Name: highly sensitive and quantitative detection of proteins and their isoforms by capillary isoelectric focusing method
Uploaded: 2018-09-19T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Highly Sensitive and Quantitative Detection of Proteins and Their Isoforms by Capillary Isoelectric Focusing Method at JoVE.com

Forfatteren tak Prof. Lena Claesson-walisisk, Uppsala Universitet, Sverige for hendes støtte til udvikling af dette projekt. Derudover tak forfatteren Ross Smith og Lena Claesson-walisisk, Uppsala Universitet for deres kritisk læsning og forslag til at forbedre håndskriftet.

1. celle kultur, Stimulation og Lysis
Bemærk: Denne metode kan bruges med mange celletyper. For at illustrere metoden, beskrevet et eksempel på brug af menneskelige umbilical vene endothelial celler (HUVECs).
<ol><li>Kultur HUVECs på gelatine-belagt, 10 cm petriskåle i endothelial celle basal medium med passende tilskud (Se Tabel af materialer), og som også indeholder 5% FCS, epidermal vækstfaktor (5 ng/mL), vaskulær endotel vækstfaktor (VEGF: 0,5 ng/mL), grundlægge...

<ol>
	<li>O'Neill, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isoelectric+focusing+technology+quantifies+protein+signaling+in+25+cells.">Isoelectric focusing technology quantifies protein signaling in 25 cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (44), 16153-16158 (2006).</li><li>Aspinall-O'Dea, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody-based+detection+of+protein+phosphorylation+status+to+track+the+efficacy+of+novel+therapies+using+nanogram+protein+quantities+from+stem+cells+and+cell+lines.">Antibody-based detection of protein phosphorylation status to track the efficacy of novel therapies using nanogram protein quantities from stem cells and cell lines.</a> Nat Protoc. 10 (1), 149-168 (2015).</li><li>Fan, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanofluidic+proteomic+assay+for+serial+analysis+of+oncoprotein+activation+in+clinical+specimens.">Nanofluidic proteomic assay for serial analysis of oncoprotein activation in clinical specimens.</a> Nat Med. 15 (5), 566-571 (2009).</li><li>Padhan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+sensitivity+isoelectric+focusing+to+establish+a+signaling+biomarker+for+the+diagnosis+of+human+colorectal+cancer.">High sensitivity isoelectric focusing to establish a signaling biomarker for the diagnosis of human colorectal cancer.</a> BMC Cancer. 16 (1), 683 (2016).</li><li>Sun, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGFR2+induces+c-Src+signaling+and+vascular+permeability+in+vivo+via+the+adaptor+protein+TSAd.">VEGFR2 induces c-Src signaling and vascular permeability in vivo via the adaptor protein TSAd.</a> J Exp Med. 209 (7), 1363-1377 (2012).</li><li>Iacovides, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+quantification+of+AKT+isoforms+and+phosphoforms+in+breast+cancer+using+a+novel+nanofluidic+immunoassay.">Identification and quantification of AKT isoforms and phosphoforms in breast cancer using a novel nanofluidic immunoassay.</a> Mol Cell Proteomics. 12 (11), 3210-3220 (2013).</li><li>Price, F. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+JAK-STAT+signaling+stimulates+adult+satellite+cell+function.">Inhibition of JAK-STAT signaling stimulates adult satellite cell function.</a> Nat Med. 20 (10), 1174-1181 (2014).</li><li>Unger, F. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoproteomic+analysis+of+ischemia-dependent+changes+in+signaling+protein+phosphorylation+in+colorectal+normal+and+cancer+tissue.">Nanoproteomic analysis of ischemia-dependent changes in signaling protein phosphorylation in colorectal normal and cancer tissue.</a> J Transl Med. 14, 6 (2016).</li><li>Urasaki, Y., Pizzorno, G., Le, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+uridine+administration+induces+fatty+liver+and+pre-diabetic+conditions+in+mice.">Chronic uridine administration induces fatty liver and pre-diabetic conditions in mice.</a> PLoS One. 11 (1), e0146994 (2016).</li><li>Schmidt, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Case-specific+potentiation+of+glioblastoma+drugs+by+pterostilbene.">Case-specific potentiation of glioblastoma drugs by pterostilbene.</a> Oncotarget. 7 (45), 73200-73215 (2016).</li></ol>

Følsomhed og opløsning af proteiner er afgørende for proteom forskning på biologiske prøver. Der er stor værdi i at være i stand til at opdage proteiner, som findes i små mængder i celler. cIEF kan tilbyde bedre følsomhed og opløsning til påvisning af proteiner og deres isoformer4.
Denne teknologi har held været anvendt i mange proteom forskning rapporter5,6,7. Sta...

Kapillar isoelektrisk fokusering (cIEF) er en automatiseret, kapillær-baseret immunassay, der løser proteiner på grundlag af deres afgift1,2,3. Det er meget reproducerbare og i stand til at løse proteiner og deres post-translationally modificerede isoformer hurtigt og kvantitativt. Det præsenterer en alternativ til konventionelle metoder såsom western blotting. Mens western blotting er meget godt for at bekræfte tilstedeværelsen af rigelige proteiner i lettilgængelig prøver; variation, tidsforbrug og nøjagtig kvantificering alle nuværende udfordringer, især ved behandlingen af biologiske vævsprøver. Faktisk variation er en iboende problem i western blotting, da der er mange trin involveret, såsom lastning og drift af SDS-PAGE geler, overførsel af proteiner på membranen, inkubation med forskellige reagenser (fx., primære og sekundære antistoffer, ECL), og udvikling op på X-ray film4. I øjeblikket er at forbedre den western blotting teknik med gennemførelsen af digital optagelse af kemiluminescerende signaler (digital westerns). For nylig, en automatiseret western blotting system er blevet udviklet, nemlig den kapillar vestlige, som er en mere hænder-omkostningsfrit og gel-fri system. Hele analysen er automatiseret efter indlæsning af en prøve plade (prøver med alle nødvendige reagenser) ind i systemet3,4. Instrumentet vil udføre alle trinene såsom protein adskillelse, immobilisering af proteiner på kapillar væggen, antistof inkubationer, vasker mellem forskellige trin, og udvikling og kvantificering af kemiluminescens-signaler. Således giver cIEF proceduren præsenteres her højere opløsning og følsomhed.
Denne metode er følsomme, som signaler kan genereres og kvantificeres fra picogram proteiner1. Den høje følsomhed med fremragende reproducerbarhed gør denne teknologi meget nyttigt til analyse af kliniske prøver. Det kan detektere samt skelne post translationel ændring (f.eks. forskellige fosforyleres protein isoformer) af proteiner. Denne teknologi held har været anvendt til at dissekere forskellige signaling veje4,5 i kliniske undersøgelser med henblik på at udvikle nye therapeutics i kræft3, og det har stort potentiale for protein biomarkør og drug discovery .

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="920">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:367px;">NanoPro 1000</td>
			<td style="width:107px;">ProteinSimple</td>
			<td style="width:301px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Premix G2, pH 5&#8211;8 (nested) separation gradient, pH 2&#8211;4 plug</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-972</td>
			<td>Ampholyte premix</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DMSO inhibitor mix</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-510</td>
			<td>Phosphatase inhibitors; for cIEF 1:50 dilution used</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Aqueous Inhibitor Mix</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-482</td>
			<td>Protease inhibitor; for cIEF 1:25 dilution used</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">pI standard ladder 3</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-646</td>
			<td>For cIEF 1:60 dilution used</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sample diluent</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-649</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Antibody diluent&#160;</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Wash concentrate</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>041-108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Anolyte Refill</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Catholyte Refill</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-338</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Peroxide XDR</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>041-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Luminol</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Bicine/CHAPS Lysis Buffer</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Capillaries-Charge Separation (1 pack) for&#160;</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>CBS700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Assay Plate/Lid Kit</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Peroxidase-AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)&#160;</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch&#160;</td>
			<td>711-035-152</td>
			<td>For cIEF used (1: 300)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Peroxidase-AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)&#160;</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch&#160;</td>
			<td>715-035-150</td>
			<td>For cIEF used (1: 300)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Phospho-Erk 1/2 Primary Antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9101</td>
			<td>For cIEF used (1: 50)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Pan Erk Primary Antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9102</td>
			<td>For cIEF used (1: 100)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Compass software</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">HUVEC</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>PCS-100-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MV2 (EBM-2)</td>
			<td>PromoCell</td>
			<td>&#160;C-22221</td>
			<td>Endothelia cell basal medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Endothelial Cell Growth Medium MV2 SupplementPack</td>
			<td>PromoCell</td>
			<td>C-39221</td>
			<td>Supplementation to MV2 above</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">VEGFA</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Long R3 IGF</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>85580C/I1146</td>
			<td>Insulin-like growth factor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bioruptor (Sonicator)</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>B01020001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BCA Protein Assay kit&#160;</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>NP0322BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NuPAG MOPS SDS Running Buffer (20X)</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>NP0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NuPAGE Transfer Buffer (20X)</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>NP0006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Immobilon PVDF membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microfuge tube vortexer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Microtiter plate adapter for centrifuge</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Pipettors&#160;</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Tips</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Ice</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

highly sensitive and quantitative detection of proteins and their isoforms by capillary isoelectric focusing method

Immunoblotting er blevet en rutinemæssig teknik i mange laboratorier til protein karakterisering af biologiske prøver. Følgende protokol giver en alternativ strategi, kapillær isoelektrisk fokusering (cIEF), med mange fordele i forhold til konventionelle immunoblotting. Dette er en antistof-baseret, automatiseret, hurtig og kvantitativ metode, hvor en komplet western blotting procedure finder sted inde i en ultratynde kapillær. Denne teknik kræver en gel til at overføre til en membran, stripning af klatter, eller x-ray film, der er typisk kræves til konventionelle immunoblotting. Her, proteiner er adskilt i henhold til deres charge (isoelektriske punkt, pI), bruger mindre end en microliter (400 nL) af total protein lysate. Efter elektroforese, proteiner er immobiliseret på de kapillar vægge af ultraviolet lys behandling, efterfulgt af primære og sekundære (peberrodsperoxidase (HRP) konjugeret) antistof inkubation, hvis bindende opdages gennem forbedret kemiluminescens (ECL), generere et lyssignal, som kan være fanget og optaget af et kamera, charge - sammen enhed (CCD). Det digitale billede kan analyseres og kvantificeret (toparealet) ved hjælp af software. Denne høje overførselshastighed procedure kan håndtere 96 prøver ad gangen; er meget følsomme, med protein påvisning i pikogram-området; og producerer meget reproducerbare resultater på grund af automatisering. Alle disse aspekter er meget værdifulde, når antallet af prøver (f.eks., vævsprøver og biopsier) er en begrænsende faktor. Teknikken har bredere applikationer samt, herunder screening af narkotika eller antistoffer, biomarkør opdagelse og diagnosticering.

Design af en ny analyse: En assay plade layout er vist i figur 1A. Maksimalt, kan 96 brønde bruges fra 384-godt plade i blokke af 12 brønde for hver betingelse (antistof). Hver blok af 12 brønde kan starte enten fra A1-A12 eller A13-A24. Farvekodede rækker tillader en at skelne prøver eller reagenser fra hinanden. I analysen skabelon (figur 1B), relevante oplysninger for at kan pågældende analysen lagres, ...

Watch this Scientific Journal Video about Highly Sensitive and Quantitative Detection of Proteins and Their Isoforms by Capillary Isoelectric Focusing Method at JoVE.com

Highly Sensitive and Quantitative Detection of Proteins and Their Isoforms by Capillary Isoelectric Focusing Method

Kapillar isoelektrisk fokusering er en antistof-baseret, ultrasensitive, høje overførselshastighed teknik, muliggør detaljeret karakterisering af proteiner og deres isoformer fra ekstremt lille biologiske prøver. I det følgende beskrives en protokol til påvisning og kvantificering af specifikke proteiner og deres isoformer i en automatiseret og robotiserede måde.

Meget følsom og kvantitativ påvisning af proteiner og deres isoformer af kapillar isoelektrisk fokusering metode

Immunoblotting has become a routine technique in many laboratories for protein characterization from biological samples. The following protocol provides ...

Denne metode kan hjælpe med at besvare centrale spørgsmål inden for biomedicinsk forskning område, såsom biomarkør opdagelse, lægemiddel opdagelse, diagnostik, og screening af lægemidler eller antistoffer. Den største fordel ved denne teknik er, at det er høj-throughput og kan detektere protein isoformer i en meget reproducerbar måde. Konsekvenserne af denne teknik strækker sig mod diagnosticering af mange sygdomme, fordi det kan måle berørte proteiner eller deres isoformer.Selvom denne metode kan give indsigt i celle-signalering veje, det kan også anvendes til andre systemer, hvor specifikke proteiner skal analyseres. Visuel demonstration af denne metode er kritisk, da analysen skridt er vanskelige at lære på grund af de tricks, såsom at fjerne bobler, lastning pladen, osv. Først forberedes en prøvefortyndingsblanding ved at tilføje en mikroliter DMSO-inhibitorblanding og to mikroliter proteasehæmmere til 47 mikroliter af prøvefortyndingsblandingen, således at den endelige koncentration af DMSO og proteasehæmmere er et X.Dilute tidligere isolerede proteinlysater ved hjælp af prøvefortyndtblandingen for at opnå de ønskede koncentrationer.Dernæst tilsættes 3.325 mikroliter af standard stige, seks mikroliter af proteasehæmmer, og tre mikroliter af DMSO-hæmmer til 137.675 mikroliter af antholite premix. Vortex prøven mindst 15 sekunder og holde på is. De to forberedte opløsninger blandes i et 1-3 forhold, således at de endelige koncentrationer af DMSO-proteasehæmmere og den isoelektriske punktstandardstigen er ét X, og proteinerne i kapillæren når de endelige ønskede koncentrationer.Når proteinerne er tilsat prøveblandingen, vil alle trin blive udført på is eller ved fire grader Celsius. Placer en 384-brønd plade på is. Læg ti mikroliter af prøven mix i den relevante brønd af pladen, i henhold til analysen skabelon layout designet med den automatiserede Vestlige blotting system software.Derefter fortyndes de primære og sekundære antistoffer med antistoffortyndingstynding. Derefter pipette ti mikroliter af primære antistoffer og 15 mikroliter af sekundære antistoffer i hver brønd. Dernæst blandes luminol og peroxid XDR i et forhold på en til et.Pipette 15 mikroliter af luminolperoxid blandes i hver brønd. Når prøverne og reagants er blevet tilføjet til pladen, centrifuge i ti minutter ved 2500 gange G og fire grader Celsius at dreje ned væsken og fjerne boblerne. Hvis der stadig findes bobler, skal du fjerne dem manuelt ved hjælp af en tynd pipettespids.Åbn den automatiserede Western blotting systemsoftware og klik på new'from the file menu. Gå til layoutruden og tildel placeringer for reagants og prøver i 384-brøndpladen. Lav en reagant opgave ved at klikke på en brønd overalt i blokken.Vælg en række blok af 12 brønde hver. Gå derefter til layoutrudens værktøjslinje, og indsæt en eksempel-, primær-, sekundær- eller luminolrækkeblok. Gå til protokolruden, og vælg en placering i pladen.Klik derefter på cellen i eksempelkolonnen, og vælg reagant i rullemenuen. På samme måde skal du vælge de reagant steder for den primære, sekundære, og luminol for hver cyklus. Klik på cellerne ét ad gangen i den primære eller sekundære antistofkolonne, og skift inkubationstiderne, hvis det er nødvendigt.Tilføj derefter cyklusser ved at klikke på knappen Add'i protokolsektionen. I skabelonruden skal du angive oplysninger vedrørende prøven, f.eks. Gem den nye analysefil.Før du klikker på startknappen, skal du hurtigt kontrollere layoutet for at sikre, at alt er korrekt. Klik nu på start for at starte løbet. Softwaren vil bede brugeren om at fjerne affaldet, at genopfylde vand og kapillær boks, at tilføje anolit og katolit til ressourcebakken, at tilføje vask buffer, og at indlæse pladen i den afkølede prøvebakke.Der vises en instrumentstatuslinje på computerskærmen et par minutter efter, at kørslen er startet. Klik på løbeoversigten'skærmen for at se status- og separationsruderne. For at observere elektroforese adskillelse i en kapillær, spille adskillelse film for at kapillær ved at klikke på den ønskede cyklus og derefter klikke på play-knappen i kontrolpanelet.Åbn kørselsfilen, og vælg fanen Analyseskærm. Klik på edit'and then analysis'for at ændre det isoelektriske punktområde. Anvende den relevante isoelektriske punkt standard.Tilføj en spidsbelastning, og tilføj et topnavn. Endelig skal du vælge de data, der skal bruges under fanen toppe, og eksportere dataene til yderligere analyse. Det elektrofærogram af fosforylerede ekstracellulære signalregulerede kinaser fra vaskulære endotelvækstfaktor stimulerede lysater vises her.Der er meget høj induktion af fosforylerede proteiner observeret med vaskulær endotelvækstfaktor. Indsatten viser den endogene belastningskontrol, HSP 70, der angiver en lignende belastning af prøverne for både ubehandlede og behandlede prøver. I et konventionelt immunoblot blev der kun fundet to bånd, selv om de fosforholdige ekstracellulære signalregulerede kinaseproteiner blev løst i fire toppe ved kapillær isoelektrisk fokusanalyse.Det elektropherogram af ekstracellulære signalregulerede kinaser fra vaskulære endotelvækstfaktor stimulerede lysater vises her. Indsat viser den samme belastningskontrol, der anvendes parallelt. En konventionel immunoblot viser kun to bånd svarende til ekstracellulære signalreguleret kinase en og ekstracellulære signalregulerede kinase to.Mens kapillær isoelektrisk fokusering, de ekstracellulære signalregulerede kinaseproteiner blev løst i seks toppe, svarende til alle fire forskellige fosforylerede toppe og to ikke-fosforylerede toppe. Når mestrer, denne teknik kan gøres i et par timer, afhængigt af antallet af cykler, hvis det udføres korrekt. Mens du forsøger denne procedure, Er det vigtigt at huske at bruge højere antistof koncentrationer i forhold til konventionelle immunoblots.Visuel demonstration af denne metode er kritisk, da analysen skridt er vanskelige at lære på grund af tricks, såsom at fjerne bobler, lastning pladen, osv. Efter at have set denne video, bør du have en god forståelse af, hvordan man designer en analyse, forberede prøver, køre analysen, og analysere data til at observere forskellige isoformer af dit protein.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Highly Sensitive and Rapid Fluorescence Detection with a Portable FRET Analyzer

Meget følsomme og Rapid Fluorescens Detection med en bærbar FRET Analyzer

Recent improvements in F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) sensors have enabled their use to detect various small molecules including ions and ...

An Efficient Method for the Isolation of Highly Purified RNA from Seeds for Use in Quantitative Transcriptome Analysis

En effektiv metode til isolering af stærkt Renset RNA fra Frø til brug i Kvantitative Transkriptomet Analysis

Plant seeds accumulate large amounts of storage reserves comprising biodegradable organic matter. Humans rely on seed storage reserves for food and as ...

Capillary Electrophoresis Separation of Monoclonal Antibody Isoforms Using a Neutral Capillary

Kapillær elektroforese Adskillelse af monoklonalt antistof Isoformer med en neutral kapillær

Biotherapeutic proteins, such as monoclonal antibodies (mAbs), are feasible alternatives for the treatment of chronic-degenerative diseases. The ...

Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

Metode til at visualisere og analysere membran interagerende proteiner af Transmission Electron Microscopy

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

Formation of Covalent DNA Adducts by Enzymatically Activated Carcinogens and Drugs In Vitro and Their Determination by 32P-postlabeling

Formation of Covalent DNA Adducts by Enzymatically Activated Carcinogens and Drugs In Vitro and Their Determination by 32P-postlabeling

Dannelsen af kovalent DNA adukter af enzymatisk aktiveret kræftfremkaldende stoffer og narkotika In Vitro og deres bestemmelse af 32P-postlabeling

Covalent DNA adducts formed by chemicals or drugs with carcinogenic potency are judged as one of the most important factors in the initiation phase of ...

Detection of Detergent-sensitive Interactions Between Membrane Proteins

Påvisning af vaskemiddel-følsomme interaktioner mellem Membranproteiner

Our ability to explore protein-protein interactions is the key to understanding regulatory connections in the cell. However, detection of protein-protein ...

Quantitative and Qualitative Method for Sphingomyelin by LC-MS Using Two Stable Isotopically Labeled Sphingomyelin Species

Kvantitative og kvalitative metode for Sphingomyelin af LC-MS bruger to stabile brændselsfremstilling mærket Sphingomyelin arter

We present a method of analyzing sphingomyelin (SM) qualitatively and quantitatively by liquid chromatography-electrospray Ionization-tandem mass ...

Analysis of AtHIRD11 Intrinsic Disorder and Binding Towards Metal Ions by Capillary Gel Electrophoresis and Affinity Capillary Electrophoresis

Analyse af AtHIRD11 iboende lidelse og bindende mod metalioner af kapillar gelelektroforese og affinitet kapillær elektroforese

Plants are strongly dependent on their environment. In order to adjust to stressful changes (e.g., drought and high salinity), higher plants evolve ...

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Påvisning af Heterodimerization af Protein isoformer ved hjælp af en in Situ nærhed ligatur Assay

Regulated protein-protein interactions are a guiding principle for many signaling events, and the detection of such events is an important element in ...

Use of Recombinant Fusion Proteins in a Fluorescent Protease Assay Platform and Their In-gel Renaturation

Brug af rekombinant Fusion proteiner i et fluorescerende Protease Assay Platform og deres i-gel genopretning

Proteases are intensively studied enzymes due to their essential roles in several biological pathways of living organisms and in pathogenesis; therefore, ...