Name: highly sensitive and quantitative detection of proteins and their isoforms by capillary isoelectric focusing method
Uploaded: 2018-09-19T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Highly Sensitive and Quantitative Detection of Proteins and Their Isoforms by Capillary Isoelectric Focusing Method at JoVE.com

صاحب البلاغ وذلك بفضل الأستاذ لينا كلايسون-الويلزية، جامعة أوبسالا، السويد عن تأييدها لتطوير هذا المشروع. بالإضافة إلى ذلك، فضل صاحب البلاغ روس سميث ولينا كلايسون-الويلزية، جامعة أوبسالا لقراءة نقدية واقتراحات لتحسين هذه المخطوطة.

1-الثقافة والتحفيز، وتحلل الخلية
ملاحظة: يمكن استخدام هذا الأسلوب مع العديد من أنواع الخلايا. ويرد لتوضيح الأسلوب، مثال على استخدام الخلايا البطانية البشرية الوريد السري (هوفيكس).
<ol><li>والثقافة هوفيكس على المغلفة بالجيلاتين، أطباق بيتري 10 سم في المتوسط غشائي الخلايا القاع...

<ol>
	<li>O'Neill, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isoelectric+focusing+technology+quantifies+protein+signaling+in+25+cells.">Isoelectric focusing technology quantifies protein signaling in 25 cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (44), 16153-16158 (2006).</li><li>Aspinall-O'Dea, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody-based+detection+of+protein+phosphorylation+status+to+track+the+efficacy+of+novel+therapies+using+nanogram+protein+quantities+from+stem+cells+and+cell+lines.">Antibody-based detection of protein phosphorylation status to track the efficacy of novel therapies using nanogram protein quantities from stem cells and cell lines.</a> Nat Protoc. 10 (1), 149-168 (2015).</li><li>Fan, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanofluidic+proteomic+assay+for+serial+analysis+of+oncoprotein+activation+in+clinical+specimens.">Nanofluidic proteomic assay for serial analysis of oncoprotein activation in clinical specimens.</a> Nat Med. 15 (5), 566-571 (2009).</li><li>Padhan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+sensitivity+isoelectric+focusing+to+establish+a+signaling+biomarker+for+the+diagnosis+of+human+colorectal+cancer.">High sensitivity isoelectric focusing to establish a signaling biomarker for the diagnosis of human colorectal cancer.</a> BMC Cancer. 16 (1), 683 (2016).</li><li>Sun, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGFR2+induces+c-Src+signaling+and+vascular+permeability+in+vivo+via+the+adaptor+protein+TSAd.">VEGFR2 induces c-Src signaling and vascular permeability in vivo via the adaptor protein TSAd.</a> J Exp Med. 209 (7), 1363-1377 (2012).</li><li>Iacovides, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+quantification+of+AKT+isoforms+and+phosphoforms+in+breast+cancer+using+a+novel+nanofluidic+immunoassay.">Identification and quantification of AKT isoforms and phosphoforms in breast cancer using a novel nanofluidic immunoassay.</a> Mol Cell Proteomics. 12 (11), 3210-3220 (2013).</li><li>Price, F. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+JAK-STAT+signaling+stimulates+adult+satellite+cell+function.">Inhibition of JAK-STAT signaling stimulates adult satellite cell function.</a> Nat Med. 20 (10), 1174-1181 (2014).</li><li>Unger, F. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoproteomic+analysis+of+ischemia-dependent+changes+in+signaling+protein+phosphorylation+in+colorectal+normal+and+cancer+tissue.">Nanoproteomic analysis of ischemia-dependent changes in signaling protein phosphorylation in colorectal normal and cancer tissue.</a> J Transl Med. 14, 6 (2016).</li><li>Urasaki, Y., Pizzorno, G., Le, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+uridine+administration+induces+fatty+liver+and+pre-diabetic+conditions+in+mice.">Chronic uridine administration induces fatty liver and pre-diabetic conditions in mice.</a> PLoS One. 11 (1), e0146994 (2016).</li><li>Schmidt, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Case-specific+potentiation+of+glioblastoma+drugs+by+pterostilbene.">Case-specific potentiation of glioblastoma drugs by pterostilbene.</a> Oncotarget. 7 (45), 73200-73215 (2016).</li></ol>

حساسية والقرار من البروتينات ذات أهمية حاسمة لبحوث البروتين في عينات بيولوجية. هناك قيمة كبيرة في كونه قادراً على الكشف عن البروتينات التي موجودة بكميات دقيقة في الخلايا. يمكن أن نقدم سيف تحسين حساسية والقرار للكشف عن البروتينات وعلى إيسوفورمس4.
هذه التكنولوج?...

تركز isoelectric الشعرية (سيف) هو المناعة التلقائية المستندة إلى الشعرية، الذي يحل البروتينات على أساس هذه التهمة1،2،3. أنها استنساخه للغاية وقادرة على حل البروتينات و isoforms بوستترانسلاتيونالي المعدلة سرعة كما وكيفا. وهو يقدم بديلاً للأساليب التقليدية مثل النشاف الغربية. وفي حين النشاف الغربية جيدة جداً لتأكيد وجود وفرة من البروتينات في عينات متاحة؛ تقلب واستهلاك الوقت وجميع الحاضرين دقيقة كوانتيتيشن تحديات، ولا سيما عند فحص عينات الأنسجة البيولوجية. في الواقع، تقلب مشكلة متأصلة في النشاف الغربية، كما أن هناك العديد من الخطوات المعنية، مثل تحميل وتشغيل من الحزب الديمقراطي الصربي صفحة المواد الهلامية، ونقل البروتينات إلى غشاء، حضانة مع الكواشف المختلفة (على سبيل المثال. والابتدائي والثانوي الأجسام المضادة، القامة)، والتنمية على الأشعة السينية الفيلم4. في الوقت الحاضر، هو تحسين تقنية blotting الغربية بتنفيذ التسجيل الرقمي للإشارات تشيميلومينيسسينت (الغرب الرقمية). في الآونة الأخيرة، نظام blotting غربية قد وضعت، إلا وهي شعري الغربي، ونظام أكثر خالية اليدين وخالية من جل. فحص كامل آليا بعد تحميل لوحة عينة (عينات مع جميع الكواشف اللازمة) إلى3،نظام4. الصك الذي سيتم تنفيذ كافة الخطوات مثل فصل البروتين، يغسل التثبيت بروتينات على الجدار الشعرية، والأجسام المضادة إينكوبيشنز، بين الخطوات المختلفة، والتنمية، والتقدير الكمي للإشارات تشيميلومينيسسينت. وهكذا، يوفر الإجراء سيف الذي قدم هنا أعلى من القرار وحساسية.
هذا الأسلوب الحساسة، كما يمكن إنشاء إشارات وكمية من بيكوغرامات من البروتينات1. حساسية عالية مع إمكانية تكرار نتائج ممتازة يجعل هذه التكنولوجيا مفيدة للغاية لتحليل العينات السريرية. يمكن الكشف عن فضلا عن التمييز بين وظيفة التعديل متعدية الجنسيات (مثلاً، isoforms مختلفة من البروتين فوسفوريلاتيد) من البروتينات. هذه التكنولوجيا قد استخدمت بنجاح لتشريح مختلفة مما يشير إلى مسارات4،5 في الدراسات السريرية التي تهدف إلى تطوير علاجات جديدة في سرطان3، وأنه يتمتع بإمكانات كبيرة لاكتشاف العلامات البيولوجية والمخدرات البروتين .

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="920">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:367px;">NanoPro 1000</td>
			<td style="width:107px;">ProteinSimple</td>
			<td style="width:301px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Premix G2, pH 5&#8211;8 (nested) separation gradient, pH 2&#8211;4 plug</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-972</td>
			<td>Ampholyte premix</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DMSO inhibitor mix</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-510</td>
			<td>Phosphatase inhibitors; for cIEF 1:50 dilution used</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Aqueous Inhibitor Mix</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-482</td>
			<td>Protease inhibitor; for cIEF 1:25 dilution used</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">pI standard ladder 3</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-646</td>
			<td>For cIEF 1:60 dilution used</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sample diluent</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-649</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Antibody diluent&#160;</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Wash concentrate</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>041-108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Anolyte Refill</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Catholyte Refill</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-338</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Peroxide XDR</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>041-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Luminol</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Bicine/CHAPS Lysis Buffer</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Capillaries-Charge Separation (1 pack) for&#160;</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>CBS700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Assay Plate/Lid Kit</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Peroxidase-AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)&#160;</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch&#160;</td>
			<td>711-035-152</td>
			<td>For cIEF used (1: 300)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Peroxidase-AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)&#160;</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch&#160;</td>
			<td>715-035-150</td>
			<td>For cIEF used (1: 300)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Phospho-Erk 1/2 Primary Antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9101</td>
			<td>For cIEF used (1: 50)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Pan Erk Primary Antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9102</td>
			<td>For cIEF used (1: 100)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Compass software</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">HUVEC</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>PCS-100-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MV2 (EBM-2)</td>
			<td>PromoCell</td>
			<td>&#160;C-22221</td>
			<td>Endothelia cell basal medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Endothelial Cell Growth Medium MV2 SupplementPack</td>
			<td>PromoCell</td>
			<td>C-39221</td>
			<td>Supplementation to MV2 above</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">VEGFA</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Long R3 IGF</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>85580C/I1146</td>
			<td>Insulin-like growth factor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bioruptor (Sonicator)</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>B01020001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BCA Protein Assay kit&#160;</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>NP0322BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NuPAG MOPS SDS Running Buffer (20X)</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>NP0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NuPAGE Transfer Buffer (20X)</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>NP0006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Immobilon PVDF membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microfuge tube vortexer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Microtiter plate adapter for centrifuge</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Pipettors&#160;</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Tips</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Ice</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

highly sensitive and quantitative detection of proteins and their isoforms by capillary isoelectric focusing method

وقد أصبح Immunoblotting تقنية روتينية في العديد من المختبرات لتوصيف البروتين من العينات البيولوجية. ويوفر البروتوكول التالي استراتيجية بديلة، الشعرية isoelectric التركيز (سيف)، مع العديد من المزايا بالمقارنة مع إيمونوبلوتينج التقليدية. هذا هو أسلوب القائم على جسم الآلي والسريع، والكمية التي إجراء blotting غربية كاملة تجري داخل الشعرية سامسونج. هذا الأسلوب لا يتطلب هلام لنقل إلى غشاء، تجريد من البقع، أو الأشعة السينية الأفلام، الذي يشترط عادة ل immunoblotting التقليدية. وهنا يتم فصل البروتينات وفقا للتهمة (isoelectric نقطة؛ pI)، استخدام أقل من ميكروليتير (400 nL) من مجموع البروتين ليستي. بعد التفريد، البروتينات هي معطلة على جدران الشعيرات الدموية بالأشعة فوق البنفسجية العلاج الخفيفة، تليها الابتدائية والثانوية (الفجل البيروكسيديز (HRP) مترافق) حضانة الأجسام المضادة، يتم الكشف عن الذين ملزمة من خلال تعزيز تشيميلومينيسسينسي (الممنوعين)، توليد إشارة خفيفة يمكن التقاطها وتسجيلها بكاميرا جهاز اقتران (CCD). الصور الرقمية يمكن تحليلها وقياسها كمياً (منطقة الذروة) باستخدام البرمجيات. يمكن التعامل مع هذا الإجراء إنتاجية عالية 96 عينة في وقت واحد؛ هي حساسة للغاية، مع الكشف عن البروتين في مجموعة حلول؛ وتنتج النتائج استنساخه بدرجة عالية بسبب التشغيل الآلي للمكاتب. كل هذه الجوانب قيمة للغاية عندما تكون كمية العينات (مثلعينات الأنسجة والخزعات) عاملاً مقيداً. التقنية بالتطبيقات الأوسع نطاقا، بما في ذلك فحص للمخدرات أو الأجسام المضادة، واكتشاف العلامات البيولوجية، وأغراض التشخيص.

التصميم مقايسة جديدة: ويبين الشكل 1Aبتخطيط لوحة فحص. أقصى حد ممكن، يمكن استخدام الآبار 96 من لوحة 384-جيدا في كتل من 12 بئرا لكل شرط (الأجسام المضادة). يمكن أن تبدأ كل كتلة من 12 بئرا من A1-A12 أو A13-A24. الصفوف تم تلوينها تسمح بالتمييز بين العينات أو المواد ال?...

Watch this Scientific Journal Video about Highly Sensitive and Quantitative Detection of Proteins and Their Isoforms by Capillary Isoelectric Focusing Method at JoVE.com

Highly Sensitive and Quantitative Detection of Proteins and Their Isoforms by Capillary Isoelectric Focusing Method

تركز isoelectric الشعرية أسلوب المستندة إلى جسم، أولتراسينسيتيفي، وارتفاع إنتاجية، مما يتيح وصف مفصل للبروتينات وما إيسوفورمس من عينات بيولوجية ضئيلة للغاية. فيما يلي وصف لوضع بروتوكول للكشف والتحديد الكمي لبروتينات محددة وعلى إيسوفورمس بطريقة تلقائية و robotized.

كشف حساسة للغاية وكمية من البروتينات وعلى إيسوفورمس بطريقة تركز Isoelectric الشعرية

Immunoblotting has become a routine technique in many laboratories for protein characterization from biological samples. The following protocol provides ...

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال البحوث الطبية الحيوية، مثل اكتشاف العلامات البيولوجية، واكتشاف الأدوية، والتشخيص، وفحص الأدوية أو الأجسام المضادة. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها عالية الإنتاجية ويمكنها اكتشاف أشكال البروتين على نحو قابل للاستنساخ. الآثار المترتبة على هذه التقنية تمتد نحو تشخيص العديد من الأمراض لأنها يمكن أن تقيس البروتينات المتضررة أو isoforms.على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة مسارات إشارات الخلية، فإنه يمكن أيضا أن تطبق على أنظمة أخرى حيث بروتينات محددة تحتاج إلى تحليل. المرئية مظاهرة من هذا الأسلوب أمر بالغ الأهمية كما خطوات الفحص من الصعب تعلم بسبب الحيل، مثل إزالة فقاعات، تحميل لوحة، وهلم جرا. أولاً، إعداد مزيج diluent عينة عن طريق إضافة ميكرولتر واحد من مزيج مثبطات DMSO واثنين من microliters من مثبطات البروتياز إلى 47 ميكرولترات من عينة diluent، بحيث التركيز النهائي من DMSO ومثبطات البروتياز هو واحد X.Dilute البروتين المعزول سابقا باستخدام مزيج diluent عينة للحصول على التركيزات المطلوبة.المقبل, إضافة 3.325 ميكرولترات من سلم القياسية, ستة ميكرولتررس من مثبطات البروتياز, وثلاثة ميكرولترات من مثبطات DMSO إلى 137.675 ميكرولترات من قبل ميثوليت. دوامة العينة على الأقل 15 ثانية والحفاظ على الجليد. مزيج من اثنين من الحلول المعدة في نسبة واحد إلى ثلاثة بحيث تركيزات النهائي من مثبطات PROTEAS DMSO والسلالم القياسية نقطة isoelectric هي واحدة X والبروتينات في الشعيرات الدموية تصل إلى التركيزات النهائية المرجوة.بعد إضافة البروتينات إلى خليط العينة، سيتم تنفيذ جميع الخطوات على الجليد أو عند أربع درجات مئوية. ضع لوحة 384-جيدا على الجليد. تحميل عشرة ميكرولترات من مزيج عينة في بئر المناسبة من لوحة، وفقا لتخطيط قالب المقايسة مصممة مع برنامج نظام النشاف الغربية الآلي.بعد ذلك، تمييع الأجسام المضادة الأولية والثانوية مع ذوبان الأجسام المضادة. ثم، ماصة عشرة ميكرولترات من الأجسام المضادة الأولية و 15 ميكرولترات من الأجسام المضادة الثانوية في كل بئر. بعد ذلك، مزيج من اللمعان و بيروكسيد XDR في نسبة واحد إلى واحد.الماصات 15 ميكرولترات من مزيج بيروكسيد لومينيل في كل بئر. وبمجرد إضافة العينات والريغان إلى اللوحة، فإن أجهزة الطرد المركزي لمدة عشر دقائق تبلغ 2500 مرة G وأربع درجات مئوية لتدور أسفل السائل وتزيل الفقاعات. إذا كانت الفقاعات لا تزال موجودة، إزالتها يدويا باستخدام طرف ماصة رقيقة.افتح برنامج نظام النشاف الغربي الآلي وانقر فوق new'from the ملف القائمة. انتقل إلى جزء التخطيط وتعيين مواقع لـ reagants والعينات في لوحة 384-well. جعل مهمة reagant بالنقر فوق بئر في أي مكان في الكتلة.حدد كتلة صف من 12 بئرًا لكل منها. بعد ذلك، انتقل إلى شريط الأدوات جزء تخطيط وإدراج كتلة صف أساسي أو ثانوي أو لومين. انتقل إلى جزء البروتوكول وحدد موقع reagant في اللوحة.ثم انقر فوق الخلية في عمود العينة وحدد ريجانت من القائمة المنسدلة. وبنفس الطريقة، حدد مواقع الريغانت للأماكن الابتدائية والثانوية والمينفلة لكل دورة. انقر فوق الخلايا واحدة في كل مرة في عمود الأجسام المضادة الأولية أو الثانوية وتغيير أوقات الحضانة إذا لزم الأمر.ثم، إضافة دورات بالنقر فوق Add'button في المقطع البروتوكول. في جزء القالب، أدخل المعلومات المتعلقة بالعينة، مثل هوية الأجسام المضادة الأساسية والثانوية، وأرقام الكتالوجات الخاصة بها، و عمليات التخفيف. حفظ ملف الفحص الجديد.قبل النقر على زر start'، تحقق من التخطيط بسرعة للتأكد من صحة كل شيء. الآن، انقر فوق start'لبدء التشغيل. البرنامج سوف يطالب المستخدم لإزالة النفايات، لإعادة ملء مربع الماء والشعيرات الدموية، لإضافة anolite والكاثوليت إلى علبة المورد، لإضافة العازلة غسل، وتحميل لوحة في علبة عينة المبردة.سيتم عرض شريط حالة على شاشة الكمبيوتر بضع دقائق بعد بدء تشغيل. انقر على شاشة ملخص التشغيل لرؤية أجزاء الحالة والفصل. لمراقبة فصل الكهرباء في شعرية، تشغيل الفيلم فصل لهذا الشعرية عن طريق النقر على الدورة المطلوبة ومن ثم النقر على زر التشغيل في لوحة التحكم.افتح ملف التشغيل وحدد علامة تبويب شاشة التحليل. انقر فوق edit'ثم analysis'لتغيير نطاق النقاط الأيزوئيكتريك. تطبيق معيار نقطة الأزوية المناسبة.أضف نوبة ذروة، وأضف اسم الذروة. وأخيراً، حدد البيانات التي تريد استخدامها في علامة التبويب "الذروة" ثم قم بتصدير البيانات لمزيد من التحليل. يظهر هنا مخطط كهربي من الكنيات الشعاعية غير الخلوية الخاضعة للتنظيم من عوامل النمو البطانية الوعائية المحفزة.هناك تحريض عالية جدا من البروتينات الفوسفورية لوحظت مع عامل النمو البطانية الوعائية. يظهر inset التحكم في التحميل الذاتية، HSP 70، مما يدل على تحميل مماثل للعينات لكل من العينات غير المعالجة والمعالجة. في النبع المناعي التقليدي ، تم اكتشاف نطاقين فقط ، على الرغم من أن بروتينات كيناز الإشارات غير الخلوية الخاضعة للتنظيم تم حلها إلى أربع قمم عن طريق تحليل التركيز الإيزوتري الشعري.يظهر هنا مخطط كهربائي من kinases التي تنظمها الإشارة خارج الخلية من عامل النمو البطانية الوعائية المحفزة. يظهر inset نفس عنصر التحكم التحميل المستخدمة في نفس الوقت. يظهر النبل المناعي التقليدي شريطين فقط مطابقين لـ كيناز واحد منظم من خارج الخلية ومنظمه إشارة خارج الخلية.في حين أنه مع التركيز على الأيزوتريك الشعري ، تم حل بروتينات كيناز غير الخلوية المنظمة للإشارات إلى ست قمم ، تقابل جميع القمم الأربع المختلفة ذات الفوسفور وقممين غير الفوسفورية. مرة واحدة يتقن، يمكن أن يتم هذا الأسلوب في غضون ساعات قليلة، اعتمادا على عدد الدورات، إذا تم تنفيذها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء، من المهم أن نتذكر لاستخدام تركيزات الأجسام المضادة أعلى بالمقارنة مع مناعة التقليدية.العرض التوضيحي البصري لهذه الطريقة أمر بالغ الأهمية حيث أن خطوات الفحص يصعب تعلمها بسبب الحيل ، مثل إزالة الفقاعات ، تحميل اللوحة ، وما إلى ذلك. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تصميم مقايسة، وإعداد العينات، وتشغيل الفحص، وتحليل البيانات لمراقبة isoforms مختلفة من البروتين الخاص بك.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Highly Sensitive and Rapid Fluorescence Detection with a Portable FRET Analyzer

حساسة للغاية وسريع كشف الإسفار مع محلل الحنق المحمولة

Recent improvements in F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) sensors have enabled their use to detect various small molecules including ions and ...

An Efficient Method for the Isolation of Highly Purified RNA from Seeds for Use in Quantitative Transcriptome Analysis

وسيلة فعالة لعزل الحمض النووي الريبي العالية النقاء من بذور للاستخدام في التحليل الكمي Transcriptome على

Plant seeds accumulate large amounts of storage reserves comprising biodegradable organic matter. Humans rely on seed storage reserves for food and as ...

Capillary Electrophoresis Separation of Monoclonal Antibody Isoforms Using a Neutral Capillary

الشعرية الكهربائي فصل حيدة النسيلة الأجسام المضادة الإسوية باستخدام الشعرية محايد

Biotherapeutic proteins, such as monoclonal antibodies (mAbs), are feasible alternatives for the treatment of chronic-degenerative diseases. The ...

Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

طريقة لتصور وتحليل غشاء متبادلة البروتينات التي نقل المجهر

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

Formation of Covalent DNA Adducts by Enzymatically Activated Carcinogens and Drugs In Vitro and Their Determination by 32P-postlabeling

Formation of Covalent DNA Adducts by Enzymatically Activated Carcinogens and Drugs In Vitro and Their Determination by 32P-postlabeling

تشكيل التساهمية الحمض النووي Adducts بالمواد المسرطنة انزيماتيكالي المنشط والمخدرات في المختبر وتصميمها من 32فبوستلابيلينج

Covalent DNA adducts formed by chemicals or drugs with carcinogenic potency are judged as one of the most important factors in the initiation phase of ...

Detection of Detergent-sensitive Interactions Between Membrane Proteins

كشف المنظفات تراعي التفاعلات بين البروتينات الغشاء

Our ability to explore protein-protein interactions is the key to understanding regulatory connections in the cell. However, detection of protein-protein ...

Quantitative and Qualitative Method for Sphingomyelin by LC-MS Using Two Stable Isotopically Labeled Sphingomyelin Species

الأسلوب الكمي والنوعي سفينجوميلين من LC-MS استخدام اثنين مستقرة نظير المسمى الأنواع سفينجوميلين

We present a method of analyzing sphingomyelin (SM) qualitatively and quantitatively by liquid chromatography-electrospray Ionization-tandem mass ...

Analysis of AtHIRD11 Intrinsic Disorder and Binding Towards Metal Ions by Capillary Gel Electrophoresis and Affinity Capillary Electrophoresis

تحليل AtHIRD11 اضطرابات جوهرية وملزمة تجاه أيونات المعادن بالتفريد جل الشعرية وتقارب التفريد الشعرية

Plants are strongly dependent on their environment. In order to adjust to stressful changes (e.g., drought and high salinity), higher plants evolve ...

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

الكشف عن هيتيروديميريزيشن Isoforms البروتين باستخدام في الموقع قرب ربط التحليل

Regulated protein-protein interactions are a guiding principle for many signaling events, and the detection of such events is an important element in ...

Use of Recombinant Fusion Proteins in a Fluorescent Protease Assay Platform and Their In-gel Renaturation

استخدام البروتينات الانصهار المؤتلف في منصة فحص حوزتي فلورسنت وما ريناتوريشن في جل

Proteases are intensively studied enzymes due to their essential roles in several biological pathways of living organisms and in pathogenesis; therefore, ...