Name: a novel feeder-free system for mass production of murine natural killer cells in vitro
Uploaded: 2018-01-09T14:00:00
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Diese Studie wurde unterstützt durch die Research Grants Council of Hong Kong (GRF 468513, CUHK3/CRF/12R) und der Innovation und Technology Fund of Hong Kong (ITS/227/15, ITS InP/164/16, ITS-InP/242/16), direkte Finanzhilfe für Forschung-CUHK (2016.035) und Hong Kong Gelehrter Programm.
H.-YL konzipiert und betreut alle Experimente und trugen zum Manuskript Vorbereitung. Uhr-k.t. Experimente durchgeführt, analysiert Daten und trugen zum Manuskript Vorbereitung. P.C.-T. T., D.S.-F.C., j.s.-C., H., f.-M.W., und G.-YL tierische Proben gesammelt und im Tierversuch teilgenommen. J.s., X.-R.H. und K.-f.t. zum Manuskript Vorbereitung beigetragen.

Das Protokoll für Erhalt und Differenzierung Knochenmark stammenden NK Zellen (BM-NK) basiert auf zuvor veröffentlichten Methoden20,21,22. Alle Verfahren mit Mäusen wurden durch das Tier Ethik experimentelle Ausschuss (AEEC) an der Chinese University of Hong Kong genehmigt.
1. Vorbereitung des OP9 bedingte Medium
<ol><li>Kultur die murinen Stroma-Zell-Linie OP9 in Alpha-MEM mit 20 % FBS, 100 U/mL...

<ol>
	<li>Schreiber, R. D., Old, L. J., Smyth, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+immunoediting:+integrating+immunity's+roles+in+cancer+suppression+and+promotion.">Cancer immunoediting: integrating immunity's roles in cancer suppression and promotion.</a> Science. 331 (6024), 1565-1570 (2011).</li><li>Junttila, M. R., de Sauvage, F. 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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+NK1.1+,+Ly49++NK+cells+from+flt3++multipotent+marrow+progenitor+cells.">Differentiation of NK1.1+, Ly49+ NK cells from flt3+ multipotent marrow progenitor cells.</a> J Immunol. 163 (5), 2648-2656 (1999).</li><li>Fathman, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+earliest+natural+killer+cell-committed+progenitor+in+murine+bone+marrow.">Identification of the earliest natural killer cell-committed progenitor in murine bone marrow.</a> Blood. 118 (20), 5439-5447 (2011).</li><li>Tang, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smad3+promotes+cancer+progression+by+inhibiting+E4BP4-mediated+NK+cell+development.">Smad3 promotes cancer progression by inhibiting E4BP4-mediated NK cell development.</a> Nat Commun. 6 (8), 14677 (2017).</li></ol>

In der vorliegenden Arbeit haben wir eine neuartige Methode zur Herstellung von Knochenmark stammenden murinen NK Zellen in Vitrobeschrieben. Die Zelle Zuführung in das ursprüngliche System21,22 wird erfolgreich durch das Medium bedingte OP9 Zellen, die weitgehend die Stabilität des Systems der Differenzierung erhöht ersetzt. Darüber hinaus kann das System hohen Menge produzieren und Reinheit der Reife NK Zellen in Vitro als auch in Viv...

Tumorprogression ist weitgehend abhängig von den Tumor Mikroumgebung1,2, einschließlich Host abgeleitet Immunzellen, z.B., NK-Zellen. Mehrere Studien gezeigt, dass die intratumorale NK-Zellen mit dem Tumor Progression3,4negativ korreliert sind. Klinische Studien zeigten darüber hinaus, dass NK-Zell-Adoptiv-Therapie eine mögliche Strategie für Krebs5,6,7,8,9 ist. NK-Zell-basierte Krebs-Immuntherapie wurde vor kurzem als eine Therapieoption bei soliden Tumoren vorgeschlagen, aber Herausforderungen gibt es durch die Sekretion von immunsuppressive Zytokine und Downregulation Liganden in der Mikroumgebung von soliden Tumoren zu aktivieren 10,11. Umwandlung Wachstumsfaktor-β (TGF-β) ist eine suppressive Rolle in der Karzinogenese vorgeschlagen worden, aber paradoxerweise Krebszellen produzieren auch TGF-β1 zur Unterstützung der Tumor Entwicklung12,13,14 , 15. TGF-β-Signalisierung kann die zytolytischen Aktivität von NK-Zellen über Down-Regulierung Interferon Reaktionsfähigkeit und CD16-vermittelten Interferon-Gamma (IFN-γ) Produktion in-vitro-16,17, unterdrücken 18.
Obwohl Störungen von TGF-β-Signalisierung in der Mikroumgebung Tumor eine Möglichkeit zur Beseitigung von Krebs sein kann, wird vollständige Sperrung der TGF-β-Signalisierung Autoimmunerkrankungen durch seine entzündungshemmende Funktion dazu führen, dass ausweislich der Entwicklung Nebenwirkungen einschließlich systemische Entzündung, modelliert Herz-Kreislauf-Mängel und Autoimmunität in Maus19. So wird Verständnis der Arbeitsmechanismus der TGF-β-vermittelten Immunsuppression zur Identifizierung einer zugänglichen therapeutisches Ziel für die Behandlung von Krebs führen.
Um die molekularen Ereignisse notwendig für NK-Zell-Entwicklung zu erhellen, gegründet Williams Et Al. eine in Vitro -System Differenzierung murinen Knochenmark hämatopoetischen Stammzellen in NK20Zellen. Dieses System erleichtert vor allem die mechanistische Untersuchung der NK-Zell-Entwicklung, einschließlich der Ermittlung der neuartigen Stammväter von NK-Zellen-21. Jedoch Knochenmark Stammväter sollten im System mit OP9 Stromazellen Stützzellen als ein Feeder Schicht20,21kultiviert werden, und diese heterogene Zellpopulation weitgehend beschränkt die weitere Anwendung der gen-Störung Werkzeuge (z.B., SiRNA-vermittelten Gen-silencing) speziell auf die differenzierenden NK-Zellen angewendet.
Hier beschreiben wir ein Feeder-freie System, das durch eine weitere Änderung der in-vitro- System von Williams Et Al20entwickelt wurde. In unserem System der OP9 Stromazellen Feeder-Zellen sind nicht erforderlich, und stattdessen OP9 bedingte Medium verwendet wird, ohne Auswirkungen auf die Differenzierung der NK Zellen in Vitro, und dies vor kurzem führen uns zu entdecken, dass TGF-β Tumorprogression über fördern kann E4bp4-abhängige NK-Zell-Entwicklung in den Tumor Mikroumgebung22zu unterdrücken. Dieses neuartige System bietet erfolgreich eine Hintergrund-freie Methode für die Aufklärung des molekularen Mechanismus der NK-Zell-Entwicklung unter bestimmten Bedingungen (z.B.hohe TGF-β1, SiRNA-vermittelten Gen-silencing, etc..) in Vitro.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1113px;" width="1113">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:297px;">OP9 cell line</td>
			<td style="width:129px;">ATCC</td>
			<td style="width:344px;">ATCC&#174; CRL-2749&#8482;</td>
			<td style="width:343px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">MEM &#945;, no nucleosides</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>22561021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10500064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PBS, pH 7.4</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Recombinant Murine IL-7</td>
			<td>PEPROTECH</td>
			<td>217-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Recombinant Murine SCF</td>
			<td>PEPROTECH</td>
			<td>250-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Recombinant Murine Flt3-Ligand</td>
			<td>PEPROTECH</td>
			<td>250-31L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Recombinant Murine IL-2</td>
			<td>PEPROTECH</td>
			<td>212-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Lipofectamin RNAiMAX Transfection Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>1377815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">IC Fixation Buffer&#160;</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>00-8222-49</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Flow Cytometry Staining Buffer&#160;</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>00-4222-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PE-conjugated anti-mouse CD244</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-2441-83</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cy3-conjugated anti-mouse NKp46</td>
			<td>Bioss</td>
			<td>bs-2417R-cy3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Nonsense control (NC)</td>
			<td>Ribobio</td>
			<td>siN05815122147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">siRNA against mouse E4BP4 mRNA</td>
			<td>Ribobio</td>
			<td>N/A</td>
			<td>5&#8242;-GAUGAGGGUGUA 
			GUGGGCAAGUCUU-3&#8242;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a novel feeder-free system for mass production of murine natural killer cells in vitro

Natürliche killer (NK) Zellen des angeborenen Immunsystems gehören und sind eine Erstlinien Anti-Krebs-Immunabwehr; aber sie werden in den Tumor Mikroumgebung unterdrückt und der zugrunde liegende Mechanismus ist noch weitgehend unbekannt. Das Fehlen einer einheitlichen und zuverlässigen Quelle von NK-Zellen begrenzt den Forschungsfortschritt NK Zelle Immunität. Hier berichten wir über eine in-vitro- System, die hohe Qualität und Quantität der Knochenmark-abgeleitete murinen NK-Zellen unter einem Feeder-freie Zustand zur Verfügung stellen kann. Noch wichtiger ist, zeigen wir auch, dass SiRNA-vermittelten Gen-silencing erfolgreich die E4bp4-abhängige NK Zelle Reifung hemmt durch den Einsatz dieses Systems. Somit ist diese neuartige in-vitro- NK-Zelle Unterscheidung System eine Biomaterial-Lösung für Immunitäts-Forschung.

Repräsentative Ergebnisse nach dem beschriebenen Protokoll. Insgesamt Knochenmarkzellen Aussetzung wurden unter dem Zubringer-freie Unterscheidung System für 11 Tage kultiviert; deutlichen Anstieg der Proliferationsrate wurde von Tag 7 im Vergleich mit der Anzahl der gesamten Zellen am Tag 0 (Abb. 1A) beobachtet. Reife NK-Zellen mit hohen Kernenergie bis zytoplasmatischen Verhältnis und Granulat-reiche Zytoplasma Morphologie wurden von Tag...

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Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur Gen-silencing murine NK-Zellen durch ein Feeder-freie Unterscheidung System für mechanistischen Studie in Vitro und in Vivoin Serienfertigung herzustellen.

Ein neuartiges Feeder-freie System für die Massenproduktion von murinen Natural Killer Cells In Vitro

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

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Herstellung und Verwendung von HIV-1 infizierten primären CD4 + T-Zellen als Zielzellen in der natürlichen Killerzellen Zytotoxische Assays

 Natural killer (NK) cells are a vital component of the innate immune response to virus-infected cells. It is important to understand the ability of NK ...

Forschung

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