Name: highly sensitive and quantitative detection of proteins and their isoforms by capillary isoelectric focusing method
Uploaded: 2018-09-19T12:30:00
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L'autore ringrazia la Prof. ssa Lena Claesson-Welsh, Università di Uppsala, in Svezia, per il suo sostegno per lo sviluppo di questo progetto. Inoltre, l'autore ringrazia Ross Smith e Lena Claesson-Welsh, Università di Uppsala per la loro lettura critica e suggerimenti per migliorare il manoscritto.

1. cultura, stimolazione e lisi delle cellule
Nota: Questo metodo può essere utilizzato con molti tipi di cellule. Per illustrare il metodo, è descritto un esempio di utilizzo di cellule endoteliali di vena ombelicale umana (HUVECs).
<ol><li>Cultura di HUVECs il rivestite di gelatina, di 10cm Petri in medio basale delle cellule endoteliali con il completamento appropriato (Vedi Tabella materiali) e contenente anche 5% FCS, fattore di crescita epidermico (5 ng/mL), fattore ...

<ol>
	<li>O'Neill, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isoelectric+focusing+technology+quantifies+protein+signaling+in+25+cells.">Isoelectric focusing technology quantifies protein signaling in 25 cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (44), 16153-16158 (2006).</li><li>Aspinall-O'Dea, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody-based+detection+of+protein+phosphorylation+status+to+track+the+efficacy+of+novel+therapies+using+nanogram+protein+quantities+from+stem+cells+and+cell+lines.">Antibody-based detection of protein phosphorylation status to track the efficacy of novel therapies using nanogram protein quantities from stem cells and cell lines.</a> Nat Protoc. 10 (1), 149-168 (2015).</li><li>Fan, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanofluidic+proteomic+assay+for+serial+analysis+of+oncoprotein+activation+in+clinical+specimens.">Nanofluidic proteomic assay for serial analysis of oncoprotein activation in clinical specimens.</a> Nat Med. 15 (5), 566-571 (2009).</li><li>Padhan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+sensitivity+isoelectric+focusing+to+establish+a+signaling+biomarker+for+the+diagnosis+of+human+colorectal+cancer.">High sensitivity isoelectric focusing to establish a signaling biomarker for the diagnosis of human colorectal cancer.</a> BMC Cancer. 16 (1), 683 (2016).</li><li>Sun, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGFR2+induces+c-Src+signaling+and+vascular+permeability+in+vivo+via+the+adaptor+protein+TSAd.">VEGFR2 induces c-Src signaling and vascular permeability in vivo via the adaptor protein TSAd.</a> J Exp Med. 209 (7), 1363-1377 (2012).</li><li>Iacovides, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+quantification+of+AKT+isoforms+and+phosphoforms+in+breast+cancer+using+a+novel+nanofluidic+immunoassay.">Identification and quantification of AKT isoforms and phosphoforms in breast cancer using a novel nanofluidic immunoassay.</a> Mol Cell Proteomics. 12 (11), 3210-3220 (2013).</li><li>Price, F. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+JAK-STAT+signaling+stimulates+adult+satellite+cell+function.">Inhibition of JAK-STAT signaling stimulates adult satellite cell function.</a> Nat Med. 20 (10), 1174-1181 (2014).</li><li>Unger, F. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoproteomic+analysis+of+ischemia-dependent+changes+in+signaling+protein+phosphorylation+in+colorectal+normal+and+cancer+tissue.">Nanoproteomic analysis of ischemia-dependent changes in signaling protein phosphorylation in colorectal normal and cancer tissue.</a> J Transl Med. 14, 6 (2016).</li><li>Urasaki, Y., Pizzorno, G., Le, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+uridine+administration+induces+fatty+liver+and+pre-diabetic+conditions+in+mice.">Chronic uridine administration induces fatty liver and pre-diabetic conditions in mice.</a> PLoS One. 11 (1), e0146994 (2016).</li><li>Schmidt, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Case-specific+potentiation+of+glioblastoma+drugs+by+pterostilbene.">Case-specific potentiation of glioblastoma drugs by pterostilbene.</a> Oncotarget. 7 (45), 73200-73215 (2016).</li></ol>

Sensibilità e risoluzione delle proteine sono fondamentali per la ricerca di proteomica su campioni biologici. C'è grande valore nell'essere in grado di rilevare le proteine che sono presenti in piccole quantità nelle cellule. cIEF in grado di offrire una migliore sensibilità e risoluzione per la rilevazione di proteine e loro isoforme4.
Questa tecnologia è stata utilizzata con successo in molti proteomica research report5,<sup cl...

Messa a fuoco isoelettrica capillare (cIEF) è un test immunologico automatizzato, basato su capillare che risolve le proteine in base al loro costo1,2,3. È altamente riproducibile e in grado di risolvere le proteine e loro isoforme traduzionalmente modificate rapidamente e quantitativamente. Presenta un'alternativa ai metodi convenzionali come macchiare occidentale. Mentre macchiare occidentale è molto buono per confermare la presenza di abbondanti proteine in campioni facilmente accessibili; variabilità, il consumo di tempo e tutti i presenti la quantificazione accurata sfide, in particolare quando si esaminano i campioni di tessuto biologico. Infatti, la variabilità è un problema inerente a macchiarsi occidentale, come ci sono numerosi passi coinvolti, quali caricamento e funzionamento del gel di SDS-PAGE, il trasferimento delle proteine sulla membrana, incubazione con vari reagenti (ad es., primaria e secondaria anticorpi, ECL) e sviluppo sulla pellicola di raggi x4. Attualmente, la tecnica macchiante occidentale sta migliorando con l'implementazione di registrazione digitale dei segnali a chemiluminescenza (Western digital). Recentemente, è stato sviluppato un sistema automatizzato di macchiante occidentale, vale a dire il capillare occidentale, che è un sistema più hands-free e gel-libero. Il dosaggio intero è automatica dopo il caricamento di un piatto di campione (campioni con tutti i reagenti necessari) nel sistema3,4. Lo strumento eseguirà tutti i passaggi come la separazione delle proteine, immobilizzazione di proteine sulla parete capillare, le incubazioni dell'anticorpo, lava tra diverse fasi e sviluppo e quantificazione dei segnali a chemiluminescenza. Così, la procedura cIEF qui presentata fornisce una maggiore risoluzione e sensibilità.
Questo metodo è riservato, come segnali possono essere generati e quantificati da picogrammi di proteine1. L'alta sensibilità con eccellente riproducibilità rende questa tecnologia molto utile per l'analisi di campioni clinici. Può rilevare come pure distinguere post traduzionali (ad es., proteina fosforilata diverse isoforme) delle proteine. Questa tecnologia è stata utilizzata con successo per dissecare diversa segnalazione vie4,5 negli studi clinici con l'obiettivo di sviluppare nuove terapie cancro3, e ha grandi potenzialità per la scoperta di biomarcatori e droga di proteina .

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="920">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:367px;">NanoPro 1000</td>
			<td style="width:107px;">ProteinSimple</td>
			<td style="width:301px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Premix G2, pH 5&#8211;8 (nested) separation gradient, pH 2&#8211;4 plug</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-972</td>
			<td>Ampholyte premix</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DMSO inhibitor mix</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-510</td>
			<td>Phosphatase inhibitors; for cIEF 1:50 dilution used</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Aqueous Inhibitor Mix</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-482</td>
			<td>Protease inhibitor; for cIEF 1:25 dilution used</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">pI standard ladder 3</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-646</td>
			<td>For cIEF 1:60 dilution used</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sample diluent</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-649</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Antibody diluent&#160;</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Wash concentrate</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>041-108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Anolyte Refill</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Catholyte Refill</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-338</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Peroxide XDR</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>041-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Luminol</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Bicine/CHAPS Lysis Buffer</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Capillaries-Charge Separation (1 pack) for&#160;</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>CBS700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Assay Plate/Lid Kit</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Peroxidase-AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)&#160;</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch&#160;</td>
			<td>711-035-152</td>
			<td>For cIEF used (1: 300)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Peroxidase-AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)&#160;</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch&#160;</td>
			<td>715-035-150</td>
			<td>For cIEF used (1: 300)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Phospho-Erk 1/2 Primary Antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9101</td>
			<td>For cIEF used (1: 50)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Pan Erk Primary Antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9102</td>
			<td>For cIEF used (1: 100)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Compass software</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">HUVEC</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>PCS-100-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MV2 (EBM-2)</td>
			<td>PromoCell</td>
			<td>&#160;C-22221</td>
			<td>Endothelia cell basal medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Endothelial Cell Growth Medium MV2 SupplementPack</td>
			<td>PromoCell</td>
			<td>C-39221</td>
			<td>Supplementation to MV2 above</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">VEGFA</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Long R3 IGF</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>85580C/I1146</td>
			<td>Insulin-like growth factor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bioruptor (Sonicator)</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>B01020001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BCA Protein Assay kit&#160;</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>NP0322BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NuPAG MOPS SDS Running Buffer (20X)</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>NP0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NuPAGE Transfer Buffer (20X)</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>NP0006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Immobilon PVDF membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microfuge tube vortexer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Microtiter plate adapter for centrifuge</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Pipettors&#160;</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Tips</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Ice</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

highly sensitive and quantitative detection of proteins and their isoforms by capillary isoelectric focusing method

Immunoblotting è diventata una tecnica di routine in molti laboratori per la caratterizzazione di proteine da campioni biologici. Il seguente protocollo fornisce una strategia alternativa, capillare isoelettrico (cIEF), di messa a fuoco con molti vantaggi rispetto ai convenzionali immunoblotting. Si tratta di un metodo basati su anticorpi, automatico, rapido e quantitativo, in cui una procedura completa di macchiante occidentale si svolge all'interno di un capillare ultrasottile. Questa tecnica non richiede un gel per trasferire ad una membrana, rimozione delle macchie, o pellicole, che sono in genere necessari per immunoblotting convenzionali a raggi x. Qui, le proteine sono separate secondo la loro carica (punto isoelettrico; pI), utilizzando meno di un microlitro (400 nL) di lisato proteico totale. Dopo l'elettroforesi, proteine sono immobilizzate sulle pareti dei capillari di trattamento della luce ultravioletta, seguita da primario e secondario (perossidasi di rafano (HRP) coniugato) incubazione dell'anticorpo, cui l'associazione viene rilevato attraverso funzionalità migliorata chemiluminescenza (ECL), generando un segnale luminoso che può essere catturato e registrato da una telecamera di charge coupled device (CCD). L'immagine digitale può essere analizzato e quantificati (area del picco) utilizzando il software. Questa procedura di throughput elevato può gestire 96 campioni contemporaneamente; è altamente sensibile, con rilevazione di proteine nella gamma picogrammo; e produce risultati altamente riproducibili a causa di automazione. Tutti questi aspetti sono estremamente utili quando la quantità di campioni (ad esempio, campioni di tessuto e biopsie) è un fattore limitante. La tecnica ha anche applicazioni più ampie, tra cui lo screening di farmaci o anticorpi, scoperta del biomarcatore e scopi diagnostici.

Design di un nuovo dosaggio: Un layout di piastra di dosaggio è mostrato in Figura 1A. Al massimo, 96 pozzetti possono essere utilizzati dalla piastra 384 pozzetti in blocchi di 12 pozzi per ogni condizione (anticorpo). Ogni blocco di 12 pozzi può iniziare da A1-A12 o A13-A24. Righe di colore codificate permettono di distinguere i campioni o i reagenti uno da altro. Nel modello di analisi (Figura 1B), le inform...

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Highly Sensitive and Quantitative Detection of Proteins and Their Isoforms by Capillary Isoelectric Focusing Method

Messa a fuoco isoelettrica capillare è una tecnica di basati su anticorpi, ultrasensibile, alta velocità di trasmissione, consentendo la dettagliata caratterizzazione delle proteine e loro isoforme da campioni biologici estremamente piccoli. Di seguito viene descritto un protocollo per il rilevamento e la quantificazione delle proteine specifiche e loro isoforme in modo automatizzato e robotizzato.

Rilevamento altamente sensibile e quantitativo delle proteine e loro isoforme dal metodo di messa a fuoco isoelettrica capillare

Immunoblotting has become a routine technique in many laboratories for protein characterization from biological samples. The following protocol provides ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della ricerca biomedica, come la scoperta di biomarcatori, la scoperta di farmaci, la diagnostica e lo screening di farmaci o anticorpi. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è ad alta produttività e può rilevare isoforme proteiche in modo altamente riproducibile. Le implicazioni di questa tecnica si estendono verso la diagnosi di molte malattie perché può misurare le proteine colpite o le loro isoforme.Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulle vie di segnalazione cellulare, può anche essere applicato ad altri sistemi in cui è necessario analizzare proteine specifiche. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto i passaggi di dosaggio sono difficili da imparare a causa dei trucchi, come rimuovere le bolle, caricare la piastra, eccetera. In primo luogo, preparare una miscela di diluente del campione aggiungendo un microlitro di miscela di inibitori DMSO e due microlitri di inibitori della proteasi a 47 microlitri di diluente del campione, in modo che la concentrazione finale di DMSO e inibitori della proteasi sia una X.Diluire lisati proteici precedentemente isolati utilizzando la miscela diluita del campione per ottenere le concentrazioni desiderate.Successivamente, aggiungere 3.325 microlitri di scala standard, sei microlitri di inibitore della proteasi e tre microlitri di inibitore DMSO a 137.675 microlitri di premix antolite. Vortice il campione almeno 15 secondi e tenere sul ghiaccio. Mescolare le due soluzioni preparate in un rapporto uno a tre in modo che le concentrazioni finali di inibitori della proteasi DMSO e la scala standard del punto isoelettrico siano una X e le proteine nel capillare raggiungano le concentrazioni finali desiderate.Dopo che le proteine sono state aggiunte alla miscela del campione, tutti i passaggi verranno eseguiti sul ghiaccio o a quattro gradi Celsius. Metti un piatto da 384 po 'sul ghiaccio. Caricare dieci microlitri della miscela di campioni nel pozzo appropriato della piastra, secondo il layout del modello di dosaggio progettato con il software automatizzato del sistema di soffiatura occidentale.In seguito, diluire gli anticorpi primari e secondari con diluente anticorpale. Quindi, pipetta dieci microlitri di anticorpi primari e 15 microlitri di anticorpi secondari in ogni pozzo. Quindi, mescolare luminol e perossido XDR in un rapporto uno a uno.Pipetta 15 microlitri del perossido di luminolo si mescolano in ogni pozzo. Una volta aggiunti i campioni e i reagants alla piastra, centrifugare per dieci minuti a 2500 volte G e quattro gradi Celsius per far girare il liquido e rimuovere le bolle. Se le bolle esistono ancora, rimuoverle manualmente utilizzando una punta di pipetta sottile.Aprire il software di sistema di soffiatura occidentale automatico e fare clic su nuovo dal menu file. Vai al riquadro di layout e assegna posizioni per reagants e campioni nella piastra da 384 pozzi. Fai un compito reagant facendo clic su un pozzo in qualsiasi punto del blocco.Selezionare un blocco di riga di 12 pozzi ciascuno. Passare quindi alla barra degli strumenti del riquadro di layout e inserire un blocco di righe di esempio, primario, secondario o luminol. Vai al riquadro del protocollo e seleziona una posizione reagant nel piatto.Quindi, fare clic sulla cella nella colonna di esempio e selezionare il reagant dal menu a discesa. Allo stesso modo, selezionare le posizioni reagant per il primario, secondario e luminol per ogni ciclo. Fare clic sulle cellule una alla volta nella colonna degli anticorpi primari o secondari e, se necessario, modificare i tempi di incubazione.Quindi, aggiungere cicli facendo clic sul pulsante Aggiungi nella sezione del protocollo. Nel riquadro dei modelli immettere le informazioni relative al campione, ad esempio l'identità degli anticorpi primari e secondari, i numeri di catalogo e le diluizioni. Salvare il nuovo file di dosaggio.Prima di fare clic sul pulsante start,controlla rapidamente il layout per assicurarti che tutto sia corretto. A questo punto, fare clic su start' per iniziare l'esecuzione. Il software richiederà all'utente di rimuovere i rifiuti, di riempire l'acqua e la scatola capillare, di aggiungere anolite e catolite al vassoio delle risorse, di aggiungere tampone di lavaggio e di caricare la piastra nel vassoio del campione raffreddato.Una barra di stato dello strumento verrà visualizzata sullo schermo del computer un paio di minuti dopo l'inizio dell'esecuzione. Fare clic nella schermata esegui riepilogo per visualizzare i riquadri di stato e separazione. Per osservare la separazione dell'elettroforesi in un capillare, riprodurre il filmato di separazione per quel capillare facendo clic sul ciclo desiderato e quindi facendo clic sul pulsante di riproduzione nel pannello di controllo.Aprire il file di esecuzione e selezionare la scheda della schermata di analisi. Fare clic su modifica', quindi su analisi', per modificare l'intervallo di punti isoelettrici. Applicare lo standard del punto isoelettrico appropriato.Aggiungere un adattamento di picco e aggiungere un nome di picco. Infine, selezionare i dati da utilizzare nella scheda picchi ed esportare i dati per ulteriori analisi. L'elettroferogramma delle chinasi extracellulari fosforilate regolate dal segnale da lisati stimolati dal fattore di crescita endoteliale vascolare è mostrato qui.C'è un'induzione molto elevata di proteine fosforilate osservate con fattore di crescita endoteliale vascolare. L'inserto mostra il controllo del carico endogeno, HSP 70, che indica un carico simile di campioni sia per campioni non trattati che trattati. In un immunoblot convenzionale, sono state rilevate solo due bande, anche se le proteine della chinasi extracellulare fosforilata regolate dal segnale sono state risolte in quattro picchi mediante analisi di messa a fuoco isoelettrica capillare.L'elettroferogramma delle chinasi extracellulari regolate dal segnale da lisati stimolati dal fattore di crescita endoteliale vascolare è mostrato qui. L'interno mostra lo stesso controllo di caricamento utilizzato in parallelo. Un'immunoblot convenzionale mostra solo due bande corrispondenti alla chinasi extracellulare regolata dal segnale uno e alla chinasi extracellulare regolata dal segnale due.Mentre con la messa a fuoco isoelettrica capillare, le proteine della chinasi extracellulari regolate dal segnale sono state risolte in sei picchi, corrispondenti a tutti e quattro i diversi picchi fosforilati e a due picchi non fosforilati. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in poche ore, a seconda del numero di cicli, se viene eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di utilizzare concentrazioni di anticorpi più elevate rispetto alle immunoblot convenzionali.La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto i passaggi di dosaggio sono difficili da imparare a causa di trucchi, come la rimozione di bolle, il caricamento della piastra, eccetera. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come progettare un saggio, preparare campioni, eseguire il saggio e analizzare i dati per osservare diverse isoforme della tua proteina.

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Analisi di AtHIRD11 intrinseco disordine e l'associazione verso gli ioni del metallo di elettroforesi capillare ed elettroforesi capillare di affinità

Plants are strongly dependent on their environment. In order to adjust to stressful changes (e.g., drought and high salinity), higher plants evolve ...

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Rilevamento di eterodimerizzazione di isoforme della proteina usando un'analisi in Situ vicinanza legatura

Regulated protein-protein interactions are a guiding principle for many signaling events, and the detection of such events is an important element in ...

Use of Recombinant Fusion Proteins in a Fluorescent Protease Assay Platform and Their In-gel Renaturation

Uso delle proteine di fusione ricombinante in una piattaforma di analisi fluorescente proteasi e loro rinaturalizzazione In-gel

Proteases are intensively studied enzymes due to their essential roles in several biological pathways of living organisms and in pathogenesis; therefore, ...