Name: highly sensitive and quantitative detection of proteins and their isoforms by capillary isoelectric focusing method
Uploaded: 2018-09-19T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Highly Sensitive and Quantitative Detection of Proteins and Their Isoforms by Capillary Isoelectric Focusing Method at JoVE.com

Forfatteren Takk Prof Lena Claesson-walisisk, Uppsala universitet, Sverige om hennes støtte for å utvikle dette prosjektet. I tillegg forfatteren Takk Ross Smith og Lena Claesson-walisisk, Uppsala universitet for kritisk lesing og forslag til å forbedre manuskriptet.

1. celle kultur, stimulering og lyse
Merk: Denne metoden kan brukes med mange celletyper. For å illustrere metoden, er et eksempel bruker menneskelige umbilical blodåre endotelceller (HUVECs) beskrevet.
<ol><li>Kultur HUVECs gelatin-belagt, 10 cm Petri retter i endothelial celle basale medium med riktig kosttilskudd (se Tabell for materiale), og også inneholder 5% FCS, epidermal vekstfaktor (5 ng/mL), vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF: 0,5 ng/mL), grunnleggende FGF (...

<ol>
	<li>O'Neill, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isoelectric+focusing+technology+quantifies+protein+signaling+in+25+cells.">Isoelectric focusing technology quantifies protein signaling in 25 cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (44), 16153-16158 (2006).</li><li>Aspinall-O'Dea, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody-based+detection+of+protein+phosphorylation+status+to+track+the+efficacy+of+novel+therapies+using+nanogram+protein+quantities+from+stem+cells+and+cell+lines.">Antibody-based detection of protein phosphorylation status to track the efficacy of novel therapies using nanogram protein quantities from stem cells and cell lines.</a> Nat Protoc. 10 (1), 149-168 (2015).</li><li>Fan, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanofluidic+proteomic+assay+for+serial+analysis+of+oncoprotein+activation+in+clinical+specimens.">Nanofluidic proteomic assay for serial analysis of oncoprotein activation in clinical specimens.</a> Nat Med. 15 (5), 566-571 (2009).</li><li>Padhan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+sensitivity+isoelectric+focusing+to+establish+a+signaling+biomarker+for+the+diagnosis+of+human+colorectal+cancer.">High sensitivity isoelectric focusing to establish a signaling biomarker for the diagnosis of human colorectal cancer.</a> BMC Cancer. 16 (1), 683 (2016).</li><li>Sun, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGFR2+induces+c-Src+signaling+and+vascular+permeability+in+vivo+via+the+adaptor+protein+TSAd.">VEGFR2 induces c-Src signaling and vascular permeability in vivo via the adaptor protein TSAd.</a> J Exp Med. 209 (7), 1363-1377 (2012).</li><li>Iacovides, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+quantification+of+AKT+isoforms+and+phosphoforms+in+breast+cancer+using+a+novel+nanofluidic+immunoassay.">Identification and quantification of AKT isoforms and phosphoforms in breast cancer using a novel nanofluidic immunoassay.</a> Mol Cell Proteomics. 12 (11), 3210-3220 (2013).</li><li>Price, F. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+JAK-STAT+signaling+stimulates+adult+satellite+cell+function.">Inhibition of JAK-STAT signaling stimulates adult satellite cell function.</a> Nat Med. 20 (10), 1174-1181 (2014).</li><li>Unger, F. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoproteomic+analysis+of+ischemia-dependent+changes+in+signaling+protein+phosphorylation+in+colorectal+normal+and+cancer+tissue.">Nanoproteomic analysis of ischemia-dependent changes in signaling protein phosphorylation in colorectal normal and cancer tissue.</a> J Transl Med. 14, 6 (2016).</li><li>Urasaki, Y., Pizzorno, G., Le, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+uridine+administration+induces+fatty+liver+and+pre-diabetic+conditions+in+mice.">Chronic uridine administration induces fatty liver and pre-diabetic conditions in mice.</a> PLoS One. 11 (1), e0146994 (2016).</li><li>Schmidt, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Case-specific+potentiation+of+glioblastoma+drugs+by+pterostilbene.">Case-specific potentiation of glioblastoma drugs by pterostilbene.</a> Oncotarget. 7 (45), 73200-73215 (2016).</li></ol>

Følsomhet og oppløsning av proteiner er avgjørende for proteomic forskning på biologiske prøver. Det er stor verdi i å kunne oppdage proteiner som finnes i mengder i celler. cIEF kan tilby bedre følsomhet og oppløsning for påvisning av proteiner og deres isoformene4.
Denne teknologien har blitt brukt i mange proteomic forskning rapporter5,6,7. Likevel er flere begrensn...

Kapillær isoelectric fokus (cIEF) er en automatisert, kapillær-baserte immunanalyse som løser proteiner basert på deres kostnad1,2,3. Det er svært reproduserbare og i stand til å løse proteiner og deres post-translationally endret isoformene raskt og kvantitativt. Den presenterer et alternativ til konvensjonelle metoder som vestlige blotting. Mens vestlige blotting er veldig bra for å bekrefte tilstedeværelse av rikelig proteiner i lett tilgjengelig prøver; variasjon, tidsforbruk og nøyaktig kvantifisering alle tilstede utfordringer, særlig når undersøke biologiske vevsprøver. Faktisk variasjon er en iboende problem i vestlige blotting, som det er mange trinnene involvert, som laster inn og kjører SDS side gelé, overføring av proteiner på membran, inkubasjon med ulike reagenser (f.eks., primære og sekundære antistoffer, ECL), og utvikling på X-ray film4. Tiden, er den vestlige blotting teknikken bedre med implementeringen av digitale opptak av chemiluminescent signaler (digital westernfilmer). Nylig, et automatisert vestlige blotting system har blitt utviklet, nemlig av kapillær vestlige, som er et mer håndfri og gel-fri. Hele analysen er automatisert etter lasting av en prøve plate (eksempler med alle nødvendige reagenser) i systemet3,4. Instrumentet vil utføre alle skritt som protein separasjon, immobilisering av proteiner på kapillære veggen, antistoff incubations, vasker mellom forskjellige trinnene, og utvikling og kvantifisering av chemiluminescent signaler. Dermed gir cIEF prosedyren presenteres her høyere oppløsning og følsomhet.
Denne metoden er sensitiv, som signaler kan genereres og kvantifisert fra picograms proteiner1. Høy følsomhet med utmerket reproduserbarhet gjør denne teknologien svært nyttig for analyse av klinisk prøver. Det kan oppdage samt skille innlegget translasjonsforskning endring (f.eks annet fosforylert protein isoformene) av proteiner. Denne teknologien har blitt brukt til å analysere ulike signalnettverk trasé4,5 i kliniske studier å utvikle nye therapeutics i kreft3, og den har stort potensial for protein biomarkør og narkotika funnet .

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="920">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:367px;">NanoPro 1000</td>
			<td style="width:107px;">ProteinSimple</td>
			<td style="width:301px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Premix G2, pH 5&#8211;8 (nested) separation gradient, pH 2&#8211;4 plug</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-972</td>
			<td>Ampholyte premix</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DMSO inhibitor mix</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-510</td>
			<td>Phosphatase inhibitors; for cIEF 1:50 dilution used</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Aqueous Inhibitor Mix</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-482</td>
			<td>Protease inhibitor; for cIEF 1:25 dilution used</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">pI standard ladder 3</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-646</td>
			<td>For cIEF 1:60 dilution used</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sample diluent</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-649</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Antibody diluent&#160;</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Wash concentrate</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>041-108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Anolyte Refill</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Catholyte Refill</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-338</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Peroxide XDR</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>041-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Luminol</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Bicine/CHAPS Lysis Buffer</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Capillaries-Charge Separation (1 pack) for&#160;</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>CBS700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Assay Plate/Lid Kit</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Peroxidase-AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)&#160;</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch&#160;</td>
			<td>711-035-152</td>
			<td>For cIEF used (1: 300)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Peroxidase-AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)&#160;</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch&#160;</td>
			<td>715-035-150</td>
			<td>For cIEF used (1: 300)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Phospho-Erk 1/2 Primary Antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9101</td>
			<td>For cIEF used (1: 50)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Pan Erk Primary Antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9102</td>
			<td>For cIEF used (1: 100)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Compass software</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">HUVEC</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>PCS-100-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MV2 (EBM-2)</td>
			<td>PromoCell</td>
			<td>&#160;C-22221</td>
			<td>Endothelia cell basal medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Endothelial Cell Growth Medium MV2 SupplementPack</td>
			<td>PromoCell</td>
			<td>C-39221</td>
			<td>Supplementation to MV2 above</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">VEGFA</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Long R3 IGF</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>85580C/I1146</td>
			<td>Insulin-like growth factor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bioruptor (Sonicator)</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>B01020001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BCA Protein Assay kit&#160;</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>NP0322BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NuPAG MOPS SDS Running Buffer (20X)</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>NP0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NuPAGE Transfer Buffer (20X)</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>NP0006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Immobilon PVDF membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microfuge tube vortexer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Microtiter plate adapter for centrifuge</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Pipettors&#160;</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Tips</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Ice</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

highly sensitive and quantitative detection of proteins and their isoforms by capillary isoelectric focusing method

Immunoblotting har blitt en rutinemessig teknikk i mange laboratorier for protein karakterisering fra biologiske prøver. Følgende protokollen gir en alternativ strategi, kapillære isoelectric fokuserer (cIEF), med mange fordeler sammenlignet med konvensjonelle immunoblotting. Dette er et antistoff-basert, automatisert, rask og kvantitativ metode der en komplett vestlige blotting prosedyre finner sted i en supertynn kapillær. Denne teknikken ikke krever en gel å overføre til en membran, stripping av blots, eller x-ray filmer, som vanligvis kreves for vanlig immunoblotting. Her proteiner skilles i henhold til sine kostnader (isoelectric punkt, pI), bruker mindre enn en mikroliter (400 nL) totalt protein lysate. Etter geleelektroforese, proteiner er blokkert på capillary vegger av ultrafiolett lys behandling, etterfulgt av primære og sekundære (pepperrotperoksidase (HRP) konjugert) antistoff inkubasjon som bindende oppdages gjennom forbedret chemiluminescence (ECL), generere et lys signal som kan fanges opp og registrert av en kostnad - sammen enhet (CCD) kameraet. Det digitale bildet kan bli analysert og kvantifisert (peak området) ved hjelp av programvare. Denne høy gjennomstrømning prosedyren kan håndtere 96 prøver om gangen. er svært følsom, med proteinet oppdagelsen i hører området; og produserer svært reproduserbar skyldes automatisering. Alle disse aspektene er svært verdifull når antall prøver (f.eks, vevsprøver og biopsier) er en begrensende faktor. Teknikken har større programmer, inkludert screening av narkotika eller antistoffer, biomarkør oppdagelse og diagnostiske formål.

Utformingen av en ny analysen: En analysen plate layout er vist i figur 1A. Maksimalt, kan 96 brønner brukes fra 384-vel platen i blokker 12 brønner for hvert vilkår (antistoffer). Hver blokk 12 brønner kan starte fra A1-A12 eller A13-A24. Fargekodet rader tillater en å skille prøver eller reagenser fra hverandre. I analysen malen (figur 1B), relevant informasjon for det kan bestemte analysen lagres, og som...

Watch this Scientific Journal Video about Highly Sensitive and Quantitative Detection of Proteins and Their Isoforms by Capillary Isoelectric Focusing Method at JoVE.com

Highly Sensitive and Quantitative Detection of Proteins and Their Isoforms by Capillary Isoelectric Focusing Method

Kapillært isoelectric fokus er et antistoff-basert, ultrasensitive, høy gjennomstrømming teknikk, muliggjør detaljert karakterisering av proteiner og deres isoformene fra svært små biologiske prøver. Følgende beskriver en protokoll for oppdagelse og kvantifisering av spesifikke proteiner og deres isoformene i en automatisert og robotisert måte.

Svært Sensitive og kvantitative påvisning av proteiner og deres isoformene av kapillær Isoelectric fokuserer metoden

Immunoblotting has become a routine technique in many laboratories for protein characterization from biological samples. The following protocol provides ...

Denne metoden kan bidra til å svare på viktige spørsmål innen biomedisinsk forskningsfelt, som biomarkøroppdagelse, oppdagelse av narkotika, diagnostikk og screening av narkotika eller antistoffer. Den største fordelen med denne teknikken er at den er høy gjennomstrømning og kan oppdage proteinisoformer på en svært reproduserbar måte. Implikasjonene av denne teknikken strekker seg mot diagnosen av mange sykdommer fordi den kan måle berørte proteiner eller deres isoformer.Selv om denne metoden kan gi innsikt i cellesignalveier, kan den også brukes på andre systemer der spesifikke proteiner må analyseres. Visuell demonstrasjon av denne metoden er kritisk da analysetrinnene er vanskelige å lære på grunn av triksene, for eksempel å fjerne bobler, laste platen, et cetera. Først forberede en prøve fortynningsmiddel blanding ved å legge til en mikroliter av DMSO inhibitor blanding og to mikroliter protease hemmere til 47 mikroliter av prøve fortynningsmiddel, slik at den endelige konsentrasjonen av DMSO og protease hemmere er en X.Fortynne tidligere isolert protein lysates ved hjelp av prøve fortynningsmiddel blanding for å oppnå de ønskede konsentrasjoner.Deretter legger du til 3.325 mikroliter standard stige, seks mikroliter proteasehemmer og tre mikroliter DMSO-hemmer til 137.675 mikroliter antholitpremix. Vortex prøven minst 15 sekunder og holde på isen. Bland de to tilberedte løsningene i et ett til tre forhold slik at de endelige konsentrasjonene av DMSO proteasehemmere og isoelektrisk punktstandardstige er en X og proteinene i kapillæren når de endelige ønskede konsentrasjonene.Etter at proteinene er lagt til prøveblandingen, vil alle trinnene bli utført på is eller ved fire grader Celsius. Legg en 384-brønns tallerken på is. Legg ti mikroliter av prøveblandingen inn i riktig brønn av platen, i henhold til analysemaloppsettet designet med den automatiserte vestlige blottingsystemprogramvaren.Etter dette fortynner du de primære og sekundære antistoffene med antistofffortynningsmiddel. Deretter pipette ti mikroliter av primære antistoffer og 15 mikroliter sekundære antistoffer i hver brønn. Deretter blander luminol og peroksid XDR i et ett til ett forhold.Pipette 15 mikroliter av luminolperoksid blandes inn i hver brønn. Når prøvene og reagants er lagt til platen, sentrifuge i ti minutter på 2500 ganger G og fire grader Celsius å spinne ned væsken og fjerne boblene. Hvis det fortsatt finnes bobler, fjerner du dem manuelt ved hjelp av en tynn pipettespiss.Åpne den automatiserte Western blotting systemprogramvaren og klikk ny'fra filmenyen. Gå til oppsettruten og tilordne steder for reagants og prøver i 384-brønnplaten. Gjør en reagant oppgave ved å klikke på en brønn hvor som helst i blokken.Velg en radblokk med 12 brønner hver. Deretter går du til verktøylinjen i oppsettruten og setter inn en eksempel-, primær-, sekundær- eller luminolradblokk. Gå til protokollruten og velg en reagant plassering i platen.Deretter klikker du cellen i eksempelkolonnen og velger reagant fra rullegardinmenyen. På samme måte velger du reagant steder for den primære, sekundære, og luminol for hver syklus. Klikk cellene én om gangen i den primære eller sekundære antistoffkolonnen, og endre inkubasjonstidene om nødvendig.Deretter legger du til sykluser ved å klikke på Legg til-knappen i protokolldelen. I malruten angir du informasjon knyttet til eksemplet, for eksempel identiteten til de primære og sekundære antistoffene, katalognumrene og fortynningene. Lagre den nye analysefilen.Før du klikker på startknappen, må du raskt kontrollere oppsettet for å forsikre deg om at alt er riktig. Klikk start for å starte løpet. Programvaren vil be brukeren om å fjerne avfallet, å fylle på vann- og kapillærboksen, for å legge til olilitt og kataholitt i ressursskuffen, for å legge til vaskebuffer, og å legge platen inn i den avkjølte prøveskuffen.En instrumentstatuslinje vises på dataskjermen et par minutter etter at løpet har startet. Klikk på skjermbildet run summary'screen for å se status- og separasjonsrutene. For å observere elektroforeseparasjonen i en kapillær, spill separasjonsfilmen for det kapillære ved å klikke på ønsket syklus og deretter klikke på avspillingsknappen i kontrollpanelet.Åpne kjør-filen, og velg kategorien analyseskjerm. Klikk rediger'og deretter analyse'for å endre det isoelektriske punktområdet. Påfør riktig isoelektrisk punktstandard.Legg til en topppassform, og legg til et toppnavn. Til slutt velger du dataene som skal brukes i kategorien topper, og eksporterer dataene for videre analyse. Elektroferogramet av fosforylert ekstracellulære signalregulerte kinaser fra vaskulære endotelvekstfaktor stimulerte lysater er vist her.Det er svært høy induksjon av fosforylertproteiner observert med vaskulær endotelvekstfaktor. Innpunktet viser endogene lastekontroll, HSP 70, som indikerer lignende lasting av prøver for både ubehandlede og behandlede prøver. I en konvensjonell immunoblot ble bare to bånd oppdaget, selv om fosforylert ekstracellulære signalregulerte kinaseproteiner ble løst til fire topper ved kapillær isoelektrisk fokusanalyse.Elektroferogramet av ekstracellulære signalregulerte kinaser fra vaskulære endotelvekstfaktor stimulerte lysater er vist her. Inndatasettet viser den samme lastekontrollen som brukes parallelt. En konvensjonell immunoblot viser bare to bånd som tilsvarer ekstracellulære signalregulerte kinase en og ekstracellulær signalregulert kinase to.Mens med kapillær isoelektrisk fokusering ble de ekstracellulære signalregulerte kinaseproteinene løst til seks topper, tilsvarende alle fire forskjellige fosforylerte topper og to ukosforylerte topper. Når mestret, denne teknikken kan gjøres i noen timer, avhengig av antall sykluser, hvis det utføres riktig. Mens du prøver denne prosedyren, er det viktig å huske å bruke høyere antistoffkonsentrasjoner sammenlignet med konvensjonelle immunoblots.Visuell demonstrasjon av denne metoden er kritisk da analysetrinnene er vanskelige å lære på grunn av triks, for eksempel å fjerne bobler, laste platen, et cetera. Etter å ha sett denne videoen, bør du ha en god forståelse av hvordan du utformer en analyse, forbereder prøver, kjører analysen og analyserer dataene for å observere forskjellige isoformer av proteinet ditt.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Highly Sensitive and Rapid Fluorescence Detection with a Portable FRET Analyzer

Svært Sensitive og Rapid Fluorescence Detection med en bærbar FRET Analyzer

Recent improvements in F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) sensors have enabled their use to detect various small molecules including ions and ...

An Efficient Method for the Isolation of Highly Purified RNA from Seeds for Use in Quantitative Transcriptome Analysis

En effektiv metode for Isolering av høyt renset RNA fra frø for bruk i Quantitative Analysis transcriptome

Plant seeds accumulate large amounts of storage reserves comprising biodegradable organic matter. Humans rely on seed storage reserves for food and as ...

Capillary Electrophoresis Separation of Monoclonal Antibody Isoforms Using a Neutral Capillary

Kapillær elektroforese Separasjon av monoklonalt antistoff isoformer Ved hjelp av en nøytral kapillær

Biotherapeutic proteins, such as monoclonal antibodies (mAbs), are feasible alternatives for the treatment of chronic-degenerative diseases. The ...

Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

Metode for å visualisere og analysere Membran samspill proteiner av transmisjonselektronmikroskopi

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

Formation of Covalent DNA Adducts by Enzymatically Activated Carcinogens and Drugs In Vitro and Their Determination by 32P-postlabeling

Formation of Covalent DNA Adducts by Enzymatically Activated Carcinogens and Drugs In Vitro and Their Determination by 32P-postlabeling

Dannelsen av kovalente DNA-addukter av enzymatisk aktivert kreftfremkallende og narkotika In Vitro og deres vilje av 32P-postlabeling

Covalent DNA adducts formed by chemicals or drugs with carcinogenic potency are judged as one of the most important factors in the initiation phase of ...

Detection of Detergent-sensitive Interactions Between Membrane Proteins

Påvisning av vaskemiddel-sensitive interaksjoner mellom membran proteiner

Our ability to explore protein-protein interactions is the key to understanding regulatory connections in the cell. However, detection of protein-protein ...

Quantitative and Qualitative Method for Sphingomyelin by LC-MS Using Two Stable Isotopically Labeled Sphingomyelin Species

Kvantitative og kvalitative metode for Sphingomyelin av LC-MS bruker to stabil Isotopically merket Sphingomyelin arter

We present a method of analyzing sphingomyelin (SM) qualitatively and quantitatively by liquid chromatography-electrospray Ionization-tandem mass ...

Analysis of AtHIRD11 Intrinsic Disorder and Binding Towards Metal Ions by Capillary Gel Electrophoresis and Affinity Capillary Electrophoresis

Analyse av AtHIRD11 iboende forstyrrelse og bindende mot metall ioner av kapillær Gel gelelektroforese og affinitet kapillært geleelektroforese

Plants are strongly dependent on their environment. In order to adjust to stressful changes (e.g., drought and high salinity), higher plants evolve ...

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Deteksjon av Heterodimerization av Protein isoformene bruker in Situ nærhet Ligation analysen

Regulated protein-protein interactions are a guiding principle for many signaling events, and the detection of such events is an important element in ...

Use of Recombinant Fusion Proteins in a Fluorescent Protease Assay Platform and Their In-gel Renaturation

Bruk av rekombinant Fusion proteiner i en fluorescerende Protease analysen plattform og deres i-gel-Renaturation

Proteases are intensively studied enzymes due to their essential roles in several biological pathways of living organisms and in pathogenesis; therefore, ...