Name: a novel feeder-free system for mass production of murine natural killer cells in vitro
Uploaded: 2018-01-09T14:00:00
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Questo studio è stato sostenuto dal Research Grants Consiglio di Hong Kong (GRF 468513, CUHK3/CRF/12R) l'innovazione e fondo della tecnologia di Hong Kong (15/227/ITS, ITS InP/164/16, ITS-InP/242/16), sovvenzione diretta per ricerca-CUHK (2016.035) e studioso di Hong Kong Programma.
H.-Y.L. progettato e supervisionato tutti gli esperimenti e contribuito alla preparazione del manoscritto. P.M.-K.T. eseguirono degli esperimenti, hanno analizzato i dati e ha contribuito alla preparazione del manoscritto. P.C.-T. T., J.Y.-F.C., J.S.-C., H., d.-M.W., e G.-Y.L. raccolti campioni animali e partecipato negli esperimenti sugli animali. J.S., X.-R.H., e K.-F.T. contribuito alla preparazione del manoscritto.

Il protocollo per ottenere e differenziazione NK derivate da midollo osseo cellule (BM-NK) si basa su metodi precedentemente pubblicati20,21,22. Tutte le procedure con i topi sono state approvate da animale etica sperimentale Comitato (AEEC) presso l'Università cinese di Hong Kong.
1. preparazione del Medium condizionato OP9
<ol><li>Cultura la linea cellulare murina stroma OP9 in alfa-MEM contenent...

<ol>
	<li>Schreiber, R. D., Old, L. J., Smyth, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+immunoediting:+integrating+immunity's+roles+in+cancer+suppression+and+promotion.">Cancer immunoediting: integrating immunity's roles in cancer suppression and promotion.</a> Science. 331 (6024), 1565-1570 (2011).</li><li>Junttila, M. R., de Sauvage, F. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+disruption+of+the+mouse+transforming+growth+factor-&#946;1+gene+results+in+multifocal+inflammatory+disease.">Targeted disruption of the mouse transforming growth factor-&#946;1 gene results in multifocal inflammatory disease.</a> Nature. 359 (6397), 693-699 (1992).</li><li>Chen, T. J., Kotecha, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytobank:+providing+an+analytics+platform+for+community+cytometry+data+analysis+and+collaboration.">Cytobank: providing an analytics platform for community cytometry data analysis and collaboration.</a> Curr Top Microbiol Immunol. 377, 127-157 (2014).</li><li>Williams, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+NK1.1+,+Ly49++NK+cells+from+flt3++multipotent+marrow+progenitor+cells.">Differentiation of NK1.1+, Ly49+ NK cells from flt3+ multipotent marrow progenitor cells.</a> J Immunol. 163 (5), 2648-2656 (1999).</li><li>Fathman, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+earliest+natural+killer+cell-committed+progenitor+in+murine+bone+marrow.">Identification of the earliest natural killer cell-committed progenitor in murine bone marrow.</a> Blood. 118 (20), 5439-5447 (2011).</li><li>Tang, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smad3+promotes+cancer+progression+by+inhibiting+E4BP4-mediated+NK+cell+development.">Smad3 promotes cancer progression by inhibiting E4BP4-mediated NK cell development.</a> Nat Commun. 6 (8), 14677 (2017).</li></ol>

Nel presente lavoro, abbiamo descritto un metodo novello per la produzione di cellule NK murina derivanti dal midollo osseo in vitro. L'alimentatore delle cellule nel sistema originale21,22 è sostituito con successo dal medium condizionato delle cellule OP9, che in gran parte aumentata la stabilità del sistema di differenziazione. Inoltre, il sistema può produrre elevate quantità e purezza di NK maturo cellule per in vitro come pure in v...

Progressione del cancro dipende in larga misura il tumore microambiente1,2, tra cui immunociti host-derivato, ad esempio, le cellule NK. Numerosi studi hanno dimostrato che le cellule NK intratumoral sono correlate negativamente con la progressione del tumore3,4. Inoltre, studi clinici hanno mostrato che la terapia adottiva delle cellule NK è una possibile strategia per cancro5,6,7,8,9. L'immunoterapia del cancro basati su cellule NK recentemente è stato suggerito come opzione terapeutica per i tumori solidi, ma sfide esistano dovuto la secrezione di citochine immunosoppressive e downregulation di attivazione ligandi nel microambiente dei tumori solidi 10,11. Trasformando il fattore di crescita-β (TGF-β) è stato suggerito per svolgere un ruolo soppressivo nella carcinogenesi, ma paradossalmente le cellule tumorali producono anche TGF-β1 per supportare il tumore sviluppo12,13,14 , 15. segnalazione di TGF-β può sopprimere l'attività citolitica delle cellule di NK via giù-regolando la velocità di risposta dell'interferone e CD16-mediata di interferone-gamma (IFN-γ) produzione in vitro16,17, 18.
Anche se la rottura di segnalazione di TGF-β nel microambiente tumorale possa essere un modo possibile per l'eliminazione dei tumori, bloccando completamente segnalazione di TGF-β causerà malattie autoimmuni grazie alla sua funzione di anti-infiammatori, come testimoniano lo sviluppo della effetti collaterali tra cui l'infiammazione sistemica, difetti cardiovascolari e autoimmunità nel topo modelle19. Così, la comprensione del meccanismo di funzionamento di TGF-β-mediata immunosoppressione porteranno all'identificazione di un accessibile obiettivo terapeutico per il trattamento del cancro.
Per delucidare gli eventi molecolari necessari per lo sviluppo delle cellule NK, Williams et al. stabilite un sistema in vitro per la differenziazione di cellule staminali emopoietiche del midollo osseo murino in NK cells20. Questo sistema facilita in gran parte lo studio meccanicistico di sviluppo delle cellule NK, compresa l'individuazione di nuovi progenitori delle cellule NK21. Tuttavia, i progenitori di midollo osseo dovrebbero essere coltivati nel sistema con il supporto di cellule stromali OP9 come un alimentatore strato20,21, e questa popolazione cellulare eterogenea limita in gran parte l'applicazione ulteriore gene di interruzione strumenti (ad es., silenziamento genico mediato da siRNA) specificamente applicata per la differenziazione delle cellule NK.
Qui, descriviamo un sistema privo di alimentatore che è stato sviluppato modificando ulteriormente il sistema in vitro di Williams et al.20. Nel nostro sistema, le cellule stromal alimentatore OP9 non sono necessari, e invece OP9 medium condizionale è usato senza influenzare la differenziazione delle cellule NK in vitroe questo recentemente ci portano a scoprire che il TGF-β è in grado di promuovere la progressione del cancro tramite sopprimere lo sviluppo delle cellule NK E4bp4-dipendente nel microambiente tumorale22. Questo nuovo sistema fornisce con successo un metodo privo di sfondo per delucidare il meccanismo molecolare di sviluppo delle cellule NK in condizioni specifiche (ad es., alta TGF-β1, silenziamento genico mediato da siRNA, ecc.) in vitro.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1113px;" width="1113">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:297px;">OP9 cell line</td>
			<td style="width:129px;">ATCC</td>
			<td style="width:344px;">ATCC&#174; CRL-2749&#8482;</td>
			<td style="width:343px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">MEM &#945;, no nucleosides</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>22561021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10500064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PBS, pH 7.4</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Recombinant Murine IL-7</td>
			<td>PEPROTECH</td>
			<td>217-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Recombinant Murine SCF</td>
			<td>PEPROTECH</td>
			<td>250-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Recombinant Murine Flt3-Ligand</td>
			<td>PEPROTECH</td>
			<td>250-31L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Recombinant Murine IL-2</td>
			<td>PEPROTECH</td>
			<td>212-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Lipofectamin RNAiMAX Transfection Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>1377815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">IC Fixation Buffer&#160;</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>00-8222-49</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Flow Cytometry Staining Buffer&#160;</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>00-4222-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PE-conjugated anti-mouse CD244</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-2441-83</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cy3-conjugated anti-mouse NKp46</td>
			<td>Bioss</td>
			<td>bs-2417R-cy3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Nonsense control (NC)</td>
			<td>Ribobio</td>
			<td>siN05815122147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">siRNA against mouse E4BP4 mRNA</td>
			<td>Ribobio</td>
			<td>N/A</td>
			<td>5&#8242;-GAUGAGGGUGUA 
			GUGGGCAAGUCUU-3&#8242;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a novel feeder-free system for mass production of murine natural killer cells in vitro

Cellule natural killer (NK) appartengono al sistema immunitario innato e sono una difesa immune prima linea anti-cancro; Tuttavia, essi vengono soppressi nel microambiente tumorale e il meccanismo di fondo è ancora in gran parte sconosciuto. La mancanza di una fonte affidabile e coerenza delle cellule di NK limita i progressi della ricerca di immunità delle cellule NK. Qui, segnaliamo un sistema in vitro che in grado di fornire alta qualità e quantità derivate da midollo osseo murine delle cellule di NK in una condizione senza alimentatore. Ancora più importante, inoltre dimostriamo che con successo silenziamento genico mediato da siRNA inibisce la maturazione delle cellule NK E4bp4-dipendente utilizzando questo sistema. Così, questa romanzo in vitro cellule NK differenziazione del sistema sono una soluzione di biomateriale per ricerca di immunità.

Risultati rappresentativi sono ottenuti seguendo il protocollo descritto. Cellule in sospensione totale del midollo osseo sono state coltivate sotto il sistema di differenziazione privo di alimentatore per 11 giorni; significativo aumento nel tasso di proliferazione è stata osservata di giorno 7 rispetto al numero delle cellule totali il giorno 0 (Figura 1A). Cellule NK mature con alto rapporto nucleare citoplasmico e citoplasma ricco di gra...

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A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Qui, presentiamo un protocollo per produrre cellule NK murine silenziamento genico utilizzando un sistema di differenziazione privo di alimentatore per studi meccanicistici in vitro e in vivo.

Un nuovo sistema privo di alimentatore per la produzione di massa di cellule di assassino naturali murini In Vitro

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...

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A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

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 Natural killer (NK) cells are a vital component of the innate immune response to virus-infected cells. It is important to understand the ability of NK ...

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