Name: highly sensitive and quantitative detection of proteins and their isoforms by capillary isoelectric focusing method
Uploaded: 2018-09-19T12:30:00
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O autor agradece Prof Lena Claesson-galês, Universidade de Uppsala, na Suécia, o seu apoio para o desenvolvimento deste projeto. Além disso, o autor agradece Ross Smith e Lena Claesson-galês, Universidade de Uppsala por sua leitura crítica e sugestões para melhorar o manuscrito.

1. cultura, estimulação e Lysis da pilha
Nota: Este método pode ser usado com muitos tipos de células. Para ilustrar o método, é descrito um exemplo usando células endoteliais da veia umbilical humana (HX).
<ol><li>Cultura HX na gelatina-revestido, os pratos de Petri de 10 cm em meio basal de células endoteliais com suplementação adequada (consulte Tabela de materiais) e também contendo 5% FCS, fator de crescimento epidérmico (5 ng/mL), fator de crescimento vascu...

<ol>
	<li>O'Neill, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isoelectric+focusing+technology+quantifies+protein+signaling+in+25+cells.">Isoelectric focusing technology quantifies protein signaling in 25 cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (44), 16153-16158 (2006).</li><li>Aspinall-O'Dea, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody-based+detection+of+protein+phosphorylation+status+to+track+the+efficacy+of+novel+therapies+using+nanogram+protein+quantities+from+stem+cells+and+cell+lines.">Antibody-based detection of protein phosphorylation status to track the efficacy of novel therapies using nanogram protein quantities from stem cells and cell lines.</a> Nat Protoc. 10 (1), 149-168 (2015).</li><li>Fan, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanofluidic+proteomic+assay+for+serial+analysis+of+oncoprotein+activation+in+clinical+specimens.">Nanofluidic proteomic assay for serial analysis of oncoprotein activation in clinical specimens.</a> Nat Med. 15 (5), 566-571 (2009).</li><li>Padhan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+sensitivity+isoelectric+focusing+to+establish+a+signaling+biomarker+for+the+diagnosis+of+human+colorectal+cancer.">High sensitivity isoelectric focusing to establish a signaling biomarker for the diagnosis of human colorectal cancer.</a> BMC Cancer. 16 (1), 683 (2016).</li><li>Sun, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGFR2+induces+c-Src+signaling+and+vascular+permeability+in+vivo+via+the+adaptor+protein+TSAd.">VEGFR2 induces c-Src signaling and vascular permeability in vivo via the adaptor protein TSAd.</a> J Exp Med. 209 (7), 1363-1377 (2012).</li><li>Iacovides, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+quantification+of+AKT+isoforms+and+phosphoforms+in+breast+cancer+using+a+novel+nanofluidic+immunoassay.">Identification and quantification of AKT isoforms and phosphoforms in breast cancer using a novel nanofluidic immunoassay.</a> Mol Cell Proteomics. 12 (11), 3210-3220 (2013).</li><li>Price, F. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+JAK-STAT+signaling+stimulates+adult+satellite+cell+function.">Inhibition of JAK-STAT signaling stimulates adult satellite cell function.</a> Nat Med. 20 (10), 1174-1181 (2014).</li><li>Unger, F. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoproteomic+analysis+of+ischemia-dependent+changes+in+signaling+protein+phosphorylation+in+colorectal+normal+and+cancer+tissue.">Nanoproteomic analysis of ischemia-dependent changes in signaling protein phosphorylation in colorectal normal and cancer tissue.</a> J Transl Med. 14, 6 (2016).</li><li>Urasaki, Y., Pizzorno, G., Le, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+uridine+administration+induces+fatty+liver+and+pre-diabetic+conditions+in+mice.">Chronic uridine administration induces fatty liver and pre-diabetic conditions in mice.</a> PLoS One. 11 (1), e0146994 (2016).</li><li>Schmidt, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Case-specific+potentiation+of+glioblastoma+drugs+by+pterostilbene.">Case-specific potentiation of glioblastoma drugs by pterostilbene.</a> Oncotarget. 7 (45), 73200-73215 (2016).</li></ol>

Sensibilidade e resolução de proteínas são cruciais para a investigação de proteomic em amostras biológicas. Há grande valor em ser capaz de detectar as proteínas que estão presentes em quantidades nas células. cIEF pode oferecer melhorou a sensibilidade e resolução para a detecção de proteínas e suas isoformas4.
Esta tecnologia tem sido usada com sucesso em muitos proteomic pesquisa relatórios5,6</su...

Focalização isoelétrica capilar (cIEF) é um imunoensaio automatizado, baseado em capilar que resolve as proteínas com base em sua carga1,2,3. É altamente reprodutível e capaz de resolver proteínas e suas isoformas post-translationally modificadas rapidamente e quantitativamente. Apresenta uma alternativa aos métodos convencionais, como mancha ocidental. Enquanto mancha ocidental é muito bom para confirmar a presença de proteínas abundantes nas amostras prontamente acessíveis; variabilidade, consumo de tempo e quantificação exacta todos os presentes desafios, nomeadamente aquando da análise de amostras de tecidos biológicos. De fato, a variabilidade é um problema inerente na mancha ocidental, pois há várias etapas envolvidas, tais como carregamento e execução de geles de SDS-PAGE, transferência de proteínas na membrana, incubação com vários reagentes (EG., primário e secundário anticorpos, ECL) e desenvolvimento para filme de raio-x4. Atualmente, a técnica de mancha ocidental está melhorando com a implementação de gravação digital de sinais quimioluminescente (Western digital). Recentemente, um sistema automatizado de mancha ocidental foi desenvolvido, nomeadamente o capilar ocidental, que é um sistema mais mãos-livres e sem gel. O ensaio inteiro é automático após o carregamento de um prato de amostras (amostras com todos os reagentes necessários) para o sistema de3,4. O instrumento irá executar todas as etapas, tais como a separação de proteínas, imobilização de proteínas na parede capilar, a incubação do anticorpo, lava entre diferentes etapas e desenvolvimento e quantificação dos sinais de quimioluminescência. Assim, o procedimento de cIEF aqui apresentado fornece maior resolução e sensibilidade.
Este método é sensível, como os sinais podem ser gerados e quantificados de picogramas de proteínas1. A elevada sensibilidade com excelente reprodutibilidade torna esta tecnologia muito útil para a análise de amostras clínicas. Ele pode detectar bem como distinguir post translacional modificação (por exemplo, proteína fosforilada diferentes isoformas) de proteínas. Esta tecnologia tem sido usada com sucesso para dissecar diferentes sinalização percursos4,5 em estudos clínicos, com o objetivo de desenvolver novas terapêuticas em câncer3, e tem grande potencial para a descoberta de biomarcadores e drogas de proteína .

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="920">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:367px;">NanoPro 1000</td>
			<td style="width:107px;">ProteinSimple</td>
			<td style="width:301px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Premix G2, pH 5&#8211;8 (nested) separation gradient, pH 2&#8211;4 plug</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-972</td>
			<td>Ampholyte premix</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DMSO inhibitor mix</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-510</td>
			<td>Phosphatase inhibitors; for cIEF 1:50 dilution used</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Aqueous Inhibitor Mix</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-482</td>
			<td>Protease inhibitor; for cIEF 1:25 dilution used</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">pI standard ladder 3</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-646</td>
			<td>For cIEF 1:60 dilution used</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sample diluent</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-649</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Antibody diluent&#160;</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Wash concentrate</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>041-108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Anolyte Refill</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Catholyte Refill</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-338</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Peroxide XDR</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>041-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Luminol</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Bicine/CHAPS Lysis Buffer</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Capillaries-Charge Separation (1 pack) for&#160;</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>CBS700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Assay Plate/Lid Kit</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Peroxidase-AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)&#160;</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch&#160;</td>
			<td>711-035-152</td>
			<td>For cIEF used (1: 300)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Peroxidase-AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)&#160;</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch&#160;</td>
			<td>715-035-150</td>
			<td>For cIEF used (1: 300)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Phospho-Erk 1/2 Primary Antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9101</td>
			<td>For cIEF used (1: 50)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Pan Erk Primary Antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9102</td>
			<td>For cIEF used (1: 100)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Compass software</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">HUVEC</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>PCS-100-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MV2 (EBM-2)</td>
			<td>PromoCell</td>
			<td>&#160;C-22221</td>
			<td>Endothelia cell basal medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Endothelial Cell Growth Medium MV2 SupplementPack</td>
			<td>PromoCell</td>
			<td>C-39221</td>
			<td>Supplementation to MV2 above</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">VEGFA</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Long R3 IGF</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>85580C/I1146</td>
			<td>Insulin-like growth factor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bioruptor (Sonicator)</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>B01020001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BCA Protein Assay kit&#160;</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>NP0322BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NuPAG MOPS SDS Running Buffer (20X)</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>NP0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NuPAGE Transfer Buffer (20X)</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>NP0006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Immobilon PVDF membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microfuge tube vortexer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Microtiter plate adapter for centrifuge</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Pipettors&#160;</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Tips</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Ice</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

highly sensitive and quantitative detection of proteins and their isoforms by capillary isoelectric focusing method

Immunoblotting tornou-se uma técnica de rotina em muitos laboratórios para caracterização de proteínas de amostras biológicas. O protocolo seguinte fornece uma estratégia alternativa, capilar isoeléctrico de focagem (cIEF), com muitas vantagens em relação ao convencional immunoblotting. Este é um método baseado em anticorpos, automatizado, rápido e quantitativo, em que um procedimento completo de mancha ocidental ocorre dentro de um capilar ultrafino. Esta técnica não exigem um gel para transferir a uma membrana, remoção de manchas, ou filmes, que são geralmente necessários para immunoblotting convencional de raios-x. Aqui, as proteínas são separadas de acordo com sua carga (ponto isoelétrico; pI), usando menos do que um microlitro (400 nL) de lisado de proteína total. Após a electroforese, proteínas são imobilizadas nas paredes capilares por tratamento com luz ultravioleta, seguido pelo primário e secundário (peroxidase de rábano (HRP) conjugado) reforçada de incubação do anticorpo, cuja ligação é detectada através de quimioluminescência (ECL), gerando um sinal luminoso que pode ser capturado e gravado por uma câmera do dispositivo de carga acoplada (CCD). A imagem digital pode ser analisada e quantificado (área do pico) utilizando o software. Este procedimento de alta taxa de transferência pode manipular 96 amostras de cada vez; é altamente sensível, com deteção de proteína na faixa de picograma; e produz resultados altamente reprodutível devido à automação. Todos estes aspectos são extremamente valiosos, quando a quantidade de amostras (por exemplo, amostras de tecidos e biópsias) é um fator limitante. A técnica tem aplicações mais amplas, incluindo rastreio de drogas ou anticorpos, descoberta de biomarker e fins de diagnóstico.

Design de um novo ensaio: Um layout de placa de ensaio é mostrado na figura 1A. Màxima, 96 poços podem ser usados na placa de 384 em blocos de 12 poços para cada condição (anticorpo). Cada bloco de 12 poços pode começar na A1-A12 ou A13-A24. Linhas de código de cores permitem distinguir amostras ou reagentes de um para o outro. No modelo de ensaio (figura 1B), as informações pertinentes para que pode s...

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Highly Sensitive and Quantitative Detection of Proteins and Their Isoforms by Capillary Isoelectric Focusing Method

Isoeléctrica capilar é uma técnica baseada em anticorpos, ultra-sensível, alta taxa de transferência, permitindo a caracterização detalhada de proteínas e suas isoformas das amostras biológicas extremamente pequenas. A seguir descreve um protocolo para a detecção e quantificação de proteínas específicas e suas isoformas de forma automatizada e robotizada.

Detecção altamente sensível e quantitativa de proteínas e suas isoformas pelo método isoeléctrica capilar

Immunoblotting has become a routine technique in many laboratories for protein characterization from biological samples. The following protocol provides ...

Esse método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo da pesquisa biomédica, como descoberta de biomarcadores, descoberta de medicamentos, diagnósticos e triagem de drogas ou anticorpos. A principal vantagem dessa técnica é que ela é de alto rendimento e pode detectar isoformas proteicos de forma altamente reprodutível. As implicações dessa técnica se estendem para o diagnóstico de muitas doenças, pois pode medir proteínas afetadas ou suas isoformas.Embora este método possa fornecer informações sobre caminhos de sinalização celular, ele também pode ser aplicado a outros sistemas onde proteínas específicas precisam ser analisadas. A demonstração visual deste método é fundamental, pois os passos de ensaio são difíceis de aprender por causa dos truques, como remover bolhas, carregar a placa, etc. Primeiro, prepare uma mistura diluída amostra, adicionando um microliter de mistura inibidora de DMSO e dois microliters de inibidores de protease a 47 microliters de diluentes amostrais diluídos, de modo que a concentração final de inibidores de DMSO e protease seja um X.Diluir os lises proteicos anteriormente isolados usando a mistura diluidora da amostra para obter as concentrações desejadas.Em seguida, adicione 3.325 microliters de escada padrão, seis microliters de inibidor de protease, e três microliters de inibidor DMSO a 137.675 microliters de antolito pré-luz. Vórtice a amostra pelo menos 15 segundos e manter no gelo. Misture as duas soluções preparadas em uma proporção de um a três para que as concentrações finais dos inibidores de protease DMSO e da escada padrão de ponto isoelétrico sejam de um X e as proteínas no capilar atinjam as concentrações finais desejadas.Depois que as proteínas forem adicionadas à mistura de amostras, todas as etapas serão realizadas no gelo ou a quatro graus Celsius. Coloque uma placa de 384 poços no gelo. Carregue dez microliters da amostra se misture no poço apropriado da placa, de acordo com o layout do modelo de ensaio projetado com o software automatizado do sistema de manchas ocidentais.Na sequência, dilui os anticorpos primários e secundários com anticorpos diluídos. Em seguida, pipeta dez microliters de anticorpos primários e 15 microliters de anticorpos secundários em cada poço. Em seguida, misture o XDR de luminol e peróxido em uma proporção de um para um.Pipeta 15 microliters da mistura de peróxido de luminol em cada poço. Uma vez que as amostras e reagants tenham sido adicionados à placa, centrífuga por dez minutos a 2500 vezes G e quatro graus Celsius para girar o líquido e remover as bolhas. Se ainda existirem bolhas, remova-as manualmente usando uma ponta fina de pipeta.Abra o software automatizado do sistema de manchas ocidentais e clique em novo'do menu de arquivos. Vá para o painel de layout e atribua locais para reagants e amostras na placa de 384 poços. Faça uma tarefa reagant clicando em um poço em qualquer lugar do bloco.Selecione um bloco de linha de 12 poços cada. Em seguida, vá para a barra de ferramentas do painel de layout e insira um bloco de linha de amostra, primário, secundário ou luminol. Vá para o painel de protocolo e selecione um local reagant na placa.Em seguida, clique na célula na coluna de amostra e selecione o reagant no menu suspenso. Da mesma forma, selecione os locais reagant para o principal, secundário e luminol para cada ciclo. Clique nas células uma de cada vez na coluna de anticorpos primários ou secundários e altere os tempos de incubação, se necessário.Em seguida, adicione ciclos clicando no botão Adicionar na seção protocolo. No painel de modelos, insira informações relativas à amostra, como a identidade dos anticorpos primários e secundários, seus números de catálogo e diluições. Salve o novo arquivo de ensaio.Antes de clicar no botão iniciar, verifique rapidamente o layout para ter certeza de que tudo está correto. Agora, clique em iniciar a corrida. O software solicitará ao usuário que remova os resíduos, reabastegue a água e a caixa capilar, adicione anolite e católito à bandeja de recursos, adicione o buffer de lavagem e carregue a placa na bandeja de amostra resfriada.Uma barra de status do instrumento será exibida na tela do computador alguns minutos após o início da execução. Clique na tela de resumo de execução para ver o status e os painéis de separação. Para observar a separação da eletroforese em um capilar, reprodute o filme de separação para esse capilar clicando no ciclo desejado e, em seguida, clicando no botão de reprodução no painel de controle.Abra o arquivo de execução e selecione a guia de tela de análise. Clique em editar'e, em seguida, análise'para alterar o intervalo de pontos isoelétricos. Aplique o padrão de ponto isoelétrico apropriado.Adicione um ajuste de pico e adicione um nome de pico. Finalmente, selecione os dados para usar na guia picos e exporte os dados para análise suplementar. O eletroferograma de cinesases extracelulares extracelulares fosforilaladas de lises estimuladas pelo fator de crescimento endotelial vascular é mostrado aqui.Há uma indução muito alta de proteínas fosfoiladas observadas com fator de crescimento endotelial vascular. O inset mostra o controle de carregamento endógeno, HSP 70, indicando carregamento semelhante de amostras para amostras não tratadas e tratadas. Em um imunoblot convencional, apenas duas bandas foram detectadas, embora as proteínas de quinase extracelular reguladas por sinal fosforilado tenham sido resolvidas em quatro picos pela análise isoelétrica capilar.O eletroferograma de quinases extracelulares reguladas por sinal de lises estimuladas pelo fator de crescimento endotelial vascular é mostrado aqui. O inset mostra o mesmo controle de carregamento usado em paralelo. Um imunoblot convencional mostra apenas duas bandas correspondentes à quinase extracelular regulada por sinal e quinase extracelular regulada por sinal dois.Considerando que com o foco isoelétrico capilar, as proteínas de quinase extracelular reguladas pelo sinal foram resolvidas em seis picos, correspondendo a todos os quatro picos fosfoilados diferentes e dois picos não fosfoilados. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em poucas horas, dependendo do número de ciclos, se for realizada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de usar concentrações de anticorpos mais altas em comparação com os imunoblots convencionais.A demonstração visual deste método é fundamental, pois os passos de ensaio são difíceis de aprender por causa de truques, como remover bolhas, carregar a placa, etc. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como projetar um ensaio, preparar amostras, executar o ensaio e analisar os dados para observar diferentes isoformas de sua proteína.

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