Name: highly sensitive and quantitative detection of proteins and their isoforms by capillary isoelectric focusing method
Uploaded: 2018-09-19T12:30:00
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著者教授レナ クラーソン-ウェールズ、ウプサラ大学、スウェーデンはこのプロジェクトを開発するための彼女のサポートのおかげでください。さらに、著者は、ロス スミスとレナ クラーソン-ウェールズ、ウプサラ大学の重要な読書と原稿を改善する提案をありがちましょう。

1. セルの換散、刺激、文化
注: このメソッドは、多くの細胞のタイプで使用できます。このメソッドを示すためには、ひと臍帯静脈血管内皮細胞 (Huvec) の使用例が説明されています。
<ol><li>文化 10 cm シャーレをゼラチンでコーティングされた、適切な補充と内皮細胞基本培地での比較 (材料の表を参照)、5% の FCS、表皮の成長因子 (5 ng/mL)、血管内皮増殖因?...

<ol>
	<li>O'Neill, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isoelectric+focusing+technology+quantifies+protein+signaling+in+25+cells.">Isoelectric focusing technology quantifies protein signaling in 25 cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (44), 16153-16158 (2006).</li><li>Aspinall-O'Dea, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody-based+detection+of+protein+phosphorylation+status+to+track+the+efficacy+of+novel+therapies+using+nanogram+protein+quantities+from+stem+cells+and+cell+lines.">Antibody-based detection of protein phosphorylation status to track the efficacy of novel therapies using nanogram protein quantities from stem cells and cell lines.</a> Nat Protoc. 10 (1), 149-168 (2015).</li><li>Fan, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanofluidic+proteomic+assay+for+serial+analysis+of+oncoprotein+activation+in+clinical+specimens.">Nanofluidic proteomic assay for serial analysis of oncoprotein activation in clinical specimens.</a> Nat Med. 15 (5), 566-571 (2009).</li><li>Padhan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+sensitivity+isoelectric+focusing+to+establish+a+signaling+biomarker+for+the+diagnosis+of+human+colorectal+cancer.">High sensitivity isoelectric focusing to establish a signaling biomarker for the diagnosis of human colorectal cancer.</a> BMC Cancer. 16 (1), 683 (2016).</li><li>Sun, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGFR2+induces+c-Src+signaling+and+vascular+permeability+in+vivo+via+the+adaptor+protein+TSAd.">VEGFR2 induces c-Src signaling and vascular permeability in vivo via the adaptor protein TSAd.</a> J Exp Med. 209 (7), 1363-1377 (2012).</li><li>Iacovides, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+quantification+of+AKT+isoforms+and+phosphoforms+in+breast+cancer+using+a+novel+nanofluidic+immunoassay.">Identification and quantification of AKT isoforms and phosphoforms in breast cancer using a novel nanofluidic immunoassay.</a> Mol Cell Proteomics. 12 (11), 3210-3220 (2013).</li><li>Price, F. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+JAK-STAT+signaling+stimulates+adult+satellite+cell+function.">Inhibition of JAK-STAT signaling stimulates adult satellite cell function.</a> Nat Med. 20 (10), 1174-1181 (2014).</li><li>Unger, F. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoproteomic+analysis+of+ischemia-dependent+changes+in+signaling+protein+phosphorylation+in+colorectal+normal+and+cancer+tissue.">Nanoproteomic analysis of ischemia-dependent changes in signaling protein phosphorylation in colorectal normal and cancer tissue.</a> J Transl Med. 14, 6 (2016).</li><li>Urasaki, Y., Pizzorno, G., Le, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+uridine+administration+induces+fatty+liver+and+pre-diabetic+conditions+in+mice.">Chronic uridine administration induces fatty liver and pre-diabetic conditions in mice.</a> PLoS One. 11 (1), e0146994 (2016).</li><li>Schmidt, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Case-specific+potentiation+of+glioblastoma+drugs+by+pterostilbene.">Case-specific potentiation of glioblastoma drugs by pterostilbene.</a> Oncotarget. 7 (45), 73200-73215 (2016).</li></ol>

感度と分解能のタンパク質が生体試料のプロテオーム研究のため重要です。細胞内微量に含まれるタンパク質を検出できることに大きな価値があります。代表取締役には、感度の向上と蛋白質とのアイソ フォーム4の検出のための解像度を提供できます。
この技術は、多くプロテオーム研究レポート5,6,</su...

その電荷1,2,3蛋白を解決する自動、キャピラリーを用いたイムノアッセイ法であるキャピラリー等電集中 (代表取締役)それは高い再現性で迅速かつ定量的に蛋白質とそのファーストクリーニング変更を解決することができます。西部にしみが付くことなど従来の方法に代わるものを提示します。西部にしみが付くことは非常に容易にアクセスできるサンプルの豊富な蛋白質の存在を確認するため良い変動、時間消費、および正確な定量すべての存在の課題、特に生体組織サンプルを調べるとき。確かに、変動は西部にしみが付くことで本質的な問題があると多数手順、読み込みと SDS ページのゲルの実行、膜への蛋白の転送など様々 な試薬と孵化 (e.g、プライマリおよびセカンダリ。ECL 抗体)、x 線フィルム4を開発。現在、西部のしみが付く技術は化学発光信号 (デジタル西部劇) のデジタル録音の実装を改善します。、自動化された西部しみが付くシステムは近年、すなわち毛細血管西部、よりハンズフリーし、ゲル無料システムであります。全体アッセイ システム3,4に次のサンプル プレート (すべての必要な試薬とサンプル) の読み込みを自動化されています。楽器は蛋白質の分離などのすべての手順を実行、抗体の孵化、毛細血管壁へのタンパク質固定化を別の手順と開発化学発光シグナルの定量化と洗います。したがって、ここに示す代表取締役手順は、高い解像度と感度を提供します。
この方法は、機密性の高い信号を生成され、蛋白質1の用いたから定量化することができます。優れた再現性と高感度はこの技術を臨床サンプルの解析に非常に便利になります。それは、検出、蛋白質のポスト並進変更 (例えば、異なるリン酸化タンパク質アイソ フォーム) を区別することができます。この技術は、正常に異なるシグナル伝達経路4,5がん3、新しい治療法を開発することを目指して臨床研究を分析する使用されています、蛋白質バイオ マーカーおよび薬剤の発見のための素晴らしい可能性を持っています。.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="920">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:367px;">NanoPro 1000</td>
			<td style="width:107px;">ProteinSimple</td>
			<td style="width:301px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Premix G2, pH 5&#8211;8 (nested) separation gradient, pH 2&#8211;4 plug</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-972</td>
			<td>Ampholyte premix</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DMSO inhibitor mix</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-510</td>
			<td>Phosphatase inhibitors; for cIEF 1:50 dilution used</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Aqueous Inhibitor Mix</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-482</td>
			<td>Protease inhibitor; for cIEF 1:25 dilution used</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">pI standard ladder 3</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-646</td>
			<td>For cIEF 1:60 dilution used</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sample diluent</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-649</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Antibody diluent&#160;</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Wash concentrate</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>041-108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Anolyte Refill</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Catholyte Refill</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-338</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Peroxide XDR</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>041-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Luminol</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Bicine/CHAPS Lysis Buffer</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Capillaries-Charge Separation (1 pack) for&#160;</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>CBS700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Assay Plate/Lid Kit</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Peroxidase-AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)&#160;</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch&#160;</td>
			<td>711-035-152</td>
			<td>For cIEF used (1: 300)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Peroxidase-AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)&#160;</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch&#160;</td>
			<td>715-035-150</td>
			<td>For cIEF used (1: 300)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Phospho-Erk 1/2 Primary Antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9101</td>
			<td>For cIEF used (1: 50)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Pan Erk Primary Antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9102</td>
			<td>For cIEF used (1: 100)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Compass software</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">HUVEC</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>PCS-100-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MV2 (EBM-2)</td>
			<td>PromoCell</td>
			<td>&#160;C-22221</td>
			<td>Endothelia cell basal medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Endothelial Cell Growth Medium MV2 SupplementPack</td>
			<td>PromoCell</td>
			<td>C-39221</td>
			<td>Supplementation to MV2 above</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">VEGFA</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Long R3 IGF</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>85580C/I1146</td>
			<td>Insulin-like growth factor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bioruptor (Sonicator)</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>B01020001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BCA Protein Assay kit&#160;</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>NP0322BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NuPAG MOPS SDS Running Buffer (20X)</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>NP0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NuPAGE Transfer Buffer (20X)</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>NP0006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Immobilon PVDF membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microfuge tube vortexer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Microtiter plate adapter for centrifuge</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Pipettors&#160;</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Tips</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Ice</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

highly sensitive and quantitative detection of proteins and their isoforms by capillary isoelectric focusing method

免疫ブロット生体試料中のタンパク質の特徴の多くの実験室のルーチンの技術となっています。次のプロトコルは、代替戦略を提供、従来免疫ブロット キャピラリー等電の多くの利点 (代表取締役) を中心に比べています。完全な西部のしみが付くプロシージャが起こる超毛細血管内抗体ベース、自動化、迅速かつ定量的な方法です。この手法、しみの除去、膜に転送するゲルを必要としないか、または x 線フィルム、通常従来免疫ブロットを必要です。充満 (等電点; pI) によるを使用してより小さい、1 マイクロリットルの蛋白質の分離、ここ (400 nL) 総蛋白ライセートの。電気泳動後のタンパク質はプライマリとセカンダリ (西洋ワサビペルオキシダーゼ (HRP) 共役) 続いて、紫外光照射による毛細血管壁に固定化抗体の孵化、バインドは検出が強化されました。化学発光 (ECL)、キャプチャおよび電荷結合素子 (CCD) カメラによって記録が可能な光信号を生成します。デジタル画像分析することができ、定量化 (ピーク面積) ソフトウェアを使用しています。この高スループット プロシージャは、同時に 96 のサンプルを処理できます。非常に敏感な picogram の範囲でタンパク質検出自動化のため再現性の高い結果を生成します。すべてのこれらの側面は、試料 (例えば、ティッシュ サンプルおよび生検) の数量が制限要因非常に貴重です。技術がより広いアプリケーションだけでなく、薬や抗体、バイオ マーカーの探索と診断のためのスクリーニングを含みます。

新しいアッセイのデザイン:図 1 aに、アッセイ プレート レイアウトを示します。最大限に、各条件 (抗体) の 12 の井戸のブロックで 384 ウェル プレートから 96 ウェルを使用できます。12 ウェルの各ブロックは A1 A12 または A13 A24 のいずれかから開始できます。色分けされた行は互いのサンプルや試薬を区別すること。分析テンプレ?...

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Highly Sensitive and Quantitative Detection of Proteins and Their Isoforms by Capillary Isoelectric Focusing Method

キャピラリー等電集中はタンパク質と非常に小さい試料からアイソ フォームの詳細な特性解析を有効に、抗体を用いた、超高感度、高スループット手法です。次に、自動化・ ロボット化の方法で特定の蛋白質とアイソ フォームの検出と定量のためのプロトコルについて説明します。

タンパク質キャピラリー等電点焦点法によるアイソ フォームの高感度・定量的検出

Immunoblotting has become a routine technique in many laboratories for protein characterization from biological samples. The following protocol provides ...

この方法は、バイオマーカー発見、創薬、診断、薬物や抗体のスクリーニングなど、生物医学の研究分野における重要な質問に答える手助けとなります。この技術の主な利点は、高スループットであり、非常に再現性の高い方法でタンパク質アイソフォームを検出できることです。この技術の意味は、影響を受けたタンパク質またはそのアイソフォームを測定することができるため、多くの疾患の診断にまで及びます。この方法は、細胞シグナル伝達経路に関する洞察を提供することができますが、特定のタンパク質を分析する必要がある他のシステムにも適用できます。この方法の視覚的なデモンストレーションは、気泡の除去、プレートのローディング、エトセトラなどのトリックのためにアッセイのステップを学ぶのが難しいため、非常に重要です。まず、DMSO阻害剤の1マイクロリットルとプロテアーゼ阻害剤の2マイクロリットルを47マイクロリットルのサンプル希釈剤に加えてサンプル希釈剤混合物を調製し、DMSOおよびプロテアーゼ阻害剤の最終濃度が1つのX.希薄化したタンパク質溶解物となるように、所望の濃度を得る。次に、3.325マイクロリットルの標準ラダー、6マイクロリットルのプロテアーゼ阻害剤、および3マイクロリットルのDMSO阻害剤を137.675マイクロリットルのアントライトプレミックスに加えます。サンプルを少なくとも15秒間渦し、氷の上に置いておく。DMSOプロテアーゼ阻害剤と等電点標準ラダーの最終的な濃度が1つのXであり、毛細管内のタンパク質が最終的な所望の濃度に達するように、2つの調製された溶液を1〜3つの比率で混合します。タンパク質をサンプル混合物に添加した後、すべてのステップは氷の上または摂氏4度で行われます。氷の上に384ウェルプレートを置きます。自動ウェスタンブロッティングシステムソフトウェアで設計されたアッセイテンプレートレイアウトに従って、サンプルミックスの10マイクロリットルをプレートの適切なウェルにロードします。これに続いて、一次および二次抗体を希釈する抗体希釈剤を用いた。次いで、10マイクロリットルの一次抗体と15マイクロリットルの二次抗体を各ウェルにピペットします。次に、ルミノールと過酸化物XDRを1対1の比率で混合する。15マイクロリットルのルミノール過酸化物のピペットを各ウェルに混合する。サンプルとレーガンがプレートに加えられたら、遠心分離機は2500倍Gで10分間、摂氏4度で液体を回転させ、泡を取り除きます。それでも気泡が残っている場合は、薄いピペットチップを使用して手動で取り外します。自動ウェスタンブロッティングシステムソフトウェアを開き、ファイルメニューからnew'をクリックします。レイアウト ペインに移動し、384 ウェル プレートのレーガンとサンプルの場所を割り当てます。ブロック内の任意のウェルをクリックして、レーガンの割り当てを行います。各 12 ウェルの行ブロックを選択します。次に、レイアウト ペインのツールバーに移動し、サンプル、プライマリ、セカンダリ、またはルミノール行ブロックを挿入します。プロトコル ペインに移動し、プレート内のレーガンの場所を選択します。次に、サンプル列のセルをクリックし、ドロップダウンメニューからレーガンを選択します。同じ方法で、各サイクルのプライマリ、セカンダリ、およびルミノールのレーガンの場所を選択します。一次抗体または二次抗体カラム内の細胞を 1 つずつクリックし、必要に応じてインキュベーション時間を変更します。次に、プロトコルセクションの[追加]ボタンをクリックしてサイクルを追加します。テンプレート ペインに、一次抗体と二次抗体の同一性、カタログ番号、希釈などのサンプルに関する情報を入力します。新しいアッセイファイルを保存します。スタートボタンをクリックする前に、レイアウトを素早くチェックして、すべてが正しいことを確認してください。さて、実行を開始するには、[開始]をクリックします。ソフトウェアは、廃棄物を取り除き、水と毛細血管ボックスを補充し、リソーストレイにアノライトとカホライトを追加し、洗浄バッファを追加し、冷却されたサンプルトレイにプレートをロードするようにユーザーに促します。計測器のステータスバーは、実行開始後数分後にコンピュータ画面に表示されます。[概要の実行] 画面をクリックして、ステータス ペインと分離ペインを表示します。毛細管内の電気泳動分離を観察するには、目的のサイクルをクリックし、コントロールパネルの再生ボタンをクリックして、その毛細血管の分離ムービーを再生します。実行ファイルを開き、分析画面タブを選択します。[編集]をクリックし、次に解析を行って等電点範囲を変更します。適切な等電点規格を適用します。ピークフィットを追加し、ピーク名を追加します。最後に、[ピーク]タブで使用するデータを選択し、さらに分析するためにデータをエクスポートします。血管内皮増殖因子刺激性ライセート由来のリン酸化細胞外シグナル調節キナーゼの電界球造図をここに示す。血管内皮増殖因子で観察されるリン酸化タンパク質の誘導が非常に高い。インセットは、内因性負荷制御HSP 70を示し、未処理および処理されたサンプルの両方に対するサンプルの同様の負荷を示す。従来のイムノブロットでは、リン酸化された細胞外シグナル調節キナーゼタンパク質が毛細管等電体集光解析によって4つのピークに分解されたにもかかわらず、2つのバンドしか検出されなかった。血管内皮増殖因子刺激性ライセート由来の細胞外シグナル調節キナーゼの電解液球をここに示す。差し込みでは、並列で使用されるのと同じ負荷制御が表示されます。従来のイムノブロットは、細胞外シグナル調節キナーゼ1つと細胞外シグナル調節キナーゼ2に対応する2つのバンドのみを示す。毛細管等電体の焦点合わせに対して、細胞外シグナル調節キナーゼタンパク質は6つのピークに分解され、4つの異なるリン酸化ピークと2つの非リン酸化ピークに対応した。一度習得すると、この技術は、サイクルの数に応じて、それが適切に実行されている場合、数時間で行うことができます。この手順を試みている間、従来の免疫ブロットと比較して、より高い抗体濃度を使用することを覚えておくことが重要です。この方法の視覚的なデモンストレーションは、気泡の除去、プレートのローディング、エトセトラなどのトリックのためにアッセイのステップを学ぶのが難しいため、非常に重要です。このビデオを見た後、アッセイの設計、サンプルの準備、アッセイの実行、データの分析を行い、タンパク質のさまざまなアイソフォームを観察する方法をよく理解する必要があります。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Highly Sensitive and Rapid Fluorescence Detection with a Portable FRET Analyzer

ポータブルFRETアナライザを使用して高感度かつ迅速な蛍光検出

Recent improvements in F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) sensors have enabled their use to detect various small molecules including ions and ...

An Efficient Method for the Isolation of Highly Purified RNA from Seeds for Use in Quantitative Transcriptome Analysis

定量的トランスクリプトーム解析に使用するための種子から高度に精製されたRNAの単離のための効率的な方法

Plant seeds accumulate large amounts of storage reserves comprising biodegradable organic matter. Humans rely on seed storage reserves for food and as ...

Capillary Electrophoresis Separation of Monoclonal Antibody Isoforms Using a Neutral Capillary

ニュートラルキャピラリーを使用したモノクローナル抗体アイソフォームのキャピラリー電気泳動分離

Biotherapeutic proteins, such as monoclonal antibodies (mAbs), are feasible alternatives for the treatment of chronic-degenerative diseases. The ...

Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

透過型電子顕微鏡により膜相互作用タンパク質を視覚化し、分析するための方法

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

Formation of Covalent DNA Adducts by Enzymatically Activated Carcinogens and Drugs In Vitro and Their Determination by 32P-postlabeling

Formation of Covalent DNA Adducts by Enzymatically Activated Carcinogens and Drugs In Vitro and Their Determination by 32P-postlabeling

共有結合 DNA 付加体生成活性酵素によって発ガン性物質の in Vitro薬物と32p-ポストラベルで決意

Covalent DNA adducts formed by chemicals or drugs with carcinogenic potency are judged as one of the most important factors in the initiation phase of ...

Detection of Detergent-sensitive Interactions Between Membrane Proteins

洗剤に敏感な膜タンパク質相互作用の検出

Our ability to explore protein-protein interactions is the key to understanding regulatory connections in the cell. However, detection of protein-protein ...

Quantitative and Qualitative Method for Sphingomyelin by LC-MS Using Two Stable Isotopically Labeled Sphingomyelin Species

同位体 2 つの安定を用いる液体クロマトグラフィー質量によってスフィンゴミエリンの定量的および定性的な方法ラベル スフィンゴミエリン種

We present a method of analyzing sphingomyelin (SM) qualitatively and quantitatively by liquid chromatography-electrospray Ionization-tandem mass ...

Analysis of AtHIRD11 Intrinsic Disorder and Binding Towards Metal Ions by Capillary Gel Electrophoresis and Affinity Capillary Electrophoresis

AtHIRD11 本質的な障害とキャピラリー電気泳動と親和性キャピラリー電気泳動による金属イオンへの結合の解析

Plants are strongly dependent on their environment. In order to adjust to stressful changes (e.g., drought and high salinity), higher plants evolve ...

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

その場で近接結紮アッセイを用いたタンパク質アイソ フォームの Heterodimerization の検出

Regulated protein-protein interactions are a guiding principle for many signaling events, and the detection of such events is an important element in ...

Use of Recombinant Fusion Proteins in a Fluorescent Protease Assay Platform and Their In-gel Renaturation

蛍光プロテアーゼ アッセイプラット フォームとそのゲルの下で遺伝子組換えの融合蛋白質の使用

Proteases are intensively studied enzymes due to their essential roles in several biological pathways of living organisms and in pathogenesis; therefore, ...

タンパク質キャピラリー等電点焦点法によるアイソ フォームの高感度・定量的検出

タンパク質キャピラリー等電点焦点法によるアイソフォームの高感度・定量的検出