Name: highly sensitive and quantitative detection of proteins and their isoforms by capillary isoelectric focusing method
Uploaded: 2018-09-19T12:30:00
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Der Autor dankt Prof. Lena Claesson-Welsh, Universität Uppsala, Schweden für ihre Unterstützung für die Entwicklung dieses Projekts. Darüber hinaus dank der Autor Ross Smith und Lena Claesson-Welsh, Uppsala Universität für ihre kritischen Lektüre und Vorschläge zur Verbesserung der Handschrift.

(1) Zell-Kultur, Stimulation und Lyse
Hinweis: Diese Methode kann mit vielen Zelltypen verwendet werden. Um die Methode zu veranschaulichen, ist ein Beispiel für die Verwendung von menschlichen nabelader Endothelzellen (Mediumwechsel) beschrieben.
<ol><li>Kultur Mediumwechsel auf Gelatine beschichtet, 10 cm Petrischalen in Endothelzellen basal Medium mit entsprechenden Ergänzung (siehe Tabelle der Materialien), und auch mit 5 % FCS, epidermalen Wachstumsfaktor (5 ng/mL), v...

<ol>
	<li>O'Neill, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isoelectric+focusing+technology+quantifies+protein+signaling+in+25+cells.">Isoelectric focusing technology quantifies protein signaling in 25 cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (44), 16153-16158 (2006).</li><li>Aspinall-O'Dea, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody-based+detection+of+protein+phosphorylation+status+to+track+the+efficacy+of+novel+therapies+using+nanogram+protein+quantities+from+stem+cells+and+cell+lines.">Antibody-based detection of protein phosphorylation status to track the efficacy of novel therapies using nanogram protein quantities from stem cells and cell lines.</a> Nat Protoc. 10 (1), 149-168 (2015).</li><li>Fan, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanofluidic+proteomic+assay+for+serial+analysis+of+oncoprotein+activation+in+clinical+specimens.">Nanofluidic proteomic assay for serial analysis of oncoprotein activation in clinical specimens.</a> Nat Med. 15 (5), 566-571 (2009).</li><li>Padhan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+sensitivity+isoelectric+focusing+to+establish+a+signaling+biomarker+for+the+diagnosis+of+human+colorectal+cancer.">High sensitivity isoelectric focusing to establish a signaling biomarker for the diagnosis of human colorectal cancer.</a> BMC Cancer. 16 (1), 683 (2016).</li><li>Sun, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGFR2+induces+c-Src+signaling+and+vascular+permeability+in+vivo+via+the+adaptor+protein+TSAd.">VEGFR2 induces c-Src signaling and vascular permeability in vivo via the adaptor protein TSAd.</a> J Exp Med. 209 (7), 1363-1377 (2012).</li><li>Iacovides, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+quantification+of+AKT+isoforms+and+phosphoforms+in+breast+cancer+using+a+novel+nanofluidic+immunoassay.">Identification and quantification of AKT isoforms and phosphoforms in breast cancer using a novel nanofluidic immunoassay.</a> Mol Cell Proteomics. 12 (11), 3210-3220 (2013).</li><li>Price, F. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+JAK-STAT+signaling+stimulates+adult+satellite+cell+function.">Inhibition of JAK-STAT signaling stimulates adult satellite cell function.</a> Nat Med. 20 (10), 1174-1181 (2014).</li><li>Unger, F. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoproteomic+analysis+of+ischemia-dependent+changes+in+signaling+protein+phosphorylation+in+colorectal+normal+and+cancer+tissue.">Nanoproteomic analysis of ischemia-dependent changes in signaling protein phosphorylation in colorectal normal and cancer tissue.</a> J Transl Med. 14, 6 (2016).</li><li>Urasaki, Y., Pizzorno, G., Le, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+uridine+administration+induces+fatty+liver+and+pre-diabetic+conditions+in+mice.">Chronic uridine administration induces fatty liver and pre-diabetic conditions in mice.</a> PLoS One. 11 (1), e0146994 (2016).</li><li>Schmidt, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Case-specific+potentiation+of+glioblastoma+drugs+by+pterostilbene.">Case-specific potentiation of glioblastoma drugs by pterostilbene.</a> Oncotarget. 7 (45), 73200-73215 (2016).</li></ol>

Empfindlichkeit und Auflösung von Proteinen sind entscheidend für die Proteomik Forschung an biologischen Proben. Es ist großer Wert in der Lage, Proteine zu erkennen, die in kleinsten Mengen in den Zellen vorhanden sind. Polizeichefs bieten verbesserte Empfindlichkeit und Auflösung für den Nachweis von Proteinen und deren Isoformen4.
Diese Technologie wird erfolgreich in vielen Proteomic Forschung Berichte5,6</s...

Kapillare isoelektrischen Fokussierung (cIEF) ist eine automatisierte, Kapillar-basierte Immunoassay, der Proteine auf der Grundlage ihrer Ladung1,2,3aufgelöst wird. Es ist hoch reproduzierbare und auflösen, Proteine und ihre posttranslational modifizierten Isoformen schnell und quantitativ. Es stellt eine Alternative zu herkömmlichen Methoden wie westliche Beflecken. Während westliche Beflecken sehr gut ist für die Anwesenheit von reichlich Proteine in leicht zugänglichen Proben bestätigen; Variabilität, Verbrauch und genaue Quantifizierung aller anwesenden Herausforderungen, insbesondere bei der Prüfung, biologische Gewebeproben. In der Tat Variabilität ist eine inhärente Problem in westliche Beflecken, denn es gibt zahlreiche Schritte, wie laden und Ausführen von SDS-PAGE Gelen, Transfer von Proteinen auf der Membran, Inkubation mit verschiedenen Reagenzien (zB., primäre und sekundäre Antikörper, ECL), und die Entwicklung auf x-ray Film4. Derzeit ist die western Blot-Technik bei der Umsetzung der digitalen Aufnahmetechnik Chemolumineszenz Signale (Western digital) verbessern. Vor kurzem, ein automatisiertes western Blot-System wurde entwickelt, nämlich die Kapillare westlichen, die ein Freisprech- und Gel-freies System ist. Der gesamte Test ist automatisiert nach das Laden von einem Probenteller (Proben mit allen notwendigen Reagenzien) in das System3,4. Das Instrument wird alle Schritte wie Protein Trennung, Immobilisierung von Proteinen auf Kapillare Wand, Antikörper Inkubationen wäscht zwischen verschiedenen Stufen und Entwicklung und Quantifizierung der Chemilumineszenz-Signale. So bietet die Polizeichefs Verfahren hier vorgestellten höhere Auflösung und Empfindlichkeit.
Diese Methode ist empfindlich, da Signale generiert und von Pikogramm Proteine1quantifiziert werden können. Die hohe Empfindlichkeit mit hervorragende Reproduzierbarkeit macht diese Technologie sehr nützlich für die Analyse von klinischen Proben. Es kann zu erkennen sowie Post translationale Modifikation (z. B. verschiedene phosphorylierten Proteine Isoformen) von Proteinen zu unterscheiden. Diese Technologie wurde erfolgreich verwendet, um unterschiedliche Signalisierung Wege4,5 in klinischen Studien zur Entwicklung neuen Therapeutika in Krebs3zu sezieren, und es hat ein großes Potenzial für Protein Biomarker und Drug discovery .

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="920">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:367px;">NanoPro 1000</td>
			<td style="width:107px;">ProteinSimple</td>
			<td style="width:301px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Premix G2, pH 5&#8211;8 (nested) separation gradient, pH 2&#8211;4 plug</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-972</td>
			<td>Ampholyte premix</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DMSO inhibitor mix</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-510</td>
			<td>Phosphatase inhibitors; for cIEF 1:50 dilution used</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Aqueous Inhibitor Mix</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-482</td>
			<td>Protease inhibitor; for cIEF 1:25 dilution used</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">pI standard ladder 3</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-646</td>
			<td>For cIEF 1:60 dilution used</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sample diluent</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-649</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Antibody diluent&#160;</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Wash concentrate</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>041-108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Anolyte Refill</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Catholyte Refill</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-338</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Peroxide XDR</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>041-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Luminol</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Bicine/CHAPS Lysis Buffer</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Capillaries-Charge Separation (1 pack) for&#160;</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>CBS700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Assay Plate/Lid Kit</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Peroxidase-AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)&#160;</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch&#160;</td>
			<td>711-035-152</td>
			<td>For cIEF used (1: 300)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Peroxidase-AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)&#160;</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch&#160;</td>
			<td>715-035-150</td>
			<td>For cIEF used (1: 300)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Phospho-Erk 1/2 Primary Antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9101</td>
			<td>For cIEF used (1: 50)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Pan Erk Primary Antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9102</td>
			<td>For cIEF used (1: 100)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Compass software</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">HUVEC</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>PCS-100-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MV2 (EBM-2)</td>
			<td>PromoCell</td>
			<td>&#160;C-22221</td>
			<td>Endothelia cell basal medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Endothelial Cell Growth Medium MV2 SupplementPack</td>
			<td>PromoCell</td>
			<td>C-39221</td>
			<td>Supplementation to MV2 above</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">VEGFA</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Long R3 IGF</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>85580C/I1146</td>
			<td>Insulin-like growth factor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bioruptor (Sonicator)</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>B01020001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BCA Protein Assay kit&#160;</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>NP0322BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NuPAG MOPS SDS Running Buffer (20X)</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>NP0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NuPAGE Transfer Buffer (20X)</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>NP0006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Immobilon PVDF membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microfuge tube vortexer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Microtiter plate adapter for centrifuge</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Pipettors&#160;</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Tips</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Ice</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

highly sensitive and quantitative detection of proteins and their isoforms by capillary isoelectric focusing method

Immunoblotting ist eine routinemäßige Technik in vielen Laboratorien zur Charakterisierung von Protein aus biologischen Proben geworden. Das folgende Protokoll bietet eine alternative Strategie, Kapillare isoelektrischen Fokussierung (cIEF), mit vielen Vorteilen im Vergleich zu herkömmlichen Immunoblotting. Dies ist ein Antikörper-basierte, automatisierte, schnelle und quantitative Methode, in der eine vollständige westlichen befleckenden Verfahren innerhalb einer ultradünnen Kapillare stattfindet. Diese Technik erfordert eine Gel auf eine Membran, Abisolieren von Flecken, übertragen und x-ray-Filme, die in der Regel für konventionelle Immunoblotting erforderlich sind. Hier werden Proteine getrennt nach ihrer Ladung (isoelektrischen Punkt, pI), Verwendung von weniger als einem Mikroliter (400 nL) des gesamten Proteins lysate. Nach Elektrophorese, sind Proteine auf die Kapillarwände durch UV-Licht-Behandlung, gefolgt von primären und sekundären (Meerrettich Peroxidase (HRP) konjugiert) immobilisierten Antikörper Inkubationszeit, dessen Bindung durch erkannt wird verbessert Chemilumineszenz (ECL), erzeugen ein Lichtsignal, die gefangen genommen und von einer – Coupled Ladegerät (CCD) Kamera aufgenommen werden kann. Das Digitalbild können analysiert und quantifiziert (Peakfläche) mit Software. Dieses Hochdurchsatz-Verfahren kann 96 Proben gleichzeitig bearbeiten; ist hochempfindlich, mit Proteindetektion im Bereich von Picogram; und produziert hoch reproduzierbare Ergebnisse durch Automatisierung. All diese Aspekte sind sehr wichtig, wenn die Menge von Proben (z.B., Gewebeproben und Biopsien) ein limitierender Faktor ist. Die Technik hat breitere Anwendungsmöglichkeiten, inklusive Screening von Drogen oder Antikörper, Entdeckung von Biomarkern und diagnostische Zwecke.

Entwurf eines neuen Assays: Eine Test-Platte-Layout ist in Figur 1Adargestellt. Maximal, 96 Wells von 384-Well-Platte in Blöcken von 12 Brunnen für jede Bedingung (Antikörper) einsetzbar. Jeder Block von 12 Brunnen kann entweder von A1-A12 oder A13-A24 beginnen. Farbcodierte Zeilen erlauben es, Proben oder Reagenzien von einander zu unterscheiden. In der Assay-Vorlage (Abbildung 1 b), relevante Informationen d...

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Highly Sensitive and Quantitative Detection of Proteins and Their Isoforms by Capillary Isoelectric Focusing Method

Kapillare isoelektrischen Fokussierung ist eine Antikörper-basierten, empfindsamen, hoher Durchsatz-Technik, ermöglicht detaillierte Charakterisierung von Proteinen und deren Isoformen von extrem kleinen biologischen Proben. Im folgenden beschreibt ein Protokoll für die Erkennung und Quantifizierung von spezifischen Proteinen und deren Isoformen robotisierte und automatisierte.

Hochsensible und quantitativen Nachweis von Proteinen und deren Isoformen durch Kapillare isoelektrischen Fokussierung Methode

Immunoblotting has become a routine technique in many laboratories for protein characterization from biological samples. The following protocol provides ...

Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im bereich der biomedizinischen Forschung zu beantworten, wie Biomarker-Entdeckung, Arzneimittelentdeckung, Diagnostik und Screening von Medikamenten oder Antikörpern. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie einen hohen Durchsatz hat und Proteinisoformen auf hochreproduzierbare Weise erkennen kann. Die Implikationen dieser Technik reichen auf die Diagnose vieler Krankheiten, da sie betroffene Proteine oder ihre Isoformen messen kann.Obwohl diese Methode Einen Einblick in Zellsignalwege geben kann, kann sie auch auf andere Systeme angewendet werden, in denen bestimmte Proteine analysiert werden müssen. Visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da die Assay-Schritte aufgrund der Tricks, wie das Entfernen von Blasen, Das Laden der Platte, et cetera, schwer zu erlernen sind. Zunächst bereiten Sie eine Probenverdünnungsmischung vor, indem Sie einen Mikroliter DMSO-Inhibitormischung und zwei Mikroliter Proteaseinhibitoren zu 47 Mikrolitern Probenverdünnungsmittel hinzufügen, so dass die Endkonzentration von DMSO- und Proteasehemmern ein X.Dilute zuvor isoliertes Proteinlysat mit der Probenverdünnungsmischung beträgt, um die gewünschten Konzentrationen zu erhalten.Als nächstes fügen Sie 3,325 Mikroliter Standardleiter, sechs Mikroliter Protease-Inhibitor und drei Mikroliter DMSO-Hemmer zu 137.675 Mikroliter Antholite-Premix hinzu. Wirbeln Sie die Probe mindestens 15 Sekunden und halten Sie auf Eis. Mischen Sie die beiden vorbereiteten Lösungen im Verhältnis eins zu drei, so dass die Endkonzentrationen der DMSO-Protease-Inhibitoren und der isoelektrischen Punktstandardleiter ein X sind und die Proteine in der Kapillare die endgültigen gewünschten Konzentrationen erreichen.Nachdem die Proteine der Probenmischung zugesetzt wurden, werden alle Schritte auf Eis oder bei vier Grad Celsius durchgeführt. Legen Sie eine 384-Well-Platte auf Eis. Laden Sie zehn Mikroliter der Probe in den entsprechenden Brunnen der Platte, entsprechend dem Assay-Vorlagenlayout, das mit der automatisierten Western Blotting-Systemsoftware entwickelt wurde.Anschließend die primären und sekundären Antikörper mit Antikörperverdünnung verdünnen. Dann Pipette zehn Mikroliter primärer Antikörper und 15 Mikroliter sekundärer Antikörper in jeden Brunnen. Als nächstes, mischen Luminol und Peroxid XDR in einem Verhältnis eins zu eins.Pipette 15 Mikroliter des Luminolperoxids in jeden Brunnen mischen. Sobald die Proben und Reagants auf die Platte gegeben wurden, Zentrifuge für zehn Minuten bei 2500 mal G und vier Grad Celsius, um die Flüssigkeit zu drehen und die Blasen zu entfernen. Wenn Blasen noch vorhanden sind, entfernen Sie sie manuell mit einer dünnen Pipettenspitze.Öffnen Sie die automatisierte Western Blotting-Systemsoftware und klicken Sie im Dateimenü auf neu.' Wechseln Sie zum Layoutbereich, und weisen Sie Positionen für Reagants und Samples in der 384-Well-Platte zu. Machen Sie eine Reagant-Zuweisung, indem Sie auf einen Brunnen an einer beliebigen Stelle im Block klicken.Wählen Sie einen Reihenblock mit jeweils 12 Bohrungen aus. Wechseln Sie anschließend zur Werkzeugleiste des Layoutbereichs, und fügen Sie einen Beispiel-, primären, sekundären oder luminol-Zeilenblock ein. Wechseln Sie zum Protokollbereich, und wählen Sie eine Reagant-Position in der Platte aus.Klicken Sie dann auf die Zelle in der Beispielspalte, und wählen Sie den Reagant aus dem Dropdown-Menü aus. Wählen Sie auf die gleiche Weise die Reagant-Positionen für den primären, sekundären und Luminol für jeden Zyklus aus. Klicken Sie auf die Zellen nacheinander in der primären oder sekundären Antikörperspalte, und ändern Sie ggf. die Inkubationszeiten.Fügen Sie dann Zyklen hinzu, indem Sie im Protokollabschnitt auf die Schaltfläche Hinzufügen klicken. Geben Sie im Vorlagenbereich Informationen zum Beispiel ein, z. B. die Identität der primären und sekundären Antikörper, deren Katalognummern und Verdünnungen. Speichern Sie die neue Assay-Datei.Bevor Sie auf den Start-Button klicken, überprüfen Sie schnell das Layout, um sicherzustellen, dass alles korrekt ist. Klicken Sie nun auf start', um die Ausführung zu starten. Die Software fordert den Benutzer auf, den Abfall zu entfernen, das Wasser und die Kapillarbox nachzufüllen, Anolit und Katholith in das Ressourcenfach einzubauen, einen Waschpuffer hinzuzufügen und die Platte in die gekühlte Probenschale zu laden.Eine Instrumentenstatusleiste wird einige Minuten nach dem Start der Ausführung auf dem Computerbildschirm angezeigt. Klicken Sie auf den Bildschirm der Ausführungszusammenfassung, um den Status- und Trennbereichen anzuzeigen. Um die Elektrophorese-Trennung in einer Kapillare zu beobachten, spielen Sie den Trennfilm für diese Kapillare ab, indem Sie auf den gewünschten Zyklus klicken und dann auf die Wiedergabetaste im Bedienfeld klicken.Öffnen Sie die Ausführungsdatei, und wählen Sie die Registerkarte Analysebildschirm aus. Klicken Sie auf Bearbeiten und dann auf Analyse, um den isoelektrischen Punktbereich zu ändern. Wenden Sie den entsprechenden isoelektrischen Punktstandard an.Fügen Sie eine Spitzenanpassung hinzu, und fügen Sie einen Spitzennamen hinzu. Wählen Sie schließlich die Daten aus, die auf der Registerkarte Peaks verwendet werden sollen, und exportieren Sie die Daten für die weitere Analyse. Das Elektropherogramm von phosphorylierten extrazellulären signalregulierten Kiinasen aus vaskulären endotheliaalen Wachstumsfaktor-stimulierten Lysaten wird hier gezeigt.Es gibt eine sehr hohe Induktion von phosphorylierten Proteinen, die mit dem vaskulären endotheliaalen Wachstumsfaktor beobachtet werden. Der Einlauf zeigt die endogene Ladekontrolle HSP 70, die eine ähnliche Belastung von Proben sowohl für unbehandelte als auch für behandelte Proben anzeigt. In einem konventionellen Immunoblot wurden nur zwei Bänder nachgewiesen, obwohl die phosphorylierten extrazellulären signalregulierten Kinase-Proteine durch kapillare isoelektrische Fokussierungsanalyse in vier Spitzen aufgelöst wurden.Das Elektropherogramm extrazellulärer signalregulierter Kiinasen aus vaskulären endotheliaalen Wachstumsfaktor-stimulierten Lysaten wird hier gezeigt. Der Einset zeigt die gleiche Ladesteuerung, die parallel verwendet wird. Ein herkömmlicher Immunoblot zeigt nur zwei Bänder, die der extrazellulären signalregulierten Kinase eins und extrazellulär ereine signalregulierte Kinase zwei entsprechen.Während bei der kapillaren isoelektrischen Fokussierung die extrazellulären signalregulierten Kinase-Proteine in sechs Peaks aufgelöst wurden, was allen vier verschiedenen phosphorylierten Peaks und zwei unphosphorylierten Peaks entspricht. Einmal gemeistert, kann diese Technik in wenigen Stunden durchgeführt werden, abhängig von der Anzahl der Zyklen, wenn sie richtig ausgeführt wird. Beim Versuch dieses Verfahrens, Es ist wichtig, sich daran zu erinnern, höhere Antikörperkonzentrationen im Vergleich zu herkömmlichen Immunoblots zu verwenden.Visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da die Assay-Schritte aufgrund von Tricks wie Blasen entfernen, Laden der Platte usw. schwer zu erlernen sind. Nachdem Sie sich dieses Video angeschaut haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie einen Assay entwerfen, Proben vorbereiten, den Test ausführen und die Daten analysieren, um verschiedene Isoformen Ihres Proteins zu beobachten.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

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Forschung

Biochemie

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Capillary Electrophoresis Separation of Monoclonal Antibody Isoforms Using a Neutral Capillary

Kapillarelektrophorese Trennung des monoklonalen Antikörpers Isoformen eine Neutral Kapillare

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Verfahren zum Visualisieren und Analysieren Membran interagierender Proteine ​​durch Transmissionselektronenmikroskopie

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Bildung von kovalenten DNA Addukte durch enzymatisch aktivierten Karzinogene und Drogen In Vitro und ihre Entschlossenheit von 32P-postlabeling

Covalent DNA adducts formed by chemicals or drugs with carcinogenic potency are judged as one of the most important factors in the initiation phase of ...

Detection of Detergent-sensitive Interactions Between Membrane Proteins

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Our ability to explore protein-protein interactions is the key to understanding regulatory connections in the cell. However, detection of protein-protein ...

Quantitative and Qualitative Method for Sphingomyelin by LC-MS Using Two Stable Isotopically Labeled Sphingomyelin Species

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Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Erkennung von Heterodimerization Protein-Isoformen, die mit einem in Situ Nähe Ligation Assay

Regulated protein-protein interactions are a guiding principle for many signaling events, and the detection of such events is an important element in ...

Use of Recombinant Fusion Proteins in a Fluorescent Protease Assay Platform and Their In-gel Renaturation

Einsatz von rekombinanten Fusionsproteinen in eine fluoreszierende Protease-Assay-Plattform und ihre In-Gel-Renaturierung

Proteases are intensively studied enzymes due to their essential roles in several biological pathways of living organisms and in pathogenesis; therefore, ...