Name: highly sensitive and quantitative detection of proteins and their isoforms by capillary isoelectric focusing method
Uploaded: 2018-09-19T12:30:00
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लेखक धंयवाद प्रो लीना क्लैसन-वेल्श, उपसाला विश्वविद्यालय, इस परियोजना के विकास के लिए उसके समर्थन के लिए स्वीडन । इसके अतिरिक्त, लेखक धंयवाद रॉस स्मिथ और लीना क्लैसन-वेल्श, उपसाला विश्वविद्यालय उनके महत्वपूर्ण पढ़ने और सुझावों के लिए पांडुलिपि में सुधार के लिए ।

1. सेल संस्कृति, उत्तेजना, और Lysis
नोट: यह विधि कई कक्ष प्रकारों के साथ उपयोग किया जा सकता है । विधि को समझाने के लिए, एक उदाहरण मानव गर्भनाल नस endothelial कोशिकाओं (HUVECs) का उपयोग कर वर्णन किया गया है ।
<ol><li>सं...

<ol>
	<li>O'Neill, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isoelectric+focusing+technology+quantifies+protein+signaling+in+25+cells.">Isoelectric focusing technology quantifies protein signaling in 25 cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (44), 16153-16158 (2006).</li><li>Aspinall-O'Dea, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody-based+detection+of+protein+phosphorylation+status+to+track+the+efficacy+of+novel+therapies+using+nanogram+protein+quantities+from+stem+cells+and+cell+lines.">Antibody-based detection of protein phosphorylation status to track the efficacy of novel therapies using nanogram protein quantities from stem cells and cell lines.</a> Nat Protoc. 10 (1), 149-168 (2015).</li><li>Fan, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanofluidic+proteomic+assay+for+serial+analysis+of+oncoprotein+activation+in+clinical+specimens.">Nanofluidic proteomic assay for serial analysis of oncoprotein activation in clinical specimens.</a> Nat Med. 15 (5), 566-571 (2009).</li><li>Padhan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+sensitivity+isoelectric+focusing+to+establish+a+signaling+biomarker+for+the+diagnosis+of+human+colorectal+cancer.">High sensitivity isoelectric focusing to establish a signaling biomarker for the diagnosis of human colorectal cancer.</a> BMC Cancer. 16 (1), 683 (2016).</li><li>Sun, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGFR2+induces+c-Src+signaling+and+vascular+permeability+in+vivo+via+the+adaptor+protein+TSAd.">VEGFR2 induces c-Src signaling and vascular permeability in vivo via the adaptor protein TSAd.</a> J Exp Med. 209 (7), 1363-1377 (2012).</li><li>Iacovides, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+quantification+of+AKT+isoforms+and+phosphoforms+in+breast+cancer+using+a+novel+nanofluidic+immunoassay.">Identification and quantification of AKT isoforms and phosphoforms in breast cancer using a novel nanofluidic immunoassay.</a> Mol Cell Proteomics. 12 (11), 3210-3220 (2013).</li><li>Price, F. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+JAK-STAT+signaling+stimulates+adult+satellite+cell+function.">Inhibition of JAK-STAT signaling stimulates adult satellite cell function.</a> Nat Med. 20 (10), 1174-1181 (2014).</li><li>Unger, F. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoproteomic+analysis+of+ischemia-dependent+changes+in+signaling+protein+phosphorylation+in+colorectal+normal+and+cancer+tissue.">Nanoproteomic analysis of ischemia-dependent changes in signaling protein phosphorylation in colorectal normal and cancer tissue.</a> J Transl Med. 14, 6 (2016).</li><li>Urasaki, Y., Pizzorno, G., Le, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+uridine+administration+induces+fatty+liver+and+pre-diabetic+conditions+in+mice.">Chronic uridine administration induces fatty liver and pre-diabetic conditions in mice.</a> PLoS One. 11 (1), e0146994 (2016).</li><li>Schmidt, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Case-specific+potentiation+of+glioblastoma+drugs+by+pterostilbene.">Case-specific potentiation of glioblastoma drugs by pterostilbene.</a> Oncotarget. 7 (45), 73200-73215 (2016).</li></ol>

संवेदनशीलता और प्रोटीन के संकल्प जैविक नमूनों पर proteomic अनुसंधान के लिए महत्वपूर्ण हैं । वहां महान मूल्य में प्रोटीन जो कोशिकाओं में मिनट मात्रा में मौजूद है का पता लगाने में सक्षम किया जा रहा है । cIEF प्रो...

केशिका isoelectric (cIEF) एक स्वचालित, केशिका आधारित immunoassay है जो अपने चार्ज1,2,3के आधार पर प्रोटीन को हल करता है । यह अत्यधिक reproducible और प्रोटीन का समाधान करने में सक्षम है और उनके पद-अनुवाद संशोधित isoforms तेजी से और मात्रात्मक । यह पश्चिमी सोख्ता के रूप में पारंपरिक तरीकों के लिए एक विकल्प प्रस्तुत करता है । जबकि पश्चिमी सोख्ता आसानी से सुलभ नमूनों में प्रचुर मात्रा में प्रोटीन की उपस्थिति की पुष्टि करने के लिए बहुत अच्छा है; परिवर्तनशीलता, समय की खपत, और सटीक quantitation सभी वर्तमान चुनौतियों, विशेष रूप से जब जैविक ऊतक नमूनों की जांच । वास्तव में, परिवर्तनशीलता पश्चिमी सोख्ता में एक अंतर्निहित समस्या है, के रूप में वहाँ कई कदम शामिल हैं, इस तरह के लोड हो रहा है और एसडीएस के चलने के रूप में-पृष्ठ जैल, झिल्ली पर प्रोटीन का हस्तांतरण, विभिन्न रिएजेंट के साथ मशीन (जैसे, प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी, ECL), और विकास पर एक्स-रे फिल्म4. वर्तमान में, पश्चिमी सोख्ता तकनीक chemiluminescent संकेतों (डिजिटल पश्चिमी) के डिजिटल रिकॉर्डिंग के कार्यांवयन के साथ सुधार है । हाल ही में, एक स्वचालित पश्चिमी सोख्ता प्रणाली विकसित की गई है, अर्थात् केशिका पश्चिमी, जो एक अधिक हाथों से मुक्त और जेल मुक्त प्रणाली है । पूरे परख एक नमूना प्लेट की लोडिंग प्रणाली3,4में सभी आवश्यक रिएजेंट के साथ (नमूने) के बाद स्वचालित है । साधन प्रोटीन जुदाई के रूप में सभी कदम प्रदर्शन करेंगे, केशिका दीवार पर प्रोटीन के स्थिरीकरण, एंटीबॉडी की मशीन, विभिन्न चरणों के बीच बहाकर, और विकास और chemiluminescent संकेतों के ठहराव. इस प्रकार, cIEF प्रक्रिया यहां प्रस्तुत उच्च संकल्प और संवेदनशीलता प्रदान करता है ।
इस विधि संवेदनशील है, के रूप में संकेत उत्पन्न किया जा सकता है और प्रोटीन की picograms से quantified1. उत्कृष्ट reproducibility के साथ उच्च संवेदनशीलता इस प्रौद्योगिकी बहुत नैदानिक नमूनों के विश्लेषण के लिए उपयोगी बनाता है । यह पता लगाने के साथ ही पोस्ट शोधों संशोधन (जैसे, प्रोटीन के विभिंन phosphorylated प्रोटीन isoforms) भेद कर सकते हैं । इस तकनीक को सफलतापूर्वक कैंसर3में नए चिकित्सकीय विकसित करने के लिए लक्ष्य नैदानिक अध्ययन में अलग संकेतन रास्ते4,5 काटना करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, और यह प्रोटीन के लिए महान क्षमता है, और दवा की खोज .

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="920">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:367px;">NanoPro 1000</td>
			<td style="width:107px;">ProteinSimple</td>
			<td style="width:301px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Premix G2, pH 5&#8211;8 (nested) separation gradient, pH 2&#8211;4 plug</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-972</td>
			<td>Ampholyte premix</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DMSO inhibitor mix</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-510</td>
			<td>Phosphatase inhibitors; for cIEF 1:50 dilution used</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Aqueous Inhibitor Mix</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-482</td>
			<td>Protease inhibitor; for cIEF 1:25 dilution used</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">pI standard ladder 3</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-646</td>
			<td>For cIEF 1:60 dilution used</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sample diluent</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-649</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Antibody diluent&#160;</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Wash concentrate</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>041-108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Anolyte Refill</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Catholyte Refill</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-338</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Peroxide XDR</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>041-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Luminol</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Bicine/CHAPS Lysis Buffer</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Capillaries-Charge Separation (1 pack) for&#160;</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>CBS700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Assay Plate/Lid Kit</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Peroxidase-AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)&#160;</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch&#160;</td>
			<td>711-035-152</td>
			<td>For cIEF used (1: 300)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Peroxidase-AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)&#160;</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch&#160;</td>
			<td>715-035-150</td>
			<td>For cIEF used (1: 300)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Phospho-Erk 1/2 Primary Antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9101</td>
			<td>For cIEF used (1: 50)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Pan Erk Primary Antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9102</td>
			<td>For cIEF used (1: 100)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Compass software</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">HUVEC</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>PCS-100-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MV2 (EBM-2)</td>
			<td>PromoCell</td>
			<td>&#160;C-22221</td>
			<td>Endothelia cell basal medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Endothelial Cell Growth Medium MV2 SupplementPack</td>
			<td>PromoCell</td>
			<td>C-39221</td>
			<td>Supplementation to MV2 above</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">VEGFA</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Long R3 IGF</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>85580C/I1146</td>
			<td>Insulin-like growth factor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bioruptor (Sonicator)</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>B01020001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BCA Protein Assay kit&#160;</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>NP0322BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NuPAG MOPS SDS Running Buffer (20X)</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>NP0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NuPAGE Transfer Buffer (20X)</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>NP0006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Immobilon PVDF membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microfuge tube vortexer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Microtiter plate adapter for centrifuge</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Pipettors&#160;</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Tips</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Ice</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

highly sensitive and quantitative detection of proteins and their isoforms by capillary isoelectric focusing method

Immunoblotting जैविक नमूनों से प्रोटीन लक्षण वर्णन के लिए कई प्रयोगशालाओं में एक नियमित तकनीक बन गया है । निम्नलिखित प्रोटोकॉल एक वैकल्पिक रणनीति प्रदान करता है, केशिका isoelectric ध्यान केंद्रित (cIEF), पारंपरिक immunoblotting की तुलना में कई फायदे के साथ. यह एक एंटीबॉडी आधारित, स्वचालित, तेजी से, और मात्रात्मक विधि जिसमें एक पूरा पश्चिमी सोख्ता प्रक्रिया एक ultrathin केशिका के अंदर जगह लेता है । इस तकनीक को एक झिल्ली में स्थानांतरित करने के लिए जेल की आवश्यकता नहीं है, दाग के अलग करना, या एक्स-रे फिल्मों, जो आम तौर पर पारंपरिक immunoblotting के लिए आवश्यक हैं । यहां, प्रोटीन उनके चार्ज (isoelectric बिंदु; pI), कुल प्रोटीन lysate के एक microliter (४०० nL) से कम का उपयोग कर के अनुसार अलग कर रहे हैं । ट्रो के बाद, प्रोटीन पराबैंगनी प्रकाश उपचार द्वारा केशिका दीवारों पर स्थिर कर रहे हैं, प्राथमिक और माध्यमिक (सहिजन peroxidase (एचआरपी) संयुग्मित) एंटीबॉडी की मशीन, जिसका बंधन बढ़ाया के माध्यम से पता चला है द्वारा पीछा किया chemiluminescence (ECL), एक प्रकाश संकेत है कि कब्जा कर लिया जा सकता है और एक चार्ज युग्मित डिवाइस (सीसीडी) कैमरा द्वारा दर्ज उत्पादन । डिजिटल छवि और विश्लेषण किया जा सकता है quantified (पीक क्षेत्र) सॉफ्टवेयर का उपयोग कर । इस उच्च प्रवाह प्रक्रिया एक समय में ९६ नमूने संभाल कर सकते हैं; अत्यधिक संवेदनशील है, picogram रेंज में प्रोटीन का पता लगाने के साथ; और स्वचालन के कारण अत्यधिक reproducible परिणाम पैदा करता है । इन पहलुओं के सभी अत्यंत मूल्यवान है जब नमूनों की मात्रा (जैसे, ऊतक के नमूनों और बायोप्सी) एक सीमित कारक है । तकनीक व्यापक अनुप्रयोगों के रूप में अच्छी तरह से, दवाओं या एंटीबॉडी, unmarker खोज, और नैदानिक प्रयोजनों के स्क्रीनिंग सहित है ।

एक नई परख के डिजाइन: एक परख प्लेट लेआउट चित्र 1aमें दिखाया गया है । अधिक से अधिक, ९६ कुओं से ३८४ अच्छी तरह से इस्तेमाल किया जा सकता है प्लेट प्रत्येक हालत (एंटीबॉडी) के लिए 12 कु?...

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Highly Sensitive and Quantitative Detection of Proteins and Their Isoforms by Capillary Isoelectric Focusing Method

केशिका isoelectric फोकस एक एंटीबॉडी आधारित, ultrasensitive, उच्च प्रवाह तकनीक है, अत्यंत छोटे जैविक नमूनों से प्रोटीन और उनके isoforms के विस्तृत लक्षण वर्णन को सक्षम करने से । निम्नलिखित एक स्वचालित और रोबोट तरीके से विशिष्ट प्रोटीन और उनके isoforms का पता लगाने और ठहराव के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करता है ।

अत्यधिक संवेदनशील और मात्रात्मक पता लगाने के प्रोटीन और उनके Isoforms द्वारा केशिका Isoelectric ध्यान केंद्रित विधि

Immunoblotting has become a routine technique in many laboratories for protein characterization from biological samples. The following protocol provides ...

यह विधि बायोमार्कर खोज, दवा की खोज, निदान, और दवाओं या एंटीबॉडी की स्क्रीनिंग जैसे बायोमेडिकल अनुसंधान क्षेत्र में महत्वपूर्ण सवालों के जवाब देने में मदद कर सकती है। इस तकनीक का मुख्य लाभ यह है कि यह उच्च थ्रूपुट है और अत्यधिक प्रजनन तरीके से प्रोटीन आइसोफॉर्म का पता लगा सकता है। इस तकनीक के निहितार्थ कई बीमारियों के निदान की ओर विस्तार करते हैं क्योंकि यह प्रभावित प्रोटीन या उनके आइसोफॉर्म को माप सकता है।हालांकि यह विधि सेल-सिग्नलिंग रास्तों में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकती है, इसे अन्य प्रणालियों पर भी लागू किया जा सकता है जहां विशिष्ट प्रोटीन का विश्लेषण करने की आवश्यकता होती है। इस विधि का दृश्य प्रदर्शन महत्वपूर्ण है क्योंकि परख के कदम ों की वजह से सीखना मुश्किल है, जैसे बुलबुले को हटाना, प्लेट लोड करना, एट सेटेरा। सबसे पहले, डीएमएसओ अवरोधक मिश्रण के एक माइक्रोलीटर और प्रोटीज अवरोधकों के दो माइक्रोलीटर को नमूना मंदक के 47 माइक्रोलीटर में जोड़कर एक नमूना पतला मिश्रण तैयार करें, ताकि डीएमएसओ और प्रोटीज़ अवरोधकों की अंतिम सांद्रता वांछित सांद्रता प्राप्त करने के लिए पतला मिश्रण का उपयोग करके पहले से अलग प्रोटीन lysates हो।इसके बाद, मानक सीढ़ी के 3.325 माइक्रोलीटर, प्रोटीज़ अवरोधक के छह माइक्रोलीटर, और डीएमएसओ अवरोधक के तीन माइक्रोलीटर को 137.675 माइक्रोलीटर ें थॉटोलिट प्रीमिक्स में जोड़ें। भंवर नमूना कम से कम 15 सेकंड और बर्फ पर रहते हैं। दो तैयार समाधानों को एक से तीन अनुपात में मिलाएं ताकि डीएमएसओ प्रोटीज अवरोधकों और आइसोइलेक्ट्रिक पॉइंट स्टैंडर्ड सीढ़ी की अंतिम सांद्रता एक एक्स हो और केशिका में प्रोटीन अंतिम वांछित सांद्रता तक पहुंचें।प्रोटीन के नमूना मिश्रण में जोड़े जाने के बाद, सभी चरण बर्फ पर या चार डिग्री सेल्सियस पर किए जाएंगे। बर्फ पर 384-अच्छी प्लेट रखें। स्वचालित पश्चिमी ब्लॉटिंग सिस्टम सॉफ्टवेयर के साथ डिजाइन किए गए परख टेम्पलेट लेआउट के अनुसार, प्लेट के उपयुक्त कुएं में नमूना मिश्रण के दस माइक्रोलीटर लोड करें।इसके बाद, एंटीबॉडी मंद के साथ प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी को पतला करें। फिर, प्रत्येक कुएं में प्राथमिक एंटीबॉडी के दस माइक्रोलीटर और माध्यमिक एंटीबॉडी के 15 माइक्रोलीटर। इसके बाद, एक से एक अनुपात में ल्यूमिनॉल और पेरोक्साइड एक्सडीआर मिलाएं।ल्यूमिनोल पेरोक्साइड के पिपेट 15 माइक्रोलीटर प्रत्येक कुएं में मिश्रण करते हैं। एक बार नमूने और reagants थाली में जोड़ा गया है, २५०० बार जी और चार डिग्री सेल्सियस पर दस मिनट के लिए अपकेंद्रित्र नीचे तरल स्पिन और बुलबुले को दूर करने के लिए । यदि बुलबुले अभी भी मौजूद हैं, तो उन्हें एक पतली पिपेट टिप का उपयोग करके मैन्युअल रूप से हटा दें।स्वचालित पश्चिमी ब्लॉटिंग सिस्टम सॉफ्टवेयर खोलें और फ़ाइल मेनू से नए पर क्लिक करें। लेआउट फलक पर जाएं और 384-वेल प्लेट में रीगन्स और नमूनों के लिए स्थान असाइन करें। ब्लॉक में कहीं भी एक कुएं पर क्लिक करके एक रीगन असाइनमेंट बनाएं।प्रत्येक 12 कुओं के एक पंक्ति ब्लॉक का चयन करें । इसके बाद, लेआउट फलक टूल बार में जाएं और एक नमूना, प्राथमिक, माध्यमिक या ल्यूमिनॉल पंक्ति ब्लॉक डालें। प्रोटोकॉल फलक पर जाएं और प्लेट में एक रीगन स्थान का चयन करें।इसके बाद सैंपल कॉलम में सेल पर क्लिक करें और ड्रॉप-डाउन मेन्यू से रीगन्ट का चयन करें। इसी अंदाज में, प्रत्येक चक्र के लिए प्राथमिक, माध्यमिक और ल्यूमिनॉल के लिए रीगन्ट स्थानों का चयन करें। प्राथमिक या माध्यमिक एंटीबॉडी कॉलम में एक समय में कोशिकाओं को क्लिक करें और यदि आवश्यक हो तो इनक्यूबेशन बार बदलें।इसके बाद प्रोटोकॉल सेक्शन में ऐड बटन पर क्लिक करके साइकिल डालें। टेम्पलेट फलक में, नमूने से संबंधित जानकारी दर्ज करें, जैसे प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी की पहचान, उनकी सूची संख्या और कमजोर पड़ने। नई परख फ़ाइल को बचाओ।Start'button पर क्लिक करने से पहले, लेआउट को जल्दी से देखें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि सब कुछ सही है। अब, रन शुरू करने के लिए start'to पर क्लिक करें। सॉफ्टवेयर उपयोगकर्ता को कचरे को हटाने, पानी और केशिका बॉक्स को फिर से भरने, संसाधन ट्रे में एनोलाइट और कैथोलिट जोड़ने, वॉश बफर जोड़ने और प्लेट को ठंडा नमूना ट्रे में लोड करने के लिए संकेत देगा।रन शुरू होने के कुछ मिनट बाद कंप्यूटर स्क्रीन पर एक इंस्ट्रूमेंट स्टेटस बार प्रदर्शित किया जाएगा । स्थिति और जुदाई शीशे देखने के लिए रन सारांश स्क्रीन पर क्लिक करें। एक केशिका में इलेक्ट्रोफोरेसिस जुदाई का निरीक्षण करने के लिए, वांछित चक्र पर क्लिक करके और फिर नियंत्रण कक्ष में प्ले बटन पर क्लिक करके उस केशिका के लिए जुदाई फिल्म खेलते हैं।रन फाइल खोलें और एनालिसिस स्क्रीन टैब चुनें। आइसोइलेक्ट्रिक पॉइंट रेंज को बदलने के लिए एडिट और फिर एनालिसिस पर क्लिक करें। उपयुक्त आइसोइलेक्ट्रिक प्वाइंट मानक लागू करें।एक चोटी फिट जोड़ें, और एक चोटी का नाम जोड़ें। अंत में, चोटियों टैब में उपयोग करने के लिए डेटा का चयन करें और आगे के विश्लेषण के लिए डेटा का निर्यात करें। वैस्कुलर एंडोथेलियल ग्रोथ-फैक्टर उत्तेजित lysates से फॉस्फोरिलेटेड एक्स्ट्रासेलुलर सिग्नल-रेगुलेटेड किनासे का इलेक्ट्रोफेरोग्राम यहां दिखाया गया है।वेस्कुलर एंडोथेलियल ग्रोथ फैक्टर के साथ मनाए जाने वाले फॉस्फोरिलेटेड प्रोटीन का बहुत अधिक प्रेरण होता है। इनसेट अंतर्जात लोडिंग नियंत्रण, एचएसपी 70 को दिखाता है, जो अनुपचारित और उपचारित नमूनों दोनों के लिए नमूनों की समान लोडिंग का संकेत देता है। एक पारंपरिक इम्यूनोब्लॉट में, केवल दो बैंड का पता चला, भले ही फॉस्फोरिलेटेड एक्स्ट्रासेलुलर सिग्नल-विनियमित किनेज़ प्रोटीन को केशिका आइसोइलेक्ट्रिक फोकसिंग विश्लेषण द्वारा चार चोटियों में हल किया गया था।वैस्कुलर एंडोथेलियल ग्रोथ-फैक्टर से एक्सट्रासेलुलर सिग्नल-रेगुलेटेड किनासेस का इलेक्ट्रोफेरोग्राम यहां दिखाया गया है। इनसेट समानांतर में उपयोग किए जाने वाले समान लोडिंग नियंत्रण को दर्शाता है। एक पारंपरिक इम्यूनोब्लॉट केवल दो बैंड को बाहुलीय संकेत-विनियमित काइनेज वन और एक्सट्रासेलुलर सिग्नल-विनियमित किनेज़ दो के अनुरूप दिखाता है।जबकि केशिका आइसोइलेक्ट्रिक फोकसिंग के साथ, एक्सट्रासेलुलर सिग्नल-विनियमित किनेज प्रोटीन को छह चोटियों में हल किया गया था, जो सभी चार अलग-अलग फॉस्फोरिलेटेड चोटियों और दो अन-फॉस्फोरिलेटेड चोटियों के अनुरूप था। एक बार महारत हासिल होने के बाद, इस तकनीक को कुछ घंटों में किया जा सकता है, चक्रों की संख्या के आधार पर, यदि इसे ठीक से किया जाता है। इस प्रक्रिया का प्रयास करते समय, पारंपरिक इम्यूनोब्लॉट्स की तुलना में उच्च एंटीबॉडी सांद्रता का उपयोग करना याद रखना महत्वपूर्ण है।इस विधि का दृश्य प्रदर्शन महत्वपूर्ण है क्योंकि परख चरणों को ट्रिक्स के कारण सीखना मुश्किल है, जैसे बुलबुले को हटाना, प्लेट लोड करना, एट सेटेरा। इस वीडियो को देखने के बाद, आपको इस बात की अच्छी समझ होनी चाहिए कि परख कैसे डिजाइन की जाए, नमूने तैयार करें, परख चलाएं, और अपने प्रोटीन के विभिन्न आइसोफॉर्म का निरीक्षण करने के लिए डेटा का विश्लेषण करें।

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Highly Sensitive and Rapid Fluorescence Detection with a Portable FRET Analyzer

अत्यधिक संवेदनशील और एक पोर्टेबल झल्लाहट विश्लेषक के साथ रैपिड प्रतिदीप्ति पता लगाने

Recent improvements in F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) sensors have enabled their use to detect various small molecules including ions and ...

An Efficient Method for the Isolation of Highly Purified RNA from Seeds for Use in Quantitative Transcriptome Analysis

मात्रात्मक Transcriptome विश्लेषण में उपयोग के लिए बीज से उच्च शुद्ध शाही सेना के अलगाव के लिए एक कारगर तरीका

Plant seeds accumulate large amounts of storage reserves comprising biodegradable organic matter. Humans rely on seed storage reserves for food and as ...

Capillary Electrophoresis Separation of Monoclonal Antibody Isoforms Using a Neutral Capillary

मोनोक्लोनल एंटीबॉडी isoforms की केशिका वैद्युतकणसंचलन पृथक्करण एक तटस्थ केशिका का उपयोग

Biotherapeutic proteins, such as monoclonal antibodies (mAbs), are feasible alternatives for the treatment of chronic-degenerative diseases. The ...

Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

विधि कल्पना और संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा झिल्ली बातचीत प्रोटीन का विश्लेषण करने के लिए

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

Formation of Covalent DNA Adducts by Enzymatically Activated Carcinogens and Drugs In Vitro and Their Determination by 32P-postlabeling

Formation of Covalent DNA Adducts by Enzymatically Activated Carcinogens and Drugs In Vitro and Their Determination by 32P-postlabeling

आबंध डीएनए Adducts के गठन से Enzymatically आपन यलो और ड्रग्स इन विट्रो में और उनके निर्धारण के द्वारा 32पी-postlabeling

Covalent DNA adducts formed by chemicals or drugs with carcinogenic potency are judged as one of the most important factors in the initiation phase of ...

Detection of Detergent-sensitive Interactions Between Membrane Proteins

झिल्ली प्रोटीन के बीच डिटर्जेंट-संवेदनशील बातचीत का पता लगाने

Our ability to explore protein-protein interactions is the key to understanding regulatory connections in the cell. However, detection of protein-protein ...

Quantitative and Qualitative Method for Sphingomyelin by LC-MS Using Two Stable Isotopically Labeled Sphingomyelin Species

नियंत्रण रेखा से Sphingomyelin के लिए मात्रात्मक और गुणात्मक विधि-MS दो स्थिर Isotopically लेबल Sphingomyelin प्रजातियों का उपयोग

We present a method of analyzing sphingomyelin (SM) qualitatively and quantitatively by liquid chromatography-electrospray Ionization-tandem mass ...

Analysis of AtHIRD11 Intrinsic Disorder and Binding Towards Metal Ions by Capillary Gel Electrophoresis and Affinity Capillary Electrophoresis

AtHIRD11 आंतरिक विकार का विश्लेषण और धातु आयनों की ओर बाध्यकारी केशिका जेल ट्रो और अपनत्व केशिका ट्रो

Plants are strongly dependent on their environment. In order to adjust to stressful changes (e.g., drought and high salinity), higher plants evolve ...

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

प्रोटीन Isoforms के Heterodimerization का पता लगाने में एक का उपयोग कर सीटू निकटता बंधाव परख

Regulated protein-protein interactions are a guiding principle for many signaling events, and the detection of such events is an important element in ...

Use of Recombinant Fusion Proteins in a Fluorescent Protease Assay Platform and Their In-gel Renaturation

एक फ्लोरोसेंट चिढ़ा परख मंच में रिकॉमबिनेंट फ्यूजन प्रोटीन का उपयोग करें और उनके जेल Renaturation

Proteases are intensively studied enzymes due to their essential roles in several biological pathways of living organisms and in pathogenesis; therefore, ...