Name: highly sensitive and quantitative detection of proteins and their isoforms by capillary isoelectric focusing method
Uploaded: 2018-09-19T12:30:00
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L’auteur remercie le Prof. Lena Claesson-Welsh, Université d’Uppsala, en Suède, pour son soutien pour l’élaboration de ce projet. En outre, l’auteur remercie Ross Smith et Lena Claesson-Welsh, Université d’Uppsala pour leur lecture critique et des suggestions pour améliorer le manuscrit.

1. Culture, la Stimulation et la lyse des cellules
Remarque : Cette méthode peut être utilisée avec plusieurs types de cellules. Pour illustrer la méthode, un exemple d’utilisation des cellules endothéliales de veine ombilicale humaine (HUVEC) est décrite.
<ol><li>Culture des HUVECs sur gélatine-enduit, des plats de Pétri 10 cm dans le milieu basal des cellules endothéliales avec supplémentation appropriée (voir Table des matières) et contenant également 5 % ...

<ol>
	<li>O'Neill, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isoelectric+focusing+technology+quantifies+protein+signaling+in+25+cells.">Isoelectric focusing technology quantifies protein signaling in 25 cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (44), 16153-16158 (2006).</li><li>Aspinall-O'Dea, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody-based+detection+of+protein+phosphorylation+status+to+track+the+efficacy+of+novel+therapies+using+nanogram+protein+quantities+from+stem+cells+and+cell+lines.">Antibody-based detection of protein phosphorylation status to track the efficacy of novel therapies using nanogram protein quantities from stem cells and cell lines.</a> Nat Protoc. 10 (1), 149-168 (2015).</li><li>Fan, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanofluidic+proteomic+assay+for+serial+analysis+of+oncoprotein+activation+in+clinical+specimens.">Nanofluidic proteomic assay for serial analysis of oncoprotein activation in clinical specimens.</a> Nat Med. 15 (5), 566-571 (2009).</li><li>Padhan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+sensitivity+isoelectric+focusing+to+establish+a+signaling+biomarker+for+the+diagnosis+of+human+colorectal+cancer.">High sensitivity isoelectric focusing to establish a signaling biomarker for the diagnosis of human colorectal cancer.</a> BMC Cancer. 16 (1), 683 (2016).</li><li>Sun, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGFR2+induces+c-Src+signaling+and+vascular+permeability+in+vivo+via+the+adaptor+protein+TSAd.">VEGFR2 induces c-Src signaling and vascular permeability in vivo via the adaptor protein TSAd.</a> J Exp Med. 209 (7), 1363-1377 (2012).</li><li>Iacovides, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+quantification+of+AKT+isoforms+and+phosphoforms+in+breast+cancer+using+a+novel+nanofluidic+immunoassay.">Identification and quantification of AKT isoforms and phosphoforms in breast cancer using a novel nanofluidic immunoassay.</a> Mol Cell Proteomics. 12 (11), 3210-3220 (2013).</li><li>Price, F. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+JAK-STAT+signaling+stimulates+adult+satellite+cell+function.">Inhibition of JAK-STAT signaling stimulates adult satellite cell function.</a> Nat Med. 20 (10), 1174-1181 (2014).</li><li>Unger, F. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoproteomic+analysis+of+ischemia-dependent+changes+in+signaling+protein+phosphorylation+in+colorectal+normal+and+cancer+tissue.">Nanoproteomic analysis of ischemia-dependent changes in signaling protein phosphorylation in colorectal normal and cancer tissue.</a> J Transl Med. 14, 6 (2016).</li><li>Urasaki, Y., Pizzorno, G., Le, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+uridine+administration+induces+fatty+liver+and+pre-diabetic+conditions+in+mice.">Chronic uridine administration induces fatty liver and pre-diabetic conditions in mice.</a> PLoS One. 11 (1), e0146994 (2016).</li><li>Schmidt, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Case-specific+potentiation+of+glioblastoma+drugs+by+pterostilbene.">Case-specific potentiation of glioblastoma drugs by pterostilbene.</a> Oncotarget. 7 (45), 73200-73215 (2016).</li></ol>

Sensibilité et la résolution des protéines sont cruciales pour la recherche protéomique sur des échantillons biologiques. Il est une grande valeur à pouvoir détecter les protéines qui sont présentes en quantités infimes dans les cellules. cIEF peut offrir une sensibilité améliorée et la résolution pour la détection des protéines et leurs isoformes4.
Cette technologie a été utilisée avec succès dans plusieurs protéomiques recherche rapports<sup class...

Isoélectrofocalisation capillaire (cIEF) est un test immunologique automatisé, axée sur les capillaires qui résout des protéines sur la base de leurs frais1,2,3. Il est hautement reproductible et capable de résoudre les protéines et leurs isoformes modifiées post-traductionnellement rapidement et quantitativement. Il présente une alternative aux méthodes classiques comme le western blot. Alors que le western blot est très bon pour confirmer la présence de protéines abondantes dans les échantillons facilement accessibles ; variabilité, consommation de temps et dosage précis tous présents défis, en particulier lors de l’examen des échantillons de tissus biologiques. En effet, la variabilité est un problème inhérent à éponger occidental, qu’il y a nombreuses étapes, telles que le chargement et fonctionnement des gels SDS-PAGE, transfert des protéines sur membrane, incubation avec différents réactifs (e.g., primaire et secondaire anticorps, ECL) et le développement sur x-ray film4. Actuellement, la technique western blot s’améliore avec la mise en œuvre de l’enregistrement numérique des signaux par chimiluminescence (Western digital). Récemment, un système automatisé de transfert western a été développé, à savoir le capillaire Ouest, qui est un système plus les mains libres et sans gel. Le test complet est automatique après le chargement d’une plaque d’échantillon (échantillons avec tous les réactifs nécessaires) dans le système3,4. L’instrument se produira toutes les étapes telles que la séparation de protéines, immobilisation des protéines sur la paroi capillaire, des incubations anticorps, lave entre les différentes étapes, de développement et quantification des signaux par chimiluminescence. Ainsi, la procédure de cIEF présentée ici fournit plus haut résolution et sensibilité.
Cette méthode est sensible, comme les signaux peuvent être générés et quantifiés de picogrammes de protéines1. La haute sensibilité avec excellente reproductibilité rend cette technologie très utile pour l’analyse des échantillons cliniques. Il peut détecter ainsi distinguer post traductionnelle modification (par exemple, les isoformes de protéines phosphorylées différents) des protéines. Cette technologie a été utilisée avec succès pour disséquer les différents signalisation voies4,5 études cliniques visant à développer de nouvelles thérapeutiques dans le cancer3, et il a un grand potentiel pour la protéine biomarqueur et découverte de médicaments .

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="920">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:367px;">NanoPro 1000</td>
			<td style="width:107px;">ProteinSimple</td>
			<td style="width:301px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Premix G2, pH 5&#8211;8 (nested) separation gradient, pH 2&#8211;4 plug</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-972</td>
			<td>Ampholyte premix</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DMSO inhibitor mix</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-510</td>
			<td>Phosphatase inhibitors; for cIEF 1:50 dilution used</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Aqueous Inhibitor Mix</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-482</td>
			<td>Protease inhibitor; for cIEF 1:25 dilution used</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">pI standard ladder 3</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-646</td>
			<td>For cIEF 1:60 dilution used</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sample diluent</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-649</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Antibody diluent&#160;</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Wash concentrate</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>041-108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Anolyte Refill</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Catholyte Refill</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-338</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Peroxide XDR</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>041-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Luminol</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Bicine/CHAPS Lysis Buffer</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Capillaries-Charge Separation (1 pack) for&#160;</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>CBS700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Assay Plate/Lid Kit</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Peroxidase-AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)&#160;</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch&#160;</td>
			<td>711-035-152</td>
			<td>For cIEF used (1: 300)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Peroxidase-AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)&#160;</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch&#160;</td>
			<td>715-035-150</td>
			<td>For cIEF used (1: 300)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Phospho-Erk 1/2 Primary Antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9101</td>
			<td>For cIEF used (1: 50)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Pan Erk Primary Antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9102</td>
			<td>For cIEF used (1: 100)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Compass software</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">HUVEC</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>PCS-100-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MV2 (EBM-2)</td>
			<td>PromoCell</td>
			<td>&#160;C-22221</td>
			<td>Endothelia cell basal medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Endothelial Cell Growth Medium MV2 SupplementPack</td>
			<td>PromoCell</td>
			<td>C-39221</td>
			<td>Supplementation to MV2 above</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">VEGFA</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Long R3 IGF</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>85580C/I1146</td>
			<td>Insulin-like growth factor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bioruptor (Sonicator)</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>B01020001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BCA Protein Assay kit&#160;</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>NP0322BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NuPAG MOPS SDS Running Buffer (20X)</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>NP0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NuPAGE Transfer Buffer (20X)</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>NP0006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Immobilon PVDF membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microfuge tube vortexer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Microtiter plate adapter for centrifuge</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Pipettors&#160;</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Tips</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Ice</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

highly sensitive and quantitative detection of proteins and their isoforms by capillary isoelectric focusing method

Immunoblotting est devenue une technique courante dans de nombreux laboratoires pour la caractérisation de protéines provenant d’échantillons biologiques. Le protocole suivant fournit une autre stratégie, capillaire isoélectrique en se concentrant (cIEF), avec de nombreux avantages comparé à conventionnel immunoblotting. Il s’agit d’une méthode axée sur les anticorps, automatisée, rapide et quantitative, dans lequel une procédure complète de transfert occidentale se déroule à l’intérieur d’un tube capillaire ultramince. Cette technique ne nécessite un gel de transférer à une membrane, décapage des taches, ni aux rayons x des films qui sont habituellement requis pour immunoblotting classique. Ici, les protéines sont séparées selon leur charge (point isoélectrique ; pI), à l’aide de moins d’un microlitre (400 nL) de lysat de protéine total. Après électrophorèse, les protéines sont immobilisés sur la paroi des capillaires de traitement par la lumière ultraviolette, suivie de primaire et secondaire (peroxydase de raifort (HRP) conjuguée) amélioré d’incubation d’anticorps, dont liaison détectée par le biais chimiluminescence (ECL), générant un signal lumineux qui peut être capturé et enregistré par une caméra à dispositif à couplage de charge (CCD). L’image numérique peut être analysé et quantifié (aire du PIC) à l’aide de logiciels. Cette procédure de haut débit peut gérer 96 échantillons à la fois. est très sensible, avec détection de protéines dans la gamme picogramme ; et produit des résultats hautement reproductible en raison de l’automatisation. Tous ces aspects sont extrêmement précieuses lorsque la quantité d’échantillons (par exemple, des échantillons de tissus et biopsies) est un facteur limitant. La technique a des applications plus larges, y compris le dépistage des drogues ou des anticorps, découverte de biomarqueurs et des fins de diagnostic.

Conception d’une nouvelle méthode de dosage : Une disposition de plaque dosage est illustrée dans la Figure 1 a. Au maximum, 96 puits peuvent être utilisés de la plaque 384 puits en blocs de 12 puits pour chaque maladie (anticorps). Chaque bloc de 12 puits peut commencer soit à partir de A1-A12 ou A13-A24. Lignes de code couleur permettent de distinguer des échantillons ou des réactifs de l’autre. Dans le modèle de test (<strong ...

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Highly Sensitive and Quantitative Detection of Proteins and Their Isoforms by Capillary Isoelectric Focusing Method

La focalisation isoélectrique capillaire est une technique de base d’anticorps, ultrasensible, haut débit, ce qui permet une caractérisation détaillée de protéines et leurs isoformes de très petits échantillons biologiques. Ce qui suit décrit un protocole pour la détection et la quantification des protéines spécifiques et leurs isoformes de manière automatisée et robotisée.

Détection très sensible et Quantitative des protéines et leurs isoformes par isoélectrofocalisation capillaire méthode

Immunoblotting has become a routine technique in many laboratories for protein characterization from biological samples. The following protocol provides ...

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la recherche biomédicale, telles que la découverte de biomarqueurs, la découverte de médicaments, le diagnostic et le dépistage de médicaments ou d’anticorps. Le principal avantage de cette technique est qu’elle est à haut débit et peut détecter les isoformes protéiques d’une manière hautement reproductible. Les implications de cette technique s’étendent vers le diagnostic de nombreuses maladies car elle peut mesurer les protéines affectées ou leurs isoformes.Bien que cette méthode puisse fournir un aperçu des voies de signalisation cellulaire, elle peut également être appliquée à d’autres systèmes où des protéines spécifiques doivent être analysées. La démonstration visuelle de cette méthode est critique car les étapes d’essai sont difficiles à apprendre en raison des tours, tels que l’enlèvement des bulles, le chargement de la plaque, et cetera. Tout d’abord, préparer un mélange diluant échantillon en ajoutant un microlitre de mélange inhibiteur DMSO et deux microlitres d’inhibiteurs de la protéase à 47 microlitres de diluant échantillon, de sorte que la concentration finale de DMSO et inhibiteurs de la protéase est un X.Dilute protéines précédemment isolées lysates en utilisant le mélange diluant échantillon pour obtenir les concentrations désirées.Ensuite, ajoutez 3.325 microlitres de l’échelle standard, six microlitres de l’inhibiteur de protéase, et trois microlitres de l’inhibiteur de DMSO à 137.675 microlitres du prémix d’antholite. Vortex l’échantillon au moins 15 secondes et garder sur la glace. Mélanger les deux solutions préparées dans un rapport un à trois de sorte que les concentrations finales d’inhibiteurs de la protéase DMSO et l’échelle standard de point isoélectrique sont un X et les protéines dans le capillaire atteignent les concentrations finales souhaitées.Une fois que les protéines sont ajoutées au mélange de l’échantillon, toutes les étapes seront effectuées sur la glace ou à quatre degrés Celsius. Déposer une plaque de 384 puits sur la glace. Chargez dix microlitres du mélange d’échantillon dans le puits approprié de la plaque, selon la disposition de modèle d’essai conçue avec le logiciel automatisé de système occidental de ballonnement.Par la suite, diluer les anticorps primaires et secondaires avec du diluant anticorps. Ensuite, pipette dix microlitres d’anticorps primaires et 15 microlitres d’anticorps secondaires dans chaque puits. Ensuite, mélanger le luminol et le peroxyde XDR dans un rapport un à un.Pipette 15 microlitres du peroxyde de luminol se mélangent dans chaque puits. Une fois que les échantillons et les reagants ont été ajoutés à la plaque, centrifugeuse pendant dix minutes à 2500 fois G et quatre degrés Celsius pour faire tourner le liquide et enlever les bulles. Si des bulles existent encore, retirez-les manuellement à l’aide d’une fine pointe de pipette.Ouvrez le logiciel automatisé du système de ballonnement occidental et cliquez sur new’from the file menu. Allez à la vitre de mise en page et assignez des emplacements pour les reagants et les échantillons dans la plaque de 384 puits. Faites une mission reaganiste en cliquant sur un puits n’importe où dans le bloc.Sélectionnez un bloc de ligne de 12 puits chacun. Ensuite, rendez-vous à la barre d’outils de mise en page et insérez un bloc de ligne d’échantillon, primaire, secondaire ou luminol. Allez à la vitre du protocole et sélectionnez un emplacement reaganien dans la plaque.Ensuite, cliquez sur la cellule dans la colonne de l’échantillon et sélectionnez le reagant dans le menu drop-down. De la même manière, sélectionnez les emplacements reagant pour le primaire, secondaire et luminol pour chaque cycle. Cliquez sur les cellules une à la fois dans la colonne d’anticorps primaire ou secondaire et modifiez les temps d’incubation si nécessaire.Ensuite, ajoutez des cycles en cliquant sur l’Add’button dans la section protocole. Dans le volet modèle, entrez des informations relatives à l’échantillon, telles que l’identité des anticorps primaires et secondaires, leurs numéros de catalogue et leurs dilutions. Enregistrez le nouveau fichier d’analyse.Avant de cliquer sur le bouton de démarrage, vérifiez rapidement la mise en page pour vous assurer que tout est correct. Maintenant, cliquez sur start’to commencer la course. Le logiciel incitera l’utilisateur à enlever les déchets, à remplir l’eau et la boîte capillaire, à ajouter de l’anolite et de la catholite au plateau de ressources, à ajouter un tampon de lavage et à charger la plaque dans le plateau d’échantillons refroidi.Une barre d’état de l’instrument sera affichée sur l’écran de l’ordinateur quelques minutes après le début de la course. Cliquez sur l’écran summary’screen d’exécution pour voir l’état et les volets de séparation. Pour observer la séparation de l’électrophorèse dans un capillaire, jouez le film de séparation pour ce capillaire en cliquant sur le cycle désiré, puis en cliquant sur le bouton de lecture dans le panneau de commande.Ouvrez le fichier d’exécuter et sélectionnez l’onglet écran d’analyse. Cliquez sur edit’puis analysis’to change the isoelectric point range. Appliquez la norme de point isoélectrique appropriée.Ajoutez un ajustement de pointe, et ajoutez un nom de crête. Enfin, sélectionnez les données à utiliser dans l’onglet pics et exportez les données pour une analyse plus approfondie. L’électrophéogramme des kinases extracellulaires phosphorylatées de signal-réglé des lysates stimulés par facteur de croissance endothélial vasculaire est montré ici.Il y a une induction très élevée des protéines phosphorylatées observées avec le facteur de croissance endothélial vasculaire. L’encart montre le contrôle de chargement endogène, HSP 70, indiquant une charge similaire d’échantillons pour les échantillons non traités et traités. Dans un immunoblot conventionnel, seulement deux bandes ont été détectées, même si les protéines extracellulaires phosphorylatées de kinase signal-réglées ont été résolues dans quatre crêtes par l’analyse isoélectrique capillaire de focalisation.L’électrophéogramme des kinases filiculaires régulées par le signal des lysates stimulés par facteur de croissance endothélial vasculaire est montré ici. L’encart affiche le même contrôle de chargement utilisé en parallèle. Un immunoblot conventionnel ne montre que deux bandes correspondant à la kinase extracellulaire régulée par le signal une et à la kinase deux régulée par le signal extracellulaire.Alors qu’avec la focalisation isoélectrique capillaire, les protéines de kinase régulées par le signal extracellulaire ont été résolues en six pics, correspondant aux quatre pics phosphorylatés différents et à deux pics non phosphorylatés. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en quelques heures, selon le nombre de cycles, si elle est effectuée correctement. Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler d’employer des concentrations plus élevées d’anticorps par rapport aux immunoblots conventionnels.La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car les étapes d’analyse sont difficiles à apprendre en raison de trucs, tels que l’élimination des bulles, le chargement de la plaque, et cetera. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de concevoir un test, préparer des échantillons, exécuter l’analyse, et d’analyser les données pour observer différents isoformes de votre protéine.

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Analyse de AtHIRD11 désordre intrinsèque et la liaison vers les Ions métalliques par électrophorèse capillaire et l’électrophorèse capillaire affinité

Plants are strongly dependent on their environment. In order to adjust to stressful changes (e.g., drought and high salinity), higher plants evolve ...

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Détection de hétérodimérisation des isoformes de protéines à l’aide d’un test in Situ proximité ligature

Regulated protein-protein interactions are a guiding principle for many signaling events, and the detection of such events is an important element in ...

Use of Recombinant Fusion Proteins in a Fluorescent Protease Assay Platform and Their In-gel Renaturation

Utilisation des protéines de Fusion recombinantes dans une plate-forme de test de protéase Fluorescent et leur Renaturation en gel

Proteases are intensively studied enzymes due to their essential roles in several biological pathways of living organisms and in pathogenesis; therefore, ...