Name: highly sensitive and quantitative detection of proteins and their isoforms by capillary isoelectric focusing method
Uploaded: 2018-09-19T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Highly Sensitive and Quantitative Detection of Proteins and Their Isoforms by Capillary Isoelectric Focusing Method at JoVE.com

המחבר תודה פרופסור לנה Claesson-ולש, אוניברסיטת אופסלה, שוודיה לתמיכה שלה לפיתוח הפרויקט. בנוסף, המחבר תודה רוס סמית, לינה Claesson-ולש, אוניברסיטת אופסלה קריאה ביקורתית, הצעות לשיפור כתב היד.

1. תא תרבות, גירוי, פירוק
פתק: ניתן להשתמש בשיטה זו עם סוגי תאים רבים. כדי להמחיש את השיטה, מתואר דוגמא באמצעות תאי אנדותל יפתור (HUVECs).
<ol><li>תרבות HUVECs על מצופים ג'לטין, צלחות פטרי 10 ס מ בינוני הבזליים תא אנדותל עם תוספי המתאים (ראה טבלה של חומרים), ומכילה גם 5% FCS, גורם הגדי?...

<ol>
	<li>O'Neill, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isoelectric+focusing+technology+quantifies+protein+signaling+in+25+cells.">Isoelectric focusing technology quantifies protein signaling in 25 cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (44), 16153-16158 (2006).</li><li>Aspinall-O'Dea, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody-based+detection+of+protein+phosphorylation+status+to+track+the+efficacy+of+novel+therapies+using+nanogram+protein+quantities+from+stem+cells+and+cell+lines.">Antibody-based detection of protein phosphorylation status to track the efficacy of novel therapies using nanogram protein quantities from stem cells and cell lines.</a> Nat Protoc. 10 (1), 149-168 (2015).</li><li>Fan, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanofluidic+proteomic+assay+for+serial+analysis+of+oncoprotein+activation+in+clinical+specimens.">Nanofluidic proteomic assay for serial analysis of oncoprotein activation in clinical specimens.</a> Nat Med. 15 (5), 566-571 (2009).</li><li>Padhan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+sensitivity+isoelectric+focusing+to+establish+a+signaling+biomarker+for+the+diagnosis+of+human+colorectal+cancer.">High sensitivity isoelectric focusing to establish a signaling biomarker for the diagnosis of human colorectal cancer.</a> BMC Cancer. 16 (1), 683 (2016).</li><li>Sun, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGFR2+induces+c-Src+signaling+and+vascular+permeability+in+vivo+via+the+adaptor+protein+TSAd.">VEGFR2 induces c-Src signaling and vascular permeability in vivo via the adaptor protein TSAd.</a> J Exp Med. 209 (7), 1363-1377 (2012).</li><li>Iacovides, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+quantification+of+AKT+isoforms+and+phosphoforms+in+breast+cancer+using+a+novel+nanofluidic+immunoassay.">Identification and quantification of AKT isoforms and phosphoforms in breast cancer using a novel nanofluidic immunoassay.</a> Mol Cell Proteomics. 12 (11), 3210-3220 (2013).</li><li>Price, F. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+JAK-STAT+signaling+stimulates+adult+satellite+cell+function.">Inhibition of JAK-STAT signaling stimulates adult satellite cell function.</a> Nat Med. 20 (10), 1174-1181 (2014).</li><li>Unger, F. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoproteomic+analysis+of+ischemia-dependent+changes+in+signaling+protein+phosphorylation+in+colorectal+normal+and+cancer+tissue.">Nanoproteomic analysis of ischemia-dependent changes in signaling protein phosphorylation in colorectal normal and cancer tissue.</a> J Transl Med. 14, 6 (2016).</li><li>Urasaki, Y., Pizzorno, G., Le, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+uridine+administration+induces+fatty+liver+and+pre-diabetic+conditions+in+mice.">Chronic uridine administration induces fatty liver and pre-diabetic conditions in mice.</a> PLoS One. 11 (1), e0146994 (2016).</li><li>Schmidt, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Case-specific+potentiation+of+glioblastoma+drugs+by+pterostilbene.">Case-specific potentiation of glioblastoma drugs by pterostilbene.</a> Oncotarget. 7 (45), 73200-73215 (2016).</li></ol>

רגישות ורזולוציה של חלבונים מכריעים לחקר פרוטיאומיה מבנית דגימות ביולוגיות. יש ערך רב להיות מסוגלים לזהות חלבונים אשר נמצאים בכמויות דקה בתאים. cIEF יכולים להציע שיפור רגישות ורזולוציה לאיתור חלבונים ושלהם איזופורמים4.
טכנולוגיה זו שימש בהצלחה ב רבים פרוטיאומי...

התמקדות לגירויי כאב נימי (cIEF) היא מתכלה אוטומטיות, המבוססים על נימי הפותר חלבונים על בסיס שלהם תשלום1,2,3. זה מאוד לשחזור ובעל יכולת לפתרון חלבונים ו שלהם איזופורמים ששונה post-translationally במהירות, באופן כמותי. הוא מציג אלטרנטיבה שיטות קונבנציונליות כמו סופג המערבי. בעוד סופג המערבי הוא טוב מאוד עבור המאשרים את נוכחותם של חלבונים בשפע בדגימות נגיש; השתנות זמן הצריכה, כימות מדויק הנוכחי אתגרים, בפרט כאשר בחינת דגימות רקמה ביולוגית. אכן, השתנות זו בעיה פנימית ב סופג המערבי, שכן ישנם שלבים רבים מעורבים, כגון טעינת וריצה של ג'ל מרחביות-דף, העברה של חלבונים על גבי קרום, דגירה עם חומרים כימיים שונים (למשל., יסודי ותיכון נוגדנים, ECL), ופיתוח על גבי סרט צילום רנטגן4. עד מהרה, בטכניקה blotting המערבי משתפרת מימוש הקלטה דיגיטלי של אותות chemiluminescent (מערבונים דיגיטלי) לאחרונה, מערכת אוטומטית blotting המערבי פותחה, כלומר את נימי המערבי, אשר הוא יותר דיבורית ג'ל ללא מערכת. וזמינותו כולה היא אוטומטית לאחר הטעינה של צלחת מדגם (דגימות עם ריאגנטים נחוץ כל) לתוך מערכת3,4. הכלי יבצע את כל השלבים כמו הפרדת חלבונים, קיבעון של חלבונים על גבי קיר נימי, נוגדן incubations, שוטף בין שלבים שונים, ופיתוח כימות של הסימנים chemiluminescent. לפיכך, ההליך cIEF המובאת כאן מספק רזולוציה גבוהה ורגישות.
שיטה זו היא רגישה, ככל אותות יכול להיות שנוצר לכמת מן picograms של חלבונים1. רגישות גבוהה עם הפארמצבטית מעולה עושה את הטכנולוגיה הזו מאוד שימושי עבור ניתוח הקליני דגימות. זה יכול לזהות כמו גם להבחין בין שינוי translational פוסט (למשל, חלבונים phosphorylated שונים איזופורמים) של חלבונים. טכנולוגיה זו שימש בהצלחה לנתח שונים איתות המסלולים4,5 במחקרים קליניים במטרה לפתח הרפוי חדש בסרטן3, והיא בעלת פוטנציאל גדול עבור גילוי התרופות, סמן חלבון .

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="920">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:367px;">NanoPro 1000</td>
			<td style="width:107px;">ProteinSimple</td>
			<td style="width:301px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Premix G2, pH 5&#8211;8 (nested) separation gradient, pH 2&#8211;4 plug</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-972</td>
			<td>Ampholyte premix</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DMSO inhibitor mix</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-510</td>
			<td>Phosphatase inhibitors; for cIEF 1:50 dilution used</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Aqueous Inhibitor Mix</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-482</td>
			<td>Protease inhibitor; for cIEF 1:25 dilution used</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">pI standard ladder 3</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-646</td>
			<td>For cIEF 1:60 dilution used</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sample diluent</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-649</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Antibody diluent&#160;</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Wash concentrate</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>041-108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Anolyte Refill</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Catholyte Refill</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-338</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Peroxide XDR</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>041-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Luminol</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Bicine/CHAPS Lysis Buffer</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Capillaries-Charge Separation (1 pack) for&#160;</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>CBS700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Assay Plate/Lid Kit</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Peroxidase-AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)&#160;</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch&#160;</td>
			<td>711-035-152</td>
			<td>For cIEF used (1: 300)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Peroxidase-AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)&#160;</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch&#160;</td>
			<td>715-035-150</td>
			<td>For cIEF used (1: 300)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Phospho-Erk 1/2 Primary Antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9101</td>
			<td>For cIEF used (1: 50)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Pan Erk Primary Antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9102</td>
			<td>For cIEF used (1: 100)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Compass software</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">HUVEC</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>PCS-100-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MV2 (EBM-2)</td>
			<td>PromoCell</td>
			<td>&#160;C-22221</td>
			<td>Endothelia cell basal medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Endothelial Cell Growth Medium MV2 SupplementPack</td>
			<td>PromoCell</td>
			<td>C-39221</td>
			<td>Supplementation to MV2 above</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">VEGFA</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Long R3 IGF</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>85580C/I1146</td>
			<td>Insulin-like growth factor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bioruptor (Sonicator)</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>B01020001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BCA Protein Assay kit&#160;</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>NP0322BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NuPAG MOPS SDS Running Buffer (20X)</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>NP0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NuPAGE Transfer Buffer (20X)</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>NP0006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Immobilon PVDF membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microfuge tube vortexer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Microtiter plate adapter for centrifuge</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Pipettors&#160;</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Tips</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Ice</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

highly sensitive and quantitative detection of proteins and their isoforms by capillary isoelectric focusing method

Immunoblotting הפך להיות טכניקה שיגרתי במעבדות רבות עבור חלבון איפיון מ דגימות ביולוגיות. פרוטוקול הבאים מספק אסטרטגיית חלופיים, נימי לגירויי כאב תוך התמקדות (cIEF), עם יתרונות רבים בהשוואה ל- immunoblotting קונבנציונלי. זוהי שיטה נוגדן מבוססי אוטומטית, מהירה, כמותי שבו הליך שלם blotting המערבי מתקיים בתוך נימי ודק במיוחד. טכניקה זו לא דורשים ג'ל כדי להעביר קרום, בנוכחות אחר של שהכלים, או סרטים, אשר נדרשים בדרך כלל עבור immunoblotting קונבנציונלי רנטגן. כאן, החלבונים מופרדים לפי תשלום שלהם (נקודה איזואלקטרית; pI), שימוש פחות microliter (400 nL) סה כ החלבון lysate. לאחר אלקטרופורזה, חלבונים הם ותשמרו על גבי קירות נימי על ידי טיפול אור אולטרה סגול, ואחריו ראשיים ומשניים (חזרת peroxidase (HRP) מצומדת) נוגדן דגירה, שאת איגודו מתגלה דרך משופרת chemiluminescence (ECL), יצירת אות אור שניתן שנתפסו או נרשם על ידי מצלמה תשלום מצמידים מכשיר (CCD). התמונה הדיגיטלי ניתן לנתח, לכמת (אזור הפסגה) באמצעות תוכנה. הליך תפוקה גבוהה יכול להתמודד עם דגימות 96 בכל פעם; היא רגישה מאוד, עם זיהוי חלבון בטווח picogram; מפיק תוצאות מאוד לשחזור בגלל אוטומציה. כל ההיבטים האלה יקרים מאוד, כאשר הכמות של דגימות (למשל, דגימות רקמה, ביופסיות) הוא גורם מגביל. הטכניקה יש יישומים רחב יותר, כולל הקרנה של סמים או נוגדנים, גילוי סמן למטרות אבחון.

עיצוב של assay חדש: פריסה של צלחת assay מוצג איור 1A. מקסימאלית, ניתן להשתמש בארות 96 מהצלחת 384-טוב בבלוקים של בארות 12 עבור כל תנאי (נוגדן). כל בלוק של בארות 12 יכול להתחיל A1-A12 או A13-A24. צבע מקודד שורות לאפשר אחד להבחין בין דוגמאות או ריאגנטים אחד מהשני. בתבנית ...

Watch this Scientific Journal Video about Highly Sensitive and Quantitative Detection of Proteins and Their Isoforms by Capillary Isoelectric Focusing Method at JoVE.com

Highly Sensitive and Quantitative Detection of Proteins and Their Isoforms by Capillary Isoelectric Focusing Method

התמקדות לגירויי כאב נימי הוא שיטת התפוקה נוגדן מבוסס, העדינה, גבוהה, המאפשרת אפיון מפורט של חלבונים ו שלהם איזופורמים של דגימות ביולוגיות קטן מאוד. להלן מתאר פרוטוקול זיהוי, כימות של חלבונים ספציפיים, איזופורמים שלהם באופן אוטומטי ו- robotized.

זיהוי רגיש מאוד, כמותית של חלבונים ושל שלהם איזופורמים בשיטה התמקדות לגירויי כאב נימי

Immunoblotting has become a routine technique in many laboratories for protein characterization from biological samples. The following protocol provides ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום המחקר הביו-רפואי, כגון גילוי סמן ביולוגי, גילוי תרופות, אבחון, הקרנה של תרופות או נוגדנים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שזה תפוקה גבוהה והוא יכול לזהות isoforms חלבון בצורה מאוד להתרבות. ההשלכות של טכניקה זו להרחיב לקראת אבחנה של מחלות רבות כי זה יכול למדוד חלבונים מושפעים או isoforms שלהם.למרות שיטה זו יכולה לספק תובנה לתוך מסלולים איתות התא, זה יכול להיות מיושם גם על מערכות אחרות שבהן חלבונים ספציפיים צריכים להיות מנותחים. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית כמו צעדי בדיקה קשה ללמוד בגלל הטריקים, כגון הסרת בועות, טעינת הצלחת, וכו '. ראשית, להכין תערובת diluent מדגם על ידי הוספת microliter אחד של תערובת מעכבי DMSO ושני microliters של מעכבי פרוטאז ל 47 microliters של דלואנט מדגם, כך הריכוז הסופי של מעכבי DMSO ופרוטאז הוא אחד X.Dilute ליאזטים חלבון מבודד בעבר באמצעות תערובת דלורנט מדגם כדי להשיג את הריכוזים הרצויים.לאחר מכן, להוסיף 3.325 microliters של סולם סטנדרטי, שישה microliters של מעכבי פרוטאז, ושלושה microliters של מעכבי DMSO ל 137.675 microliters של premix אנתוליטי. מערבולת המדגם לפחות 15 שניות ולשמור על קרח. מערבבים את שני הפתרונות המוכנים ביחס של אחד עד שלושה כך שהריכוזים הסופיים של מעכבי הפרוטאז של DMSO והסולם הסטנדרטי של הנקודה האיסואלקטרית הם X אחד וחלבונים בנימים מגיעים לריכוזים הרצויים הסופיים.לאחר הוספת החלבונים לתערובת המדגם, כל השלבים יבוצעו על קרח או בארבע מעלות צלזיוס. מניחים צלחת 384 באר על קרח. לטעון עשרה microliters של תערובת המדגם לתוך באר המתאימה של הלוח, על פי פריסת תבנית הבדיקה תוכנן עם תוכנת מערכת סופג מערבית אוטומטית.לאחר מכן, לדלל את הנוגדנים העיקריים והמשניים עם דילול נוגדנים. לאחר מכן, פיפטה עשרה מיקרוליטרים של נוגדנים ראשוניים ו -15 מיקרוליטרים של נוגדנים משניים לתוך כל באר. לאחר מכן, מערבבים לומינול ו- XDR של חמצן ביחס של אחד לאחד.פיפטה 15 מיקרוליטרים של תערובת מי חמצן luminol לתוך כל באר. לאחר הדגימות ואת reagants נוספו לצלחת, צנטריפוגה במשך עשר דקות ב 2500 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס כדי לסובב את הנוזל ולהסיר את הבועות. אם בועות עדיין קיימות, הסר אותן ידנית באמצעות קצה פיפטה דק.פתח את תוכנת מערכת הכתמים המערבית האוטומטית ולחץ על חדש'מתפריט הקובץ. עבור אל חלונית הפריסה והקצה מיקומים עבור רייגן ודוגמאות בצלחת 384 הבאר. בצע משימת רייגן על ידי לחיצה על באר בכל מקום בבלוק.בחר בלוק שורה של 12 בארות כל אחת. לאחר מכן, עבור אל סרגל הכלים של חלונית הפריסה והוסף בלוק שורה לדוגמה, ראשי, משני או זוהר. עבור אל חלונית הפרוטוקול ובחר מיקום רייגן בצלחת.לאחר מכן, לחץ על התא בעמודה לדוגמה ובחר את ה- reagant מהתפריט הנפתח. באותו אופן, בחר את מיקומי רייגן עבור הראשי, משני, ו luminol עבור כל מחזור. לחץ על התאים בזה אחר זה בעמודת הנוגדנים הראשית או המשנית ושנה את זמני הדגירה במידת הצורך.לאחר מכן, הוסף מחזורים על-ידי לחיצה על לחצן הוסף במקטע פרוטוקול. בחלונית התבניות, הזן מידע הנוגע לדגימה, כגון זהות הנוגדנים הראשיים והמשניים, מספרי הקטלוג והדילולים שלהם. שמור את קובץ ההקשה החדש.לפני שתלחץ על לחצן התחל,בדוק במהירות את הפריסה כדי לוודא שהכל נכון. כעת, לחץ על התחל כדי להתחיל בהפעלה. התוכנה תנחה את המשתמש להסיר את הפסולת, כדי למילוי מחדש את המים ואת תיבת נימי, להוסיף אנוליט ו catholite למגש המשאבים, להוסיף חיץ לשטוף, כדי לטעון את הצלחת לתוך מגש מדגם מקורר.שורת מצב של כלי נגינה תוצג על מסך המחשב מספר דקות לאחר תחילת הריצה. לחץ על מסך סיכום הריצה כדי לראות את החלוניות של המצב וההפרדה. כדי לבחון את הפרדת האלקטרופורזה נימי, הפעל את סרט ההפרדה עבור נימי זה על ידי לחיצה על המחזור הרצוי ולאחר מכן לחיצה על כפתור ההפעלה בלוח הבקרה.פתח את קובץ הריצה ובחר את כרטיסיית מסך הניתוח. לחץ על ערוך ולאחר מכן על ניתוח'כדי לשנות את טווח הנקודות האיסואלקטרי. החל את תקן הנקודה האיסואלקטרית המתאים.הוסף התאמה שיא והוסף שם שיא. לבסוף, בחר את הנתונים לשימוש בכרטיסיה פסגות וייצא את הנתונים לניתוח נוסף. האלקטרופרוגרמה של קינאזות מווסתות אותות חוץ-תאיים זרחניים מגורם הגדילה ה אנדותל כלי הדם מגורה ליאזטים מוצג כאן.יש אינדוקציה גבוהה מאוד של חלבונים זרחניים שנצפו עם גורם גדילה אנדותל כלי דם. ההסטה מציגה את בקרת הטעינה הא אנדוגנית, HSP 70, המציינת טעינה דומה של דגימות עבור דגימות לא מטופלות ומטופלות. באימונובלו קונבנציונלי, זוהו רק שתי רצועות, למרות חלבוני קינאז חוץ-תאיים מווסתים בזרחן נפתרו לארבע פסגות על ידי ניתוח התמקדות איסואלקטרי נימי.האלקטרופרוגרמה של קינאזות מווסתות אותות חוץ-תאיים מגורם הגדילה ה אנדותל כלי הדם מגורה ליאזטים מוצג כאן. ה- Inset מציג את אותו פקד טעינה המשמש במקביל. אימונובלו קונבנציונלי מראה רק שתי רצועות המתאימות לקינאז מווסת אותות חוץ-תאיים אחד וקינאז מווסת אותות חוץ-תאיים 2.בעוד שעם ההתמקדות האיסואלקטרית נימית, חלבוני הקינאז המווסתים על-ידי אותות חוץ-תאיים נפתרו לשש פסגות, בהתאם לכל ארבע הפסגות השונות עם זרחן ושתי פסגות לא זרחיות. לאחר השליטה, טכניקה זו יכולה להיעשות בעוד כמה שעות, בהתאם למספר המחזורים, אם היא מבוצעת כראוי. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להשתמש בריכוזי נוגדנים גבוהים יותר בהשוואה לאימונובלוצים קונבנציונליים.הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית כמו צעדי בדיקה קשה ללמוד בגלל טריקים, כגון הסרת בועות, טעינת הצלחת, וכו '. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה צריך הבנה טובה של איך לעצב חקירה, להכין דגימות, להפעיל את ההתזה, ולנתח את הנתונים כדי לבחון isoforms שונים של החלבון שלך.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Highly Sensitive and Rapid Fluorescence Detection with a Portable FRET Analyzer

רגיש מאוד מהיר קרינת איתור עם Analyzer Portable סריג

Recent improvements in F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) sensors have enabled their use to detect various small molecules including ions and ...

An Efficient Method for the Isolation of Highly Purified RNA from Seeds for Use in Quantitative Transcriptome Analysis

שיטה יעילה עבור הבידוד של רנ&quot;א מאוד מטוהר מזרעים לשימוש ב כמוני transcriptome ניתוח

Plant seeds accumulate large amounts of storage reserves comprising biodegradable organic matter. Humans rely on seed storage reserves for food and as ...

Capillary Electrophoresis Separation of Monoclonal Antibody Isoforms Using a Neutral Capillary

הפרדת אלקטרופורזה הנימים של חד השבטי הנוגדן isoforms באמצעות נימי Neutral

Biotherapeutic proteins, such as monoclonal antibodies (mAbs), are feasible alternatives for the treatment of chronic-degenerative diseases. The ...

Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

השיטה לחזות ולנתח חלבוני אינטראקצית ממברנה ידי הילוכים מיקרוסקופים אלקטרונים

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

Formation of Covalent DNA Adducts by Enzymatically Activated Carcinogens and Drugs In Vitro and Their Determination by 32P-postlabeling

Formation of Covalent DNA Adducts by Enzymatically Activated Carcinogens and Drugs In Vitro and Their Determination by 32P-postlabeling

היווצרות קשרי ערכיות דנ א Adducts על ידי חומרים מסרטנים Enzymatically מופעל, סמים במבחנה ונחישות שלהם על ידי 32P-postlabeling

Covalent DNA adducts formed by chemicals or drugs with carcinogenic potency are judged as one of the most important factors in the initiation phase of ...

Detection of Detergent-sensitive Interactions Between Membrane Proteins

זיהוי של דטרגנט רגיש אינטראקציות בין חלבונים ממברנה

Our ability to explore protein-protein interactions is the key to understanding regulatory connections in the cell. However, detection of protein-protein ...

Quantitative and Qualitative Method for Sphingomyelin by LC-MS Using Two Stable Isotopically Labeled Sphingomyelin Species

שיטת ואיכותני ספינגומיילין מאת LC-MS באמצעות שני אורווה Isotopically שכותרתו מינים ספינגומיילין

We present a method of analyzing sphingomyelin (SM) qualitatively and quantitatively by liquid chromatography-electrospray Ionization-tandem mass ...

Analysis of AtHIRD11 Intrinsic Disorder and Binding Towards Metal Ions by Capillary Gel Electrophoresis and Affinity Capillary Electrophoresis

ניתוח של הפרעה פנימית AtHIRD11 ואיגוד לקראת יוני מתכת על ידי נימי אלקטרופורזה בג'ל אלקטרופורזה נימי זיקה

Plants are strongly dependent on their environment. In order to adjust to stressful changes (e.g., drought and high salinity), higher plants evolve ...

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

זיהוי של Heterodimerization של חלבון איזופורמים שימוש בחיי עיר הקרבה מצדו Assay

Regulated protein-protein interactions are a guiding principle for many signaling events, and the detection of such events is an important element in ...

Use of Recombinant Fusion Proteins in a Fluorescent Protease Assay Platform and Their In-gel Renaturation

השימוש פיוז'ן רקומביננטי חלבונים פלטפורמה Assay פרוטאז פלורסנט, Renaturation שלהם בג'ל

Proteases are intensively studied enzymes due to their essential roles in several biological pathways of living organisms and in pathogenesis; therefore, ...