Name: a novel feeder-free system for mass production of murine natural killer cells in vitro
Uploaded: 2018-01-09T14:00:00
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Este estudio fue apoyado por la investigación subvenciones Consejo de Hong Kong (GRF 468513, CUHK3/FRC/12R) y la innovación y tecnología fondo de Hong Kong (15/227/ITS, ITS InP/164/16, su-InP/242/16), la subvención directa para investigación-CUHK (2016.035) y erudito de Hong Kong Programa.
H. Y.L. diseñados y supervisados todos los experimentos y contribuyó a la preparación del manuscrito. P.M.-K.T. realizó experimentos, analizar datos y contribuyó a la preparación del manuscrito. P.C.-T. T., J.Y.-F.C., J.S.-C., H., p.-M.W., y G. Y.L. recolectó muestras animales y participó en los experimentos con animales. J.S., X.-RH, y K. F.T. contribuyó a la preparación del manuscrito.

El protocolo para la obtención y diferenciación NK médula ósea células (BM-NK) se basa en métodos previamente publicados20,21,22. Todos los procedimientos con los ratones han sido aprobados por el Animal ética Experimental Comité (AEEC) en la Universidad China de Hong Kong.
1. preparación del medio condicional OP9
<ol><li>Cultura de la línea de celular del estroma murino OP9 en alfa-MEM qu...

<ol>
	<li>Schreiber, R. D., Old, L. J., Smyth, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+immunoediting:+integrating+immunity's+roles+in+cancer+suppression+and+promotion.">Cancer immunoediting: integrating immunity's roles in cancer suppression and promotion.</a> Science. 331 (6024), 1565-1570 (2011).</li><li>Junttila, M. R., de Sauvage, F. 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H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+TGF-&#946;/SMAD+pathway+is+an+important+mechanism+for+NK+cell+immune+evasion+in+childhood+B-acute+lymphoblastic+leukemia.">The TGF-&#946;/SMAD pathway is an important mechanism for NK cell immune evasion in childhood B-acute lymphoblastic leukemia.</a> Leukemia. 30 (4), 800-811 (2016).</li><li>Derynck, R., Akhurst, R. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+roles+of+TGF&#946;+in+the+tumour+microenvironment.">The roles of TGF&#946; in the tumour microenvironment.</a> Nat Rev Cancer. 13 (11), 788-799 (2013).</li><li>Rook, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+transforming+growth+factor+beta+on+the+functions+of+natural+killer+cells:+depressed+cytolytic+activity+and+blunting+of+interferon+responsiveness.">Effects of transforming growth factor beta on the functions of natural killer cells: depressed cytolytic activity and blunting of interferon responsiveness.</a> J Immunol. 136 (10), 3916-3920 (1986).</li><li>Bellone, G., Aste-Amezaga, M., Trinchieri, G., Rodeck, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+NK+cell+functions+by+TGF-beta+1.">Regulation of NK cell functions by TGF-beta 1.</a> J Immunol. 155 (3), 1066-1073 (1995).</li><li>Trotta, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-&#946;+utilizes+SMAD3+to+inhibit+CD16-mediated+IFN-&#947;+production+and+antibody-dependent+cellular+cytotoxicity+in+human+NK+cells.">TGF-&#946; utilizes SMAD3 to inhibit CD16-mediated IFN-&#947; production and antibody-dependent cellular cytotoxicity in human NK cells.</a> J Immunol. 181 (6), 3784-3792 (2008).</li><li>Shull, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+disruption+of+the+mouse+transforming+growth+factor-&#946;1+gene+results+in+multifocal+inflammatory+disease.">Targeted disruption of the mouse transforming growth factor-&#946;1 gene results in multifocal inflammatory disease.</a> Nature. 359 (6397), 693-699 (1992).</li><li>Chen, T. J., Kotecha, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytobank:+providing+an+analytics+platform+for+community+cytometry+data+analysis+and+collaboration.">Cytobank: providing an analytics platform for community cytometry data analysis and collaboration.</a> Curr Top Microbiol Immunol. 377, 127-157 (2014).</li><li>Williams, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+NK1.1+,+Ly49++NK+cells+from+flt3++multipotent+marrow+progenitor+cells.">Differentiation of NK1.1+, Ly49+ NK cells from flt3+ multipotent marrow progenitor cells.</a> J Immunol. 163 (5), 2648-2656 (1999).</li><li>Fathman, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+earliest+natural+killer+cell-committed+progenitor+in+murine+bone+marrow.">Identification of the earliest natural killer cell-committed progenitor in murine bone marrow.</a> Blood. 118 (20), 5439-5447 (2011).</li><li>Tang, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smad3+promotes+cancer+progression+by+inhibiting+E4BP4-mediated+NK+cell+development.">Smad3 promotes cancer progression by inhibiting E4BP4-mediated NK cell development.</a> Nat Commun. 6 (8), 14677 (2017).</li></ol>

En el presente trabajo, hemos descrito un nuevo método para la producción de células NK murinas derivadas de médula ósea in vitro. El alimentador de la célula en el sistema original21,22 es substituido con éxito por el medio condicionado de OP9 células, que aumenta en gran medida la estabilidad del sistema de diferenciación. Además, el sistema puede producir alta cantidad y pureza de NK madura las células para en vitro como en viv...

La progresión del cáncer depende en gran medida de la tumor microambiente1,2, incluyendo immunocytes derivados de host, por ejemplo, las células NK. Varios estudios demostraron que las células NK intratumoral están negativamente correlacionadas con la progresión de tumor3,4. Además, los estudios clínicos demostraron que la terapia adoptiva con células NK es una posible estrategia para cáncer5,6,7,8,9. Inmunoterapia de cáncer basado en la célula NK fue sugerida recientemente como una opción terapéutica para tumores sólidos, pero existen desafíos debido a la secreción de citocinas inmunosupresoras y downregulation de la activación de ligandos en el microambiente de tumores sólidos 10,11. Transformación de factor de crecimiento β (TGF-β) se ha sugerido para desempeñar un papel represivo en la carcinogénesis, pero paradójicamente las células cancerosas también producen TGF-β1 para apoyar el desarrollo de tumor12,13,14 , 15. señalización de TGF-β puede suprimir la actividad citolítica de las células NK a través de la abajo-regulación de la respuesta de interferón y CD16 mediada por interferón-gamma (IFN-γ) producción en vitro16,17, 18.
Aunque interrupción de señalización de TGF-β en el microambiente del tumor puede ser una forma para eliminar el cáncer, bloqueando totalmente la señalización de TGF-β causará enfermedades autoinmunes debido a su función antiinflamatoria, según lo evidenciado por el desarrollo de efectos secundarios adversos incluyendo la inflamación sistémica, defectos cardiovasculares y autoinmunidad en ratones modelos19. Por lo tanto, comprender el mecanismo de trabajo de inmunosupresión mediada por el TGF-β conducirá a la identificación de una diana terapéutica accesible para tratar el cáncer.
Para dilucidar los eventos moleculares necesarios para el desarrollo de las células NK, Williams et al. estableció un sistema in vitro para diferenciar células madre hematopoyéticas de médula ósea murina en NK células20. Este sistema facilita en gran medida el estudio mecanicista del desarrollo de las células NK, incluyendo la identificación de nuevos progenitores de las células NK21. Sin embargo, los progenitores de médula ósea se deben cultivar en el sistema con el apoyo de las células stromal OP9 como un alimentador capa20,21, y esta población celular heterogénea limita en gran medida el uso adicional de alterar gen herramientas (p. ej., silenciamiento génico mediado por siRNA) específicamente aplicada a las células NK diferenciadoras.
Aquí, describimos un sistema libre de alimentación que ha sido desarrollado por más modificar el sistema en vitro de Williams et al20. En nuestro sistema, las células stromal alimentador de OP9 no están obligatorio, y en su lugar OP9 medio condicional se utiliza sin afectar a la diferenciación de las células NK en vitroy recientemente nos llevan a descubrir que el TGF-β es capaz de promover la progresión del cáncer a través de suprimir el desarrollo de las células NK E4bp4 dependientes del microambiente tumoral del22. Este novedoso sistema con éxito proporciona un método libre de antecedentes para dilucidar el mecanismo molecular del desarrollo de las células NK en condiciones específicas (p. ej., alta TGF-β1, mediada por siRNA silenciamiento, etcetera.) en vitro.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1113px;" width="1113">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:297px;">OP9 cell line</td>
			<td style="width:129px;">ATCC</td>
			<td style="width:344px;">ATCC&#174; CRL-2749&#8482;</td>
			<td style="width:343px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">MEM &#945;, no nucleosides</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>22561021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10500064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PBS, pH 7.4</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Recombinant Murine IL-7</td>
			<td>PEPROTECH</td>
			<td>217-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Recombinant Murine SCF</td>
			<td>PEPROTECH</td>
			<td>250-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Recombinant Murine Flt3-Ligand</td>
			<td>PEPROTECH</td>
			<td>250-31L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Recombinant Murine IL-2</td>
			<td>PEPROTECH</td>
			<td>212-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Lipofectamin RNAiMAX Transfection Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>1377815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">IC Fixation Buffer&#160;</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>00-8222-49</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Flow Cytometry Staining Buffer&#160;</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>00-4222-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PE-conjugated anti-mouse CD244</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-2441-83</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cy3-conjugated anti-mouse NKp46</td>
			<td>Bioss</td>
			<td>bs-2417R-cy3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Nonsense control (NC)</td>
			<td>Ribobio</td>
			<td>siN05815122147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">siRNA against mouse E4BP4 mRNA</td>
			<td>Ribobio</td>
			<td>N/A</td>
			<td>5&#8242;-GAUGAGGGUGUA 
			GUGGGCAAGUCUU-3&#8242;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a novel feeder-free system for mass production of murine natural killer cells in vitro

Natural killer (NK) las células pertenecen al sistema inmune innato y son una defensa inmune de primera línea contra el cáncer; sin embargo, se suprimen en el microambiente del tumor y el mecanismo subyacente es todavía desconocido. La falta de una fuente constante y confiable de las células NK limita el progreso de la investigación de la inmunidad de la célula NK. Aquí, Divulgamos un sistema en vitro que puede proporcionar alta calidad y la cantidad de médula ósea murina las células NK en una condición libre de alimentador. Más importante aún, demostramos que con éxito mediada por siRNA silenciamiento inhibe la maduración de la célula NK E4bp4 dependientes mediante el uso de este sistema. Así, esta novela en vitro NK célula diferenciando el sistema es una solución de biomaterial para la investigación de la inmunidad.

Resultados representativos se obtienen siguiendo el protocolo descrito. Las células de suspensión total de la médula se cultivaron bajo el sistema de diferenciación alimentador-libre durante 11 días; se observó aumento significativo en la tasa de proliferación por día 7 en comparación con el número de células totales en el día 0 (figura 1A). Las células NK maduras con alto cociente nuclear a citoplasmática y citoplasma rico en g...

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A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Aquí, presentamos un protocolo para producir en masa las células murinas de silenciamiento génico NK usando un sistema de diferenciación libre de alimentador para estudios mecanísticos in vitro e in vivo.

Un novedoso sistema de alimentador-libre para la producción masiva de células de asesino naturales murinos In Vitro

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...

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