cellules tueuses naturelles murins In Vitro

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...

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