Name: highly sensitive and quantitative detection of proteins and their isoforms by capillary isoelectric focusing method
Uploaded: 2018-09-19T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Highly Sensitive and Quantitative Detection of Proteins and Their Isoforms by Capillary Isoelectric Focusing Method at JoVE.com

저자는 교수 레나 Claesson-웨일스어, 웁살라 대학, 스웨덴이이 프로젝트 개발을 위한 그녀의 지원에 대 한 감사 합니다. 또한, 저자 로스 스미스와 레나 Claesson-웨일스어, 웁살라 대학 그들의 중요 한 읽기 및 원고를 개선 하기 위한 제안을 위한 감사 합니다.

1. 세포 문화, 자극, 및 세포의 용 해
참고:이 방법은 많은 세포 유형으로 사용할 수 있습니다. 방법을 설명 하기 위해 예를 들어 인간의 탯 줄 정 맥 내 피 세포 (HUVECs)를 사용 하 여 설명 되어 있습니다.
<ol><li>적절 한 보충과 내 피 세포 기저 매체에서 10 cm 배양 접시 젤라틴 코팅에 HUVECs 문화 ( 재료의 표참조), 또한 5 %FCS, 표 피 성장 인자 (5 ng/mL), 혈관 내 피 성장 ?...

<ol>
	<li>O'Neill, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isoelectric+focusing+technology+quantifies+protein+signaling+in+25+cells.">Isoelectric focusing technology quantifies protein signaling in 25 cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (44), 16153-16158 (2006).</li><li>Aspinall-O'Dea, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody-based+detection+of+protein+phosphorylation+status+to+track+the+efficacy+of+novel+therapies+using+nanogram+protein+quantities+from+stem+cells+and+cell+lines.">Antibody-based detection of protein phosphorylation status to track the efficacy of novel therapies using nanogram protein quantities from stem cells and cell lines.</a> Nat Protoc. 10 (1), 149-168 (2015).</li><li>Fan, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanofluidic+proteomic+assay+for+serial+analysis+of+oncoprotein+activation+in+clinical+specimens.">Nanofluidic proteomic assay for serial analysis of oncoprotein activation in clinical specimens.</a> Nat Med. 15 (5), 566-571 (2009).</li><li>Padhan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+sensitivity+isoelectric+focusing+to+establish+a+signaling+biomarker+for+the+diagnosis+of+human+colorectal+cancer.">High sensitivity isoelectric focusing to establish a signaling biomarker for the diagnosis of human colorectal cancer.</a> BMC Cancer. 16 (1), 683 (2016).</li><li>Sun, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGFR2+induces+c-Src+signaling+and+vascular+permeability+in+vivo+via+the+adaptor+protein+TSAd.">VEGFR2 induces c-Src signaling and vascular permeability in vivo via the adaptor protein TSAd.</a> J Exp Med. 209 (7), 1363-1377 (2012).</li><li>Iacovides, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+quantification+of+AKT+isoforms+and+phosphoforms+in+breast+cancer+using+a+novel+nanofluidic+immunoassay.">Identification and quantification of AKT isoforms and phosphoforms in breast cancer using a novel nanofluidic immunoassay.</a> Mol Cell Proteomics. 12 (11), 3210-3220 (2013).</li><li>Price, F. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+JAK-STAT+signaling+stimulates+adult+satellite+cell+function.">Inhibition of JAK-STAT signaling stimulates adult satellite cell function.</a> Nat Med. 20 (10), 1174-1181 (2014).</li><li>Unger, F. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoproteomic+analysis+of+ischemia-dependent+changes+in+signaling+protein+phosphorylation+in+colorectal+normal+and+cancer+tissue.">Nanoproteomic analysis of ischemia-dependent changes in signaling protein phosphorylation in colorectal normal and cancer tissue.</a> J Transl Med. 14, 6 (2016).</li><li>Urasaki, Y., Pizzorno, G., Le, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+uridine+administration+induces+fatty+liver+and+pre-diabetic+conditions+in+mice.">Chronic uridine administration induces fatty liver and pre-diabetic conditions in mice.</a> PLoS One. 11 (1), e0146994 (2016).</li><li>Schmidt, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Case-specific+potentiation+of+glioblastoma+drugs+by+pterostilbene.">Case-specific potentiation of glioblastoma drugs by pterostilbene.</a> Oncotarget. 7 (45), 73200-73215 (2016).</li></ol>

감도 및 단백질의 해상도 proteomic 연구 생물 학적 샘플에 대 한 중요 한 있습니다. 셀에 분 수량에 존재 하는 단백질을 감지할 수 있게 되 고 큰 가치가 있다. cIEF는 향상 된 감도 단백질과 그들의 isoforms4의 검출에 대 한 해상도 제공할 수 있습니다.
이 기술은 많은 proteomic 연구 보고서5,,67에...

모 세관 전자 초점 (cIEF) 그들의 충전1,2,3에 근거 하 여 단백질을 확인 하는 자동화 된, 모 세관 기반 immunoassay입니다. 그것은 매우 재현 하 고 신속 하 고 양적 단백질과 그들의 post-translationally 수정된 isoforms를 해결 하기 위한 능력입니다. 그것은 서쪽에 게 더 럽 히기와 같은 기존의 방법에 대안을 선물 한다. 매우 쉽게 액세스할 수 있는 샘플;에 풍부한 단백질의 존재 확인에 대 한 좋은 서쪽에 게 더 럽 히기 다양성, 시간 소비, 및 정확한 정량 모두 존재 도전, 특히 생물학 조직 샘플을 검사 하는 경우. 실제로, 다양성 서쪽 blotting에 고유의 문제는, 거기에 수많은 단계 참여, 로드 및 SDS 페이지 젤의 실행, 전송, 막에는 단백질의 다양 한 시 약으로 부 화 (예., 기본 및 보조 항 체, ECL), x 선 필름4에 개발. 현재, 서쪽 더 럽 히 기술 chemiluminescent 신호 (디지털 westerns)의 디지털 기록의 구현 개선 이다. 최근, 자동화 된 서쪽 더 럽 히 시스템 개발 되었습니다, 즉 모 세관 서 부, 보다 핸 즈 프리 하 고 젤 무료 시스템입니다. 전체 분석 결과 시스템3,4에 샘플 플레이트 (샘플 모든 필요한 시 약을)의 로드에 따라 자동입니다. 악기는 단백질 분리 등 모든 단계를 수행 합니다 다른 단계, 그리고 개발 및 정량화 chemiluminescent 신호 사이 모 세관 벽, 항 체 외피 단백질의 동원 정지 세척. 따라서, 여기에 제시 된 cIEF 절차는 높은 해상도 감도 제공 합니다.
이 메서드는 중요 한 신호를 생성 고 단백질1의 picograms에서 측정할 수 있습니다. 우수한 재현성 높은 감도이 기술을 임상 샘플의 분석을 위해 매우 유용 하다. 그것은 수 탐지 뿐 아니라 단백질의 포스트 번역 상 수정 (예: 다른 phosphorylated 단백질 isoforms) 구별. 이 기술을 성공적으로 사용 되었습니다 다른 신호 통로4,5 암3, 새로운 치료제 개발을 목표로 하는 임상 연구를 해 부하 고 단백질 바이오 마커 및 약물 발견에 대 한 큰 가능성이 있다 .

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="920">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:367px;">NanoPro 1000</td>
			<td style="width:107px;">ProteinSimple</td>
			<td style="width:301px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Premix G2, pH 5&#8211;8 (nested) separation gradient, pH 2&#8211;4 plug</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-972</td>
			<td>Ampholyte premix</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DMSO inhibitor mix</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-510</td>
			<td>Phosphatase inhibitors; for cIEF 1:50 dilution used</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Aqueous Inhibitor Mix</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-482</td>
			<td>Protease inhibitor; for cIEF 1:25 dilution used</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">pI standard ladder 3</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-646</td>
			<td>For cIEF 1:60 dilution used</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sample diluent</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-649</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Antibody diluent&#160;</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Wash concentrate</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>041-108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Anolyte Refill</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Catholyte Refill</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-338</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Peroxide XDR</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>041-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Luminol</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Bicine/CHAPS Lysis Buffer</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Capillaries-Charge Separation (1 pack) for&#160;</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>CBS700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Assay Plate/Lid Kit</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Peroxidase-AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)&#160;</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch&#160;</td>
			<td>711-035-152</td>
			<td>For cIEF used (1: 300)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Peroxidase-AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)&#160;</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch&#160;</td>
			<td>715-035-150</td>
			<td>For cIEF used (1: 300)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Phospho-Erk 1/2 Primary Antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9101</td>
			<td>For cIEF used (1: 50)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Pan Erk Primary Antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9102</td>
			<td>For cIEF used (1: 100)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Compass software</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">HUVEC</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>PCS-100-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MV2 (EBM-2)</td>
			<td>PromoCell</td>
			<td>&#160;C-22221</td>
			<td>Endothelia cell basal medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Endothelial Cell Growth Medium MV2 SupplementPack</td>
			<td>PromoCell</td>
			<td>C-39221</td>
			<td>Supplementation to MV2 above</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">VEGFA</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Long R3 IGF</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>85580C/I1146</td>
			<td>Insulin-like growth factor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bioruptor (Sonicator)</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>B01020001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BCA Protein Assay kit&#160;</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>NP0322BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NuPAG MOPS SDS Running Buffer (20X)</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>NP0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NuPAGE Transfer Buffer (20X)</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>NP0006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Immobilon PVDF membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microfuge tube vortexer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Microtiter plate adapter for centrifuge</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Pipettors&#160;</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Tips</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Ice</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

highly sensitive and quantitative detection of proteins and their isoforms by capillary isoelectric focusing method

Immunoblotting 생물학 견본에서 단백질 특성에 대 한 많은 실험실에서 일상적인 기술 되고있다. 대체 전략을 제공 하는 다음 프로토콜, 기존의 immunoblotting 모 세관 (cIEF), 많은 장점을가지고 초점 전자 비교. 이는 완전 한 서쪽 더 럽 히 절차 수행 ultrathin 모 세관 내부 항 체 기반, 자동, 급속 한, 및 양적 방법입니다. 이 기술은 젤 막,도 말의 스트립 전송 필요 또는 기존의 immunoblotting에 일반적으로 필요한 영화를 x 선 하지 않습니다. 여기, 단백질 분리 (전자 포인트, pI) 그들의 책임에 따라, 사용 하 여 보다는 microliter (400 nL) 총 단백질 lysate의. 전기 이동 법, 후 단백질 자외선 빛 치료, 기본 및 보조 (양 고추냉이 과산화 효소 (HRP) 활용)에 의해 모 세관 벽에 움직일 수 있다 항 체 외피, 누구의 바인딩을 통해 감지 향상 화학 (ECL), 점령 하 고 전 하 결합 소자 (CCD) 카메라에 의해 기록 된 수 있는 광 신호를 생성 한다. 디지털 이미지 분석 될 수 있다 및 계량 (피크 지역) 소프트웨어를 사용 하 여. 이 높은 처리량 절차 한 번;에 96 샘플을 처리할 수 있습니다 매우 민감한, picogram 범위의; 단백질 검출 그리고 자동화 때문에 높은 재현성 결과 생산입니다. 이러한 측면의 모두 매우 귀중 한 때 (예를 들어, 조직 샘플 및 생 검) 샘플의 수량 제한 요소입니다. 기술은 더 넓은 응용 프로그램 뿐만 아니라, 약물 또는 항 체, 바이오 마커 발견 및 진단 목적으로의 심사를 포함 하 여 있다.

디자인의 새로운 분석 결과: 분석 결과 플레이트 레이아웃 그림 1A에 표시 됩니다. 극대, 96 웰 스 384-잘 접시 12 웰 스의 블록에서에서 각 조건 (항 체)에 대 한 사용할 수 있습니다. 12 우물의 각 블록 A1-A12 또는 A13-A24에서 시작할 수 있습니다. 색상 코드 행 하나 다른 샘플 또는 시 약을 구별할 수 있습니다. 분석 결과 서식 파일 (<strong class="x...

Watch this Scientific Journal Video about Highly Sensitive and Quantitative Detection of Proteins and Their Isoforms by Capillary Isoelectric Focusing Method at JoVE.com

Highly Sensitive and Quantitative Detection of Proteins and Their Isoforms by Capillary Isoelectric Focusing Method

모 세관 전자 초점 단백질과 매우 작은 생물 학적 샘플에서 그들의 isoforms의 상세한 특성을 사용 하는 항 체 기반, 磁, 높은 처리량 기법입니다. 다음 자동화 하 고 운반할 방식 검색 및 특정 단백질과 그들의 isoforms의 정량화에 대 한 프로토콜을 설명합니다.

단백질 및 모 세관 전자 초점 방법으로 그들의 Isoforms의 매우 민감하고 정량적 검출

Immunoblotting has become a routine technique in many laboratories for protein characterization from biological samples. The following protocol provides ...

이 방법은 바이오마커 발견, 약물 발견, 진단 및 약물 또는 항체의 검진과 같은 생물 의학 연구 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 높은 처리량이며 단백질 동소형을 매우 재현 가능한 방식으로 검출할 수 있다는 것입니다. 이 기술의 의미는 영향 받은 단백질 또는 그들의 등소 양식을 측정할 수 있기 때문에 많은 질병의 진단으로 확장합니다.이 방법은 세포 신호 경로에 대한 통찰력을 제공 할 수 있지만, 특정 단백질을 분석할 필요가있는 다른 시스템에도 적용 될 수 있습니다. 이 방법의 시각적 데모는 분석 단계가 거품 제거, 플레이트 로드, 등 세테라와 같은 트릭 때문에 배우기 어렵기 때문에 중요합니다. 먼저, DMSO 억제제 믹스 1편과 프로테아제 억제제 2마이크로리터를 47마이크로리터에 첨가하여 시료 희석제 혼합을 준비하여 DMSO 및 프로테아제 억제제의 최종 농도가 원하는 농도를 얻기 위해 시료 희석제 혼합을 이용하여 이전에 분리된 단백질 리자이 1개되도록 한다.다음으로, 표준 사다리의 3.325 마이크로리터, 프로테아제 억제제6마이크로리터, 안톨라이트 프리믹스의 137.675 마이크로리터에 DMSO 억제제 3편을 추가한다. 샘플을 15초 이상 소용돌이치며 얼음을 유지합니다. DMSO 프로테아제 억제제와 등전점 표준 사다리의 최종 농도가 1X이고 모세관의 단백질이 최종 원하는 농도에 도달할 수 있도록 두 개의 준비된 용액을 1~3비율로 혼합한다.단백질이 샘플 혼합물에 첨가된 후 모든 단계는 얼음이나 섭씨 4도에서 수행됩니다. 얼음 위에 384웰 접시를 놓습니다. 자동화 된 서양 블로팅 시스템 소프트웨어로 설계된 분석 템플릿 레이아웃에 따라 샘플 믹스의 10 마이크로 리터를 플레이트의 적절한 우물에 로드합니다.이에 따라, 항체 희석제로 1차 및 이차 항체를 희석시한다. 그런 다음, 1차 항체의 10마이크로리터와 각각의 우물로 이차 항체의 15 마이크로리터를 피펫한다. 다음으로, 루미놀과 과산화수소 XDR을 1대 1 비율로 혼합합니다.루미놀 과산화물의 파이펫 15 마이크로리터가 각 우물에 섞어 넣습니다. 시료와 레이건을 접시에 첨가하면 원심분리기는 2500회 G와 섭씨 4도에서 10분 동안 액체를 회전시키고 거품을 제거합니다. 거품이 여전히 남아 있는 경우 얇은 파이펫 팁을 사용하여 수동으로 제거합니다.자동화된 웨스턴 블로팅 시스템 소프트웨어를 열고 파일 메뉴에서 새'를 클릭합니다. 레이아웃 창으로 이동하여 384웰 플레이트의 레이건 및 샘플위치에 할당합니다. 블록의 어느 곳에서나 잘 클릭하여 레이건 과제를 수행합니다.각 12개의 우물행 블록을 선택합니다. 다음으로 레이아웃 창 도구 모음으로 이동하여 샘플, 기본, 보조 또는 루미놀 행 블록을 삽입합니다. 프로토콜 창으로 이동하여 플레이트에서 레이건 위치를 선택합니다.그런 다음 샘플 열의 셀을 클릭하고 드롭다운 메뉴에서 레이건을 선택합니다. 같은 방식으로 각 사이클에 대해 프라이머리, 보조 및 루미놀의 레이건 위치를 선택합니다. 1차 또는 이차 항체 컬럼에서 한 번에 하나씩 세포를 클릭하고 필요한 경우 인큐베이션 시간을 변경합니다.그런 다음 프로토콜 섹션에서 추가 단추를 클릭하여 주기를 추가합니다. 템플릿 창에서, 1차 및 이차 항체의 ID, 카탈로그 번호 및 희석과 같은 샘플에 관련된 정보를 입력합니다. 새 분석 파일을 저장합니다.시작 버튼을 클릭하기 전에 레이아웃을 신속하게 확인하여 모든 것이 올바른지 확인합니다. 이제 시작'을 클릭하여 실행을 시작합니다. 이 소프트웨어는 사용자가 폐기물을 제거하고, 물과 모세관 상자를 채우고, 자원 트레이에 아노라이트와 음극을 추가하고, 세척 버퍼를 추가하고, 냉각 된 샘플 트레이에 플레이트를로드하도록 사용자에게 메시지를 표시합니다.실행이 시작된 후 몇 분 후에 컴퓨터 화면에 계측기 상태 표시줄이 표시됩니다. 실행 요약'화면을 클릭하여 상태 및 분리 창을 확인합니다. 모세관에서 전기전도 분리를 관찰하려면 원하는 주기를 클릭한 다음 제어판에서 재생 버튼을 클릭하여 모세관에 대한 분리 동영상을 재생합니다.실행 파일을 열고 분석 화면 탭을 선택합니다. 편집을 클릭한 다음 분석'하여 등산 점 범위를 변경합니다. 적절한 동전점 표준을 적용합니다.피크 핏을 추가하고 피크 이름을 추가합니다. 마지막으로 피크 탭에서 사용할 데이터를 선택하고 추가 분석을 위해 데이터를 내보냅니다. 혈관 내피 성장 인자 자극 용액용용액으로부터 인포증 외세포 신호 조절 키나아제의 전페로그램이 여기에 나와 있다.혈관 내피 성장 인자와 관찰 된 인산 단백질의 매우 높은 유도가 있습니다. 인셋은 내인성 적재 제어인 HSP 70을 나타내며, 처리되지 않은 샘플과 처리되지 않은 샘플 모두에 대해 유사한 시료 하중을 나타낸다. 종래의 면역블롯에서는 인광세포외성 신호 조절 키나아제 단백질이 모세관 등포 집중 분석에 의해 4개의 피크로 해결되었음에도 불구하고 두 개의 밴드만 검출되었다.혈관 내피 성장 인자 자극 용액에서 세포외 신호 조절 키나아제의 전극체사진은 여기에 표시됩니다. 인셋은 병렬로 사용되는 것과 동일한 로딩 컨트롤을 보여 주습니다. 종래의 면역블롯은 세포외 신호 조절 키나아제 1개 및 세포외 신호 조절 키나아제 2개에 대응하는 두 개의 밴드만 을 나타낸다.모세관 등류 초점과 는 반면, 세포외 신호 조절 키나아제 단백질은 4개의 다른 인광 봉우리와 2개의 un-phosphorylated 봉우리 모두에 해당하는 6개의 봉우리로 해결되었습니다. 일단 마스터되면 이 기술은 제대로 수행되는 경우 주기 수에 따라 몇 시간 안에 수행할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안, 기존의 면역 blot에 비해 더 높은 항체 농도를 사용하는 것이 중요하다.이 방법의 시각적 데모는 분석 단계가 거품 제거, 플레이트 로드, 세테라 와 같은 트릭 때문에 배우기 어렵기 때문에 중요합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 분석법을 설계하고, 샘플을 준비하고, 분석기를 실행하고, 데이터를 분석하여 단백질의 다른 등색을 관찰하는 방법을 잘 이해해야 합니다.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Highly Sensitive and Rapid Fluorescence Detection with a Portable FRET Analyzer

휴대용 FRET 분석과 고감도 및 고속 형광 검출

Recent improvements in F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) sensors have enabled their use to detect various small molecules including ions and ...

연구

생화학

An Efficient Method for the Isolation of Highly Purified RNA from Seeds for Use in Quantitative Transcriptome Analysis

양 사체 (Transcriptome) 분석에있는 사용을위한 씨앗에서 매우 정제 된 RNA의 분리를위한 효율적인 방법

Plant seeds accumulate large amounts of storage reserves comprising biodegradable organic matter. Humans rely on seed storage reserves for food and as ...

Capillary Electrophoresis Separation of Monoclonal Antibody Isoforms Using a Neutral Capillary

중립 모세관을 사용하여 단일 클론 항체 동종의 모세관 전기 영동 분리

Biotherapeutic proteins, such as monoclonal antibodies (mAbs), are feasible alternatives for the treatment of chronic-degenerative diseases. The ...

Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

방법은 시각화 및 투과 전자 현미경에 의해 막 상호 작용하는 단백질을 분석하는

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

Formation of Covalent DNA Adducts by Enzymatically Activated Carcinogens and Drugs In Vitro and Their Determination by 32P-postlabeling

Formation of Covalent DNA Adducts by Enzymatically Activated Carcinogens and Drugs In Vitro and Their Determination by 32P-postlabeling

형성 화학식 DNA Adducts 효소 활성화 된 발암 물질 및 생체 외에서 마약 및 32P postlabeling에 의해 그들의 결정에 의해

Covalent DNA adducts formed by chemicals or drugs with carcinogenic potency are judged as one of the most important factors in the initiation phase of ...

Detection of Detergent-sensitive Interactions Between Membrane Proteins

세제에 민감한 막 단백질 사이 상호 작용의 탐지

Our ability to explore protein-protein interactions is the key to understanding regulatory connections in the cell. However, detection of protein-protein ...

Quantitative and Qualitative Method for Sphingomyelin by LC-MS Using Two Stable Isotopically Labeled Sphingomyelin Species

LC-MS Isotopically 두 안정을 사용 하 여 Sphingomyelin에 대 한 양적 및 질적 방법 Sphingomyelin 종 분류

We present a method of analyzing sphingomyelin (SM) qualitatively and quantitatively by liquid chromatography-electrospray Ionization-tandem mass ...

Analysis of AtHIRD11 Intrinsic Disorder and Binding Towards Metal Ions by Capillary Gel Electrophoresis and Affinity Capillary Electrophoresis

AtHIRD11 내장 장애 및 모 세관 젤 전기 이동 법 및 선호도 모 세관 전기 이동 법에 의해 금속 이온으로 바인딩 분석

Plants are strongly dependent on their environment. In order to adjust to stressful changes (e.g., drought and high salinity), higher plants evolve ...

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

제자리에 근접 결 찰 분석 결과 사용 하 여 단백질 Isoforms의 Heterodimerization의 검출

Regulated protein-protein interactions are a guiding principle for many signaling events, and the detection of such events is an important element in ...

Use of Recombinant Fusion Proteins in a Fluorescent Protease Assay Platform and Their In-gel Renaturation

형광 효소 분석 결과 플랫폼에 그들의에서 젤 Renaturation 재조합 융합 단백질의 사용

Proteases are intensively studied enzymes due to their essential roles in several biological pathways of living organisms and in pathogenesis; therefore, ...