Name: highly sensitive and quantitative detection of proteins and their isoforms by capillary isoelectric focusing method
Uploaded: 2018-09-19T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Highly Sensitive and Quantitative Detection of Proteins and Their Isoforms by Capillary Isoelectric Focusing Method at JoVE.com

De auteur dankt Prof. Lena Claesson-Welsh, de Universiteit van Uppsala, Zweden voor haar steun voor de ontwikkeling van dit project. Bovendien, dankzij de auteur Ross Smith en Lena Claesson-Welsh, de Universiteit van Uppsala voor hun kritische lezing en suggesties ter verbetering van het manuscript.

1. cultuur, stimulatie en Lysis van de cel
Opmerking: Deze methode kan worden gebruikt met vele celtypes. Ter illustratie van de methode, wordt een voorbeeld van het gebruik van menselijke navelstreng ader endotheliale cellen (HUVECs) beschreven.
<ol><li>HUVECs op 10 cm petrischalen gelatine-bekleed, in de basale medium endothelial cel met passende suppletie cultuur (Zie Tabel of Materials), en ook met 5% FCS, epidermale groeifactor (5 ng/mL), vasculaire endotheliale groeifa...

<ol>
	<li>O'Neill, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isoelectric+focusing+technology+quantifies+protein+signaling+in+25+cells.">Isoelectric focusing technology quantifies protein signaling in 25 cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (44), 16153-16158 (2006).</li><li>Aspinall-O'Dea, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody-based+detection+of+protein+phosphorylation+status+to+track+the+efficacy+of+novel+therapies+using+nanogram+protein+quantities+from+stem+cells+and+cell+lines.">Antibody-based detection of protein phosphorylation status to track the efficacy of novel therapies using nanogram protein quantities from stem cells and cell lines.</a> Nat Protoc. 10 (1), 149-168 (2015).</li><li>Fan, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanofluidic+proteomic+assay+for+serial+analysis+of+oncoprotein+activation+in+clinical+specimens.">Nanofluidic proteomic assay for serial analysis of oncoprotein activation in clinical specimens.</a> Nat Med. 15 (5), 566-571 (2009).</li><li>Padhan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+sensitivity+isoelectric+focusing+to+establish+a+signaling+biomarker+for+the+diagnosis+of+human+colorectal+cancer.">High sensitivity isoelectric focusing to establish a signaling biomarker for the diagnosis of human colorectal cancer.</a> BMC Cancer. 16 (1), 683 (2016).</li><li>Sun, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGFR2+induces+c-Src+signaling+and+vascular+permeability+in+vivo+via+the+adaptor+protein+TSAd.">VEGFR2 induces c-Src signaling and vascular permeability in vivo via the adaptor protein TSAd.</a> J Exp Med. 209 (7), 1363-1377 (2012).</li><li>Iacovides, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+quantification+of+AKT+isoforms+and+phosphoforms+in+breast+cancer+using+a+novel+nanofluidic+immunoassay.">Identification and quantification of AKT isoforms and phosphoforms in breast cancer using a novel nanofluidic immunoassay.</a> Mol Cell Proteomics. 12 (11), 3210-3220 (2013).</li><li>Price, F. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+JAK-STAT+signaling+stimulates+adult+satellite+cell+function.">Inhibition of JAK-STAT signaling stimulates adult satellite cell function.</a> Nat Med. 20 (10), 1174-1181 (2014).</li><li>Unger, F. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoproteomic+analysis+of+ischemia-dependent+changes+in+signaling+protein+phosphorylation+in+colorectal+normal+and+cancer+tissue.">Nanoproteomic analysis of ischemia-dependent changes in signaling protein phosphorylation in colorectal normal and cancer tissue.</a> J Transl Med. 14, 6 (2016).</li><li>Urasaki, Y., Pizzorno, G., Le, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+uridine+administration+induces+fatty+liver+and+pre-diabetic+conditions+in+mice.">Chronic uridine administration induces fatty liver and pre-diabetic conditions in mice.</a> PLoS One. 11 (1), e0146994 (2016).</li><li>Schmidt, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Case-specific+potentiation+of+glioblastoma+drugs+by+pterostilbene.">Case-specific potentiation of glioblastoma drugs by pterostilbene.</a> Oncotarget. 7 (45), 73200-73215 (2016).</li></ol>

Gevoeligheid en resolutie van eiwitten zijn cruciaal voor proteoom onderzoek naar biologische monsters. Er is grote waarde zijnde kundig voor detecteren van eiwitten die in minieme hoeveelheden in cellen aanwezig zijn. cIEF bieden verbeterde gevoeligheid en resolutie voor de detectie van eiwitten en hun isoforms4.
Deze technologie is met succes gebruikt in vele Proteoom Onderzoek rapporten5,6,<sup cla...

Capillaire elektrisch scherpstelling (cIEF) is een geautomatiseerde, capillair gebaseerde immunoassay dat eiwitten op basis van hun lading1,2,3 verhelpt. Het is zeer reproduceerbaar en staat te oplossen van eiwitten en hun post-translationally gemodificeerde isoforms snel en kwantitatief. Het presenteert een alternatief voor conventionele methoden zoals het westelijke bevlekken. Terwijl het westelijke bevlekken is heel goed voor de bevestiging van de aanwezigheid van overvloedig eiwitten in gemakkelijk toegankelijke monsters; variabiliteit, tijd consumptie en nauwkeurige kwantificatie allemaal aanwezig uitdagingen, met name bij de behandeling van biologisch weefselmonsters. Inderdaad, variabiliteit is een inherent probleem in het westelijke bevlekken, want er zijn talrijke stappen betrokken, zoals laden en uitvoeren van SDS-pagina gelen, overdracht van eiwitten op membraan, incubatie met verschillende reagentia (bv. primaire en secundaire antistoffen, ECL), en de ontwikkeling op een X-ray film4. Op dit moment is de westelijke bevlekkende techniek verbeteren met de implementatie van digitale opname van chemiluminescentie signalen (digitale westerns). Onlangs, een geautomatiseerd westelijke bevlekkende systeem heeft ontwikkeld, namelijk het capillair westerse, dat is een meer handsfree en gel-vrij systeem. De gehele test is geautomatiseerd na het laden van een monster plaat (monsters met alle nodige reagentia) in het systeem3,4. Het instrument zal het uitvoeren van alle stappen zoals eiwit scheiding, immobilisatie van eiwitten op capillaire wand, antilichaam incubations, wast tussen verschillende stappen, en de ontwikkeling en de kwantificering van de chemiluminescentie signalen. De procedure van de cIEF hier gepresenteerd biedt dus een hogere resolutie en gevoeligheid.
Deze methode is gevoelig, zoals signalen kunnen worden gegenereerd en gekwantificeerd van picogram van eiwitten1. De hoge gevoeligheid met uitstekende reproduceerbaarheid maakt deze technologie zeer nuttig zijn voor de analyse van klinische monsters. Het kan detecteren evenals onderscheiden post translationeel wijziging (bijvoorbeeld verschillende gefosforyleerd eiwit isoforms) van eiwitten. Deze technologie is met succes gebruikt om te ontleden van verschillende signalering trajecten4,5 in klinische studies gericht op de ontwikkeling van nieuwe therapieën in kanker3, en het heeft een groot potentieel voor eiwit biomerker en drug discovery .

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="920">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:367px;">NanoPro 1000</td>
			<td style="width:107px;">ProteinSimple</td>
			<td style="width:301px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Premix G2, pH 5&#8211;8 (nested) separation gradient, pH 2&#8211;4 plug</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-972</td>
			<td>Ampholyte premix</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DMSO inhibitor mix</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-510</td>
			<td>Phosphatase inhibitors; for cIEF 1:50 dilution used</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Aqueous Inhibitor Mix</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-482</td>
			<td>Protease inhibitor; for cIEF 1:25 dilution used</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">pI standard ladder 3</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-646</td>
			<td>For cIEF 1:60 dilution used</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sample diluent</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-649</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Antibody diluent&#160;</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Wash concentrate</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>041-108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Anolyte Refill</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Catholyte Refill</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-338</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Peroxide XDR</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>041-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Luminol</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Bicine/CHAPS Lysis Buffer</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Capillaries-Charge Separation (1 pack) for&#160;</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>CBS700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Assay Plate/Lid Kit</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Peroxidase-AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)&#160;</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch&#160;</td>
			<td>711-035-152</td>
			<td>For cIEF used (1: 300)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Peroxidase-AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)&#160;</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch&#160;</td>
			<td>715-035-150</td>
			<td>For cIEF used (1: 300)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Phospho-Erk 1/2 Primary Antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9101</td>
			<td>For cIEF used (1: 50)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Pan Erk Primary Antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9102</td>
			<td>For cIEF used (1: 100)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Compass software</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">HUVEC</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>PCS-100-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MV2 (EBM-2)</td>
			<td>PromoCell</td>
			<td>&#160;C-22221</td>
			<td>Endothelia cell basal medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Endothelial Cell Growth Medium MV2 SupplementPack</td>
			<td>PromoCell</td>
			<td>C-39221</td>
			<td>Supplementation to MV2 above</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">VEGFA</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Long R3 IGF</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>85580C/I1146</td>
			<td>Insulin-like growth factor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bioruptor (Sonicator)</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>B01020001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BCA Protein Assay kit&#160;</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>NP0322BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NuPAG MOPS SDS Running Buffer (20X)</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>NP0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NuPAGE Transfer Buffer (20X)</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>NP0006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Immobilon PVDF membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microfuge tube vortexer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Microtiter plate adapter for centrifuge</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Pipettors&#160;</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Tips</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Ice</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

highly sensitive and quantitative detection of proteins and their isoforms by capillary isoelectric focusing method

Immunoblotting is uitgegroeid tot een routine techniek in veel laboratoria voor eiwit karakterisering van biologische monsters. Het volgende protocol biedt een alternatieve strategie, capillaire elektrisch scherpstellen (cIEF), met vele voordelen ten opzichte van conventionele immunoblotting. Dit is een methode van het antilichaam gebaseerde, geautomatiseerde, snelle en kwantitatieve waarin een volledige westelijke bevlekkende procedure binnen een uiterst dunne capillair plaatsvindt. Deze techniek niet vereisen een gel overbrengen naar een membraan, strippen van vlekken, of x-ray films, die doorgaans vereist voor conventionele immunoblotting zijn. Hier, de eiwitten worden gescheiden volgens hun lading (elektrisch punt, pI), met behulp van minder dan een microliter (400 nL) totaal eiwit lysate. Na elektroforese, eiwitten zijn geïmmobiliseerd op de capillaire wanden door ultraviolet licht behandeling, gevolgd door de primaire en secundaire (horseradish peroxidase (HRP) geconjugeerd) antilichaam-incubatie, waarvan de afhankelijkheid wordt gedetecteerd door middel van verbeterde Chemoluminescentie (ECL), het genereren van een licht signaal dat kan worden gevangen en opgenomen door een camera van de charge - coupled apparaat (CCD). Het digitale beeld kan worden geanalyseerd en gekwantificeerd (piekoppervlakte) met behulp van software. Deze hoge doorvoer procedure aankan 96 monsters tegelijk; is hoogst-gevoelig, met de detectie van de eiwitten in het picogram bereik; en produceert zeer reproduceerbare resultaten vanwege automatisering. Al deze aspecten zijn uiterst waardevol wanneer de hoeveelheid van monsters (b.v., weefselsteekproeven en biopten) een beperkende factor is. De techniek heeft bredere toepassingen, met inbegrip van screening van drugs of antilichamen, ontdekking van biomarker en diagnostische doeleinden.

Ontwerp van een nieuwe test: Een plaat van assay lay-out wordt weergegeven in figuur 1A. 96-wells, kunnen maximaal, voor elke voorwaarde (antilichamen) van de plaat 384-well in blokken van 12 putjes te worden gebruikt. Elk blok met 12 putjes kunt starten vanuit A1-A12 of A13-A24. Kleurcode rijen kunnen men onderscheiden van monsters of reagentia van elkaar. De assay sjabloon (figuur 1B), relevante informatie voor...

Watch this Scientific Journal Video about Highly Sensitive and Quantitative Detection of Proteins and Their Isoforms by Capillary Isoelectric Focusing Method at JoVE.com

Highly Sensitive and Quantitative Detection of Proteins and Their Isoforms by Capillary Isoelectric Focusing Method

Capillaire elektrisch gericht is een antilichaam gebaseerde, ultrasensitive, hoge doorvoer techniek, waardoor gedetailleerde karakterisering van eiwitten en hun isoforms van extreem kleine biologische monsters. Het volgende beschrijft een protocol voor de detectie en kwantificering van specifieke proteïnen en hun isoforms in een geautomatiseerd en gerobotiseerd wijze.

Zeer gevoelige en kwantitatieve detectie van eiwitten en hun Isoforms door capillaire elektrisch gericht methode

Immunoblotting has become a routine technique in many laboratories for protein characterization from biological samples. The following protocol provides ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het biomedisch onderzoeksveld, zoals biomarker ontdekking, drug ontdekking, diagnostiek, en screening van drugs of antilichamen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een hoge doorvoer is en eiwitanalyses op een zeer reproduceerbare manier kan detecteren. De implicaties van deze techniek breiden zich uit tot de diagnose van vele ziekten, omdat het getroffen eiwitten of hun isovormen kan meten.Hoewel deze methode inzicht kan geven in celsignaleringstrajecten, kan deze ook worden toegepast op andere systemen waar specifieke eiwitten moeten worden geanalyseerd. Visuele demonstratie van deze methode is van cruciaal belang als de test stappen zijn moeilijk te leren vanwege de trucs, zoals het verwijderen van bubbels, het laden van de plaat, et cetera. Bereid eerst een monsterverdunningsmix voor door één microliter DMSO-remmermix en twee microliter proteaseremmers toe te voegen aan 47 microliter monsterverdunningsmiddel, zodat de uiteindelijke concentratie dmso en proteaseremmers één X.Verdun eerder geïsoleerde eiwitlysaten met behulp van het monsterverdnningsmiddelmengsel om de gewenste concentraties te verkrijgen.Voeg vervolgens 3.325 microliter standaardladder, zes microliter proteaseremmer en drie microliter DMSO-remmer toe aan 137.675 microliter antholietpremix. Vortex het monster ten minste 15 seconden en blijf op ijs. Meng de twee bereide oplossingen in een verhouding van één tot drie, zodat de uiteindelijke concentraties DMSO proteaseremmers en de isoelectrische puntstandaardladder één X zijn en de eiwitten in de capillaire de uiteindelijke gewenste concentraties bereiken.Nadat de eiwitten aan het monstermengsel zijn toegevoegd, worden alle stappen uitgevoerd op ijs of op vier graden Celsius. Zet een plaat met 384 put op ijs. Laad tien microliter van de monstermix in de juiste put van de plaat, volgens de testsjabloonlay-out die is ontworpen met de geautomatiseerde westerse blotting-systeemsoftware.Verdun hierna de primaire en secundaire antilichamen met antilichaamverdunningsstoffen. Vervolgens pipette tien microliters van primaire antilichamen en 15 microliter van secundaire antilichamen in elke put. Meng vervolgens luminol en peroxide XDR in een één-op-één verhouding.Pipette 15 microliters van de luminolperoxide mengen in elke put. Zodra de monsters en reagants zijn toegevoegd aan de plaat, centrifuge gedurende tien minuten op 2500 keer G en vier graden Celsius om spin vaststelling van de vloeistof en verwijder de bellen. Als er nog steeds bellen bestaan, verwijder ze dan handmatig met behulp van een dunne pipetpunt.Open de geautomatiseerde western blotting systeem software en klik op new'from the file menu. Ga naar het lay-outvenster en wijs locaties toe voor reagants en monsters in de 384-put plaat. Maak een reagant opdracht door te klikken op een put overal in het blok.Selecteer een rijblok van elk 12 putten. Ga vervolgens naar de gereedschapsbalk van het indelingsvenster en voeg een voorbeeld, primair, secundair of luminolrijblok in. Ga naar het protocolvenster en selecteer een reagant locatie in de plaat.Klik vervolgens op de cel in de voorbeeldkolom en selecteer de reagant in het vervolgkeuzemenu. Selecteer op dezelfde manier de reagant-locaties voor de primaire, secundaire en luminol voor elke cyclus. Klik één voor één op de cellen in de primaire of secundaire antilichaamkolom en wijzig indien nodig de incubatietijden.Voeg vervolgens cycli toe door op de knop Toevoegen in de sectie protocol te klikken. Voer in het sjabloonvenster informatie in met betrekking tot het monster, zoals de identiteit van de primaire en secundaire antilichamen, hun catalogusnummers en verdunningen. Sla het nieuwe testbestand op.Voordat u op de startknop klikt, controleert u snel de lay-out om te controleren of alles correct is. Klik nu op start om de run te beginnen. De software zal de gebruiker vragen om het afval te verwijderen, om het water en capillaire doos bij te vullen, om anolite en catholiet toe te voegen aan de resource tray, om wasbuffer toe te voegen, en om de plaat te laden in de gekoelde monster lade.Een instrument statusbalk wordt weergegeven op het computerscherm een paar minuten nadat de run is gestart. Klik op het scherm overzicht uitvoeren om de status- en scheidingsvensters te bekijken. Als u de elektroforesescheiding in een capillaire wilt observeren, speelt u de scheidingsfilm voor die capillaire film af door op de gewenste cyclus te klikken en vervolgens op de afspeelknop in het bedieningspaneel te klikken.Open het run-bestand en selecteer het tabblad Analysescherm. Klik op bewerken'en vervolgens op analyse'om het iso-elektrische puntbereik te wijzigen. Breng de juiste iso-elektrische puntstandaard aan.Voeg een piekpasvorm toe en voeg een pieknaam toe. Selecteer ten slotte de gegevens die u wilt gebruiken op het tabblad Pieken en exporteer de gegevens voor verdere analyse. Hier wordt het elektropherogram van fosforyleerde extracellulaire signaalregulerende kinases van vasculaire endotheelgroeifactor gestimuleerd lysates getoond.Er is een zeer hoge inductie van fosforyleerde eiwitten waargenomen met vasculaire endotheelgroeifactor. De inzet toont de endogene ladingscontrole, HSP 70, wat wijst op een vergelijkbare belasting van monsters voor zowel onbehandelde als behandelde monsters. In een conventionele immunoblot werden slechts twee banden gedetecteerd, hoewel de fosforyleerde extracellulaire signaalregulerende kinase-eiwitten in vier pieken werden opgelost door capillaire isolementische scherpstelanalyse.Het elektropherogram van extracellulaire signaalregulerende kinases van vasculaire endotheelgroeifactor gestimuleerd lysates wordt hier getoond. De inzet toont dezelfde laadregeling die parallel wordt gebruikt. Een conventionele immunoblot toont slechts twee banden die overeenkomen met extracellulaire signaalgeregeerde kinase een en extracellulaire signaal-geregelde kinase twee.Terwijl met de capillaire isolementrische scherpstelling, de extracellulaire signaal-geregelde kinase eiwitten werden opgelost in zes pieken, wat overeenkomt met alle vier de verschillende fosforylated pieken en twee niet-fosforylated pieken. Eenmaal onder de knie, kan deze techniek worden gedaan in een paar uur, afhankelijk van het aantal cycli, als het goed wordt uitgevoerd. Tijdens een poging tot deze procedure is het belangrijk om te onthouden om hogere antilichaamconcentraties te gebruiken in vergelijking met conventionele immunoblots.Visuele demonstratie van deze methode is van cruciaal belang als de test stappen zijn moeilijk te leren als gevolg van trucs, zoals het verwijderen van bubbels, het laden van de plaat, et cetera. Na het bekijken van deze video, moet u een goed begrip van hoe een test te ontwerpen, monsters voor te bereiden, voer de test, en analyseren van de gegevens om verschillende isoforms van uw eiwit te observeren.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Highly Sensitive and Rapid Fluorescence Detection with a Portable FRET Analyzer

Uiterst gevoelige en Rapid fluorescentiedetectie met een Portable FRET Analyzer

Recent improvements in F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) sensors have enabled their use to detect various small molecules including ions and ...

An Efficient Method for the Isolation of Highly Purified RNA from Seeds for Use in Quantitative Transcriptome Analysis

Een efficiënte methode voor het isoleren van zeer gezuiverde RNA uit zaden voor gebruik in Quantitative Analysis Transcriptome

Plant seeds accumulate large amounts of storage reserves comprising biodegradable organic matter. Humans rely on seed storage reserves for food and as ...

Capillary Electrophoresis Separation of Monoclonal Antibody Isoforms Using a Neutral Capillary

Capillaire Elektroforese Scheiding van monoklonaal antilichaam isovormen gebruiken een neutrale capillair

Biotherapeutic proteins, such as monoclonal antibodies (mAbs), are feasible alternatives for the treatment of chronic-degenerative diseases. The ...

Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

Methode om te visualiseren en te analyseren Membrane interagerende eiwitten door Transmission Electron Microscopy

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

Formation of Covalent DNA Adducts by Enzymatically Activated Carcinogens and Drugs In Vitro and Their Determination by 32P-postlabeling

Formation of Covalent DNA Adducts by Enzymatically Activated Carcinogens and Drugs In Vitro and Their Determination by 32P-postlabeling

Vorming van covalente DNA adducten door enzymatisch geactiveerde kankerverwekkende stoffen en Drugs In Vitro en hun vastberadenheid door 32P-postlabeling

Covalent DNA adducts formed by chemicals or drugs with carcinogenic potency are judged as one of the most important factors in the initiation phase of ...

Detection of Detergent-sensitive Interactions Between Membrane Proteins

Detectie van wasmiddel-gevoelige interacties tussen membraaneiwitten

Our ability to explore protein-protein interactions is the key to understanding regulatory connections in the cell. However, detection of protein-protein ...

Quantitative and Qualitative Method for Sphingomyelin by LC-MS Using Two Stable Isotopically Labeled Sphingomyelin Species

Kwantitatieve en kwalitatieve methode voor sphingomyelinase door LC-MS met behulp van twee Stable ionenpaar label sphingomyelinase soorten

We present a method of analyzing sphingomyelin (SM) qualitatively and quantitatively by liquid chromatography-electrospray Ionization-tandem mass ...

Analysis of AtHIRD11 Intrinsic Disorder and Binding Towards Metal Ions by Capillary Gel Electrophoresis and Affinity Capillary Electrophoresis

Analyse van intrinsieke wanorde van de AtHIRD11 en bindende naar metaalionen door capillaire gelelektroforese en affiniteit capillaire elektroforese

Plants are strongly dependent on their environment. In order to adjust to stressful changes (e.g., drought and high salinity), higher plants evolve ...

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Detectie van Heterodimerization van eiwit Isoforms met behulp van een in Situ nabijheid afbinding Assay

Regulated protein-protein interactions are a guiding principle for many signaling events, and the detection of such events is an important element in ...

Use of Recombinant Fusion Proteins in a Fluorescent Protease Assay Platform and Their In-gel Renaturation

Gebruik van recombinante Fusion eiwitten in een fluorescerende Protease Assay Platform en hun In-gel renaturatie

Proteases are intensively studied enzymes due to their essential roles in several biological pathways of living organisms and in pathogenesis; therefore, ...