Name: highly sensitive and quantitative detection of proteins and their isoforms by capillary isoelectric focusing method
Uploaded: 2018-09-19T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Highly Sensitive and Quantitative Detection of Proteins and Their Isoforms by Capillary Isoelectric Focusing Method at JoVE.com

Автор благодарит Claesson профессор Лена-валлийский, Университет Уппсалы, Швеция для ее поддержки для разработки этого проекта. Кроме того Автор благодарит Росс Смит и Клаессон Лена-валлийский, Уппсальского университета за их критического чтения и предложения для улучшения рукопись.

1. клетки культуры, стимуляции и Lysis
Примечание: Этот метод может использоваться с многие типы клеток. Чтобы проиллюстрировать метод, описан пример использования человеческого пупочную вену эндотелиальных клеток (HUVECs).
<ol><li>Культура HUVECs на желатин покрытием, 10 см Петри в ?...

<ol>
	<li>O'Neill, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isoelectric+focusing+technology+quantifies+protein+signaling+in+25+cells.">Isoelectric focusing technology quantifies protein signaling in 25 cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (44), 16153-16158 (2006).</li><li>Aspinall-O'Dea, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody-based+detection+of+protein+phosphorylation+status+to+track+the+efficacy+of+novel+therapies+using+nanogram+protein+quantities+from+stem+cells+and+cell+lines.">Antibody-based detection of protein phosphorylation status to track the efficacy of novel therapies using nanogram protein quantities from stem cells and cell lines.</a> Nat Protoc. 10 (1), 149-168 (2015).</li><li>Fan, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanofluidic+proteomic+assay+for+serial+analysis+of+oncoprotein+activation+in+clinical+specimens.">Nanofluidic proteomic assay for serial analysis of oncoprotein activation in clinical specimens.</a> Nat Med. 15 (5), 566-571 (2009).</li><li>Padhan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+sensitivity+isoelectric+focusing+to+establish+a+signaling+biomarker+for+the+diagnosis+of+human+colorectal+cancer.">High sensitivity isoelectric focusing to establish a signaling biomarker for the diagnosis of human colorectal cancer.</a> BMC Cancer. 16 (1), 683 (2016).</li><li>Sun, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGFR2+induces+c-Src+signaling+and+vascular+permeability+in+vivo+via+the+adaptor+protein+TSAd.">VEGFR2 induces c-Src signaling and vascular permeability in vivo via the adaptor protein TSAd.</a> J Exp Med. 209 (7), 1363-1377 (2012).</li><li>Iacovides, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+quantification+of+AKT+isoforms+and+phosphoforms+in+breast+cancer+using+a+novel+nanofluidic+immunoassay.">Identification and quantification of AKT isoforms and phosphoforms in breast cancer using a novel nanofluidic immunoassay.</a> Mol Cell Proteomics. 12 (11), 3210-3220 (2013).</li><li>Price, F. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+JAK-STAT+signaling+stimulates+adult+satellite+cell+function.">Inhibition of JAK-STAT signaling stimulates adult satellite cell function.</a> Nat Med. 20 (10), 1174-1181 (2014).</li><li>Unger, F. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoproteomic+analysis+of+ischemia-dependent+changes+in+signaling+protein+phosphorylation+in+colorectal+normal+and+cancer+tissue.">Nanoproteomic analysis of ischemia-dependent changes in signaling protein phosphorylation in colorectal normal and cancer tissue.</a> J Transl Med. 14, 6 (2016).</li><li>Urasaki, Y., Pizzorno, G., Le, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+uridine+administration+induces+fatty+liver+and+pre-diabetic+conditions+in+mice.">Chronic uridine administration induces fatty liver and pre-diabetic conditions in mice.</a> PLoS One. 11 (1), e0146994 (2016).</li><li>Schmidt, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Case-specific+potentiation+of+glioblastoma+drugs+by+pterostilbene.">Case-specific potentiation of glioblastoma drugs by pterostilbene.</a> Oncotarget. 7 (45), 73200-73215 (2016).</li></ol>

Чувствительность и разрешение белки имеют решающее значение для протеомических исследований биологических образцов. Существует большое значение в состоянии обнаружить белки, которые присутствуют в минуту количествах в клетках. Главный может предложить улучшена чувствительность и ?...

Капиллярные изоэлектрической упором (главный) является автоматизированной, основанный на капиллярной иммуноанализ, устраняющее белков на основе их заряда1,2,3. Это очень воспроизводимость и способный разрешать белков и их post-translationally модифицированных изоформ быстро и количественно. Она представляет альтернативу обычные методы, такие как Западный blotting. В то время как Западный blotting очень хорошо для подтверждающих наличие обильные белков в легкодоступном образцов; изменчивость, время потребления и точный количественный всех присутствующих задач, в частности при рассмотрении образцы биологических тканей. Действительно, изменчивость присущие проблема в Западный blotting, как есть многочисленные шаги, связанные, например, загрузки и запуска гелях SDS-PAGE, перенос белков на мембраны, инкубации с различными реагентами (например., начальное и среднее антитела, ЭСЛ) и развитие на рентгеновской пленки4. В настоящее время западные blotting метод улучшается с осуществлением цифровой записи хемилюминесцентный сигналов (цифровой вестерны). Недавно автоматизированная система западных blotting был разработан, а именно капилляра Западной, которая является более свободные руки и гель свободной системы. Весь assay автоматически после загрузки образца пластины (образцы с всеми необходимыми реагентами) в системе3,4. Инструмент будет выполнять все шаги, такие, как разделение белков, иммобилизации белков на капиллярной стенки, инкубаций антитела, моет между различные шаги и развитием и количественная оценка хемилюминесцентный сигналов. Таким образом главный представленные здесь приведен выше разрешение и чувствительность.
Этот метод является чувствительной, как сигналы могут быть созданы и количественно от пикограмм1белки. Высокая чувствительность с отличную воспроизводимость делает эту технологию очень полезным для анализа клинических образцов. Он может обнаружить, а также отличить пост поступательные изменения (например, различные фосфорилированных белка изоформ) белков. Эта технология успешно используется для рассечения различных сигнальных путей4,5 , в клинических исследованиях, направленных на разработку новой терапии рака3, и он имеет большой потенциал для обнаружения белковых биомаркеров и наркотиков .

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="920">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:367px;">NanoPro 1000</td>
			<td style="width:107px;">ProteinSimple</td>
			<td style="width:301px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Premix G2, pH 5&#8211;8 (nested) separation gradient, pH 2&#8211;4 plug</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-972</td>
			<td>Ampholyte premix</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DMSO inhibitor mix</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-510</td>
			<td>Phosphatase inhibitors; for cIEF 1:50 dilution used</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Aqueous Inhibitor Mix</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-482</td>
			<td>Protease inhibitor; for cIEF 1:25 dilution used</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">pI standard ladder 3</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-646</td>
			<td>For cIEF 1:60 dilution used</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sample diluent</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-649</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Antibody diluent&#160;</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Wash concentrate</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>041-108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Anolyte Refill</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Catholyte Refill</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-338</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Peroxide XDR</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>041-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Luminol</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Bicine/CHAPS Lysis Buffer</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Capillaries-Charge Separation (1 pack) for&#160;</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>CBS700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Assay Plate/Lid Kit</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Peroxidase-AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)&#160;</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch&#160;</td>
			<td>711-035-152</td>
			<td>For cIEF used (1: 300)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Peroxidase-AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)&#160;</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch&#160;</td>
			<td>715-035-150</td>
			<td>For cIEF used (1: 300)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Phospho-Erk 1/2 Primary Antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9101</td>
			<td>For cIEF used (1: 50)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Pan Erk Primary Antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9102</td>
			<td>For cIEF used (1: 100)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Compass software</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">HUVEC</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>PCS-100-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MV2 (EBM-2)</td>
			<td>PromoCell</td>
			<td>&#160;C-22221</td>
			<td>Endothelia cell basal medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Endothelial Cell Growth Medium MV2 SupplementPack</td>
			<td>PromoCell</td>
			<td>C-39221</td>
			<td>Supplementation to MV2 above</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">VEGFA</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Long R3 IGF</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>85580C/I1146</td>
			<td>Insulin-like growth factor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bioruptor (Sonicator)</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>B01020001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BCA Protein Assay kit&#160;</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>NP0322BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NuPAG MOPS SDS Running Buffer (20X)</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>NP0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NuPAGE Transfer Buffer (20X)</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>NP0006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Immobilon PVDF membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microfuge tube vortexer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Microtiter plate adapter for centrifuge</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Pipettors&#160;</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Tips</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Ice</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

highly sensitive and quantitative detection of proteins and their isoforms by capillary isoelectric focusing method

Immunoblotting стала обычной техники во многих лабораториях для характеризации белка из биологических образцов. Следующий протокол предоставляет альтернативную стратегию, капиллярные изоэлектрической фокусировки (главный), с много преимуществ по сравнению с обычными immunoblotting. Это на основе антител, автоматизированных, быстрое и количественный метод, в котором полный западных blotting процедуры происходит внутри ультратонких капилляров. Этот метод не требует гель для передачи мембраны, зачистки помарки, или рентгеновские пленки, которые обычно требуются для обычных immunoblotting. Здесь, протеины разделены согласно их заряда (Изоэлектрическая точка; Пи), используя меньше, чем микролитр (400 nL) общего белка lysate. После электрофореза, белки являются иммобилизованных на стенки капилляров, ультрафиолетовый свет лечения, следуют первичный и вторичный (пероксидазы (ПХ) конъюгированных) Антитело инкубации, привязку которого обнаруживается через расширение Хемилюминесценция (ЭСЛ), создавая световой сигнал, который может быть захвачен и Записанная камерой зарядовой (связью ПЗС). Цифровые изображения могут быть проанализированы и количественно (площадь пика) с помощью программного обеспечения. Эта процедура высокая пропускная способность может обрабатывать 96 образцов одновременно; очень чувствительна, с обнаружением белка в диапазоне пикограмм; и производит высоко воспроизводимые результаты благодаря автоматизации. Все эти аспекты являются чрезвычайно ценными, когда количество образцов (например, образцы тканей и биопсии) является ограничивающим фактором. Методика имеет более широкое применение, включая скрининг наркотиков или антител, открытия биомаркеров и диагностических целей.

Дизайн новой пробирного: Пробирного пластины схема приведена на рисунке 1A. Максимально 96 скважин может использоваться от 384-ну пластины в блоках 12 скважин для каждого условия (антител). Каждый блок 12 скважин можно запустить либо из A1-A12 и A13-A24. Цв...

Watch this Scientific Journal Video about Highly Sensitive and Quantitative Detection of Proteins and Their Isoforms by Capillary Isoelectric Focusing Method at JoVE.com

Highly Sensitive and Quantitative Detection of Proteins and Their Isoforms by Capillary Isoelectric Focusing Method

Капиллярного изоэлектрической фокусировки является метод на основе антител, сверхчувствительная, высокая пропускная способность, позволяя подробную характеристику белков и их изоформы биологических пробах крайне мала. Ниже описывается протокол для обнаружения и количественного определения специфических белков и их изоформы автоматизированные и роботизированные образом.

Весьма деликатного и количественного обнаружения белков и их изоформы методом капиллярной изоэлектрической упором

Immunoblotting has become a routine technique in many laboratories for protein characterization from biological samples. The following protocol provides ...

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области биомедицинских исследований, такие как открытие биомаркеров, открытие лекарств, диагностика и скрининг лекарств или антител. Основным преимуществом этого метода является то, что он имеет высокую пропускную способность и может обнаруживать белковые изоформы в высоко воспроизводимой манере. Последствия этого метода распространяются на диагностику многих заболеваний, поскольку он может измерять пораженные белки или их изоформы.Хотя этот метод может дать представление о путях сигнализации клеток, он также может быть применен к другим системам, где конкретные белки должны быть проанализированы. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, как анализ шаги трудно узнать из-за трюков, таких как удаление пузырьков, загрузка пластины, и так далее. Во-первых, подготовить образец разбавляя смесь, добавив один микролитер ингибитора DMSO смеси и два микролитров ингибиторов протеазы до 47 микролитров разбавления образца, так что окончательная концентрация DMSO и ингибиторы протеазы является одним X.Dilute ранее изолированных белковых лизатов с использованием образца разбавляя смесь для получения желаемых концентраций.Далее добавьте 3,325 микролитров стандартной лестницы, шесть микролитров ингибитора протеазы и три микролитера ингибитора DMSO до 137,675 микролитров анолитного премикса. Вихрь образца по крайней мере 15 секунд и держать на льду. Смешайте два подготовленных раствора в соотношении один-три, чтобы окончательные концентрации ингибиторов протеазы DMSO и стандартной лестницы изоэлектрической точки были одним X, а белки в капилляре достигли конечных желаемых концентраций.После того, как белки добавляются в образец смеси, все шаги будут выполняться на льду или при четырех градусах Цельсия. Поместите 384-хорошо пластины на льду. Загрузите десять микролитров смеси образца в соответствующий колодец пластины, согласно макету шаблона анализа, разработанному с помощью автоматизированного программного обеспечения западной системы blotting.После этого разбавляют первичные и вторичные антитела разбавлением антител. Затем пипетка десять микролитров первичных антител и 15 микролитров вторичных антител в каждую колодец. Затем смешайте люминол и перекись XDR в соотношении один к одному.Pipette 15 микролитров перекиси люминола смешивают в каждую колодец. После того, как образцы и reagants были добавлены в тарелку, центрифуга в течение десяти минут при 2500 раз G и четыре градуса по Цельсию, чтобы спина вниз жидкости и удалить пузырьки. Если пузырьки все еще существуют, удалите их вручную, используя тонкий наконечник пипетки.Откройте автоматизированное программное обеспечение западной системы blotting и нажмите new'from меню файлов. Перейти к макет панели и назначить места для reagants и образцов в 384-хорошо пластины. Сделайте reagant назначение, нажав на колодец в любом месте блока.Выберите ряд блока по 12 скважин каждый. Далее перейдите на панели инструментов макета и вставьте образец, первичный, вторичный или люминол строки блока. Перейдите на протокольный стекоть и выберите место рейганта в тарелке.Затем нажмите ячейку в столбце образца и выберите reagant из выпадают меню. Таким же образом, выберите рейгант места для первичного, вторичного и люминола для каждого цикла. Нажмите на клетки по одному в первичном или вторичном столбце антитела и при необходимости измените время инкубации.Затем добавьте циклы, нажав кнопку Add'button в разделе протокола. В панели шаблона введите информацию, относящуюся к образцу, такую как идентичность первичных и вторичных антител, их номера каталога и разбавления. Сохраните новый файл анализа.Перед нажатием кнопки start'button быстро проверьте макет, чтобы убедиться, что все правильно. Теперь нажмите start'to начать запуск. Программное обеспечение будет побуждать пользователя удалить отходы, пополнить воду и капиллярную коробку, добавить анолит и католит в лоток ресурса, добавить буфер стирки, а также загрузить пластину в охлажденный лоток образца.Панель состояния инструмента будет отображаться на экране компьютера через пару минут после начала запуска. Нажмите на сводку запуска, чтобы увидеть панели состояния и разделения. Чтобы наблюдать разделение электрофорез в капилляре, играть фильм разделения для этого капилляра, нажав на желаемый цикл, а затем нажав кнопку воспроизведения в панели управления.Откройте файл запуска и выберите вкладку экрана анализа. Нажмите edit'and'and'to изменить диапазон точков. Применить соответствующий стандарт изоэлектрической точки.Добавьте пик подгонки и добавьте пиковое имя. Наконец, выберите данные для использования во вкладке пиков и экспорт данных для дальнейшего анализа. Здесь показана электроферограмма фосфорилированных внеклеточных сигнальных киназы из сосудистого эндотелиального фактора роста, стимулируемого лисатами.Наблюдается очень высокая индукция фосфорилированных белков с сосудистым эндотелиальным фактором роста. Вставка показывает эндогенный контроль погрузки, HSP 70, что указывает на аналогичную загрузку образцов как для необработанных, так и для обработанных образцов. В обычном иммуноблоте были обнаружены только две полосы, несмотря на то, что фосфорилированные внеклеточные сигнально-регулируемые белки киназы были решены в четыре пика капиллярным изоэлектрическим фокусирующим анализом.Здесь показана электроферограмма внеклеточных сигнально-регулируемых киназо из сосудистых эндотелиальных факторов роста, стимулируемых лисатами. Вставка показывает тот же контроль загрузки, используемый параллельно. Обычный иммунобло показывает только две полосы, соответствующие внеклеточной сигнал-регулируемой киназы один и внеклеточный сигнал регулируется киназы два.В то время как с капиллярной изоэлектрической фокусировки, внеклеточный сигнал регулируется киназы белки были решены в шесть пиков, что соответствует всем четырем различным фосфорилированных пиков и два не-фосфорилированных пиков. После освоения, этот метод может быть сделано в течение нескольких часов, в зависимости от количества циклов, если она выполняется должным образом. При попытке этой процедуры, важно помнить, чтобы использовать более высокие концентрации антител по сравнению с обычными иммуноблотами.Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, как анализ шаги трудно узнать из-за трюков, таких как удаление пузырьков, загрузка пластины, и так далее. После просмотра этого видео, вы должны иметь хорошее понимание того, как разработать анализ, подготовить образцы, запустить анализ, и анализировать данные для наблюдения различных изоформ вашего белка.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Highly Sensitive and Rapid Fluorescence Detection with a Portable FRET Analyzer

Высокочувствительных и быстрое обнаружение флуоресценция с помощью портативного анализатора FRET

Recent improvements in F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) sensors have enabled their use to detect various small molecules including ions and ...

An Efficient Method for the Isolation of Highly Purified RNA from Seeds for Use in Quantitative Transcriptome Analysis

Эффективный метод для выделения высокоочищенного РНК из семян для использования в количественном анализе Транскриптом

Plant seeds accumulate large amounts of storage reserves comprising biodegradable organic matter. Humans rely on seed storage reserves for food and as ...

Capillary Electrophoresis Separation of Monoclonal Antibody Isoforms Using a Neutral Capillary

Капиллярный электрофорез Разделение моноклональных антител изоформ с нейтральным капилляра

Biotherapeutic proteins, such as monoclonal antibodies (mAbs), are feasible alternatives for the treatment of chronic-degenerative diseases. The ...

Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

Метод визуализации и анализа Мембранные белков, взаимодействующих с помощью просвечивающей электронной микроскопии

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

Formation of Covalent DNA Adducts by Enzymatically Activated Carcinogens and Drugs In Vitro and Their Determination by 32P-postlabeling

Formation of Covalent DNA Adducts by Enzymatically Activated Carcinogens and Drugs In Vitro and Their Determination by 32P-postlabeling

Образования ковалентной ДНК аддукты ферментативно активированные канцерогенов и наркотиков в пробирке и их решимость по 32P-postlabeling

Covalent DNA adducts formed by chemicals or drugs with carcinogenic potency are judged as one of the most important factors in the initiation phase of ...

Detection of Detergent-sensitive Interactions Between Membrane Proteins

Обнаружение моющих средств чувствительных взаимодействия между мембранные белки

Our ability to explore protein-protein interactions is the key to understanding regulatory connections in the cell. However, detection of protein-protein ...

Quantitative and Qualitative Method for Sphingomyelin by LC-MS Using Two Stable Isotopically Labeled Sphingomyelin Species

Количественные и качественные метод сфингомиелин, LC-MS, с использованием двух стабильных гетерогенны помечены виды сфингомиелин

We present a method of analyzing sphingomyelin (SM) qualitatively and quantitatively by liquid chromatography-electrospray Ionization-tandem mass ...

Analysis of AtHIRD11 Intrinsic Disorder and Binding Towards Metal Ions by Capillary Gel Electrophoresis and Affinity Capillary Electrophoresis

Анализ AtHIRD11 внутренние беспорядки и привязки к ионов металлов Капиллярный электрофорез и близость капиллярного электрофореза

Plants are strongly dependent on their environment. In order to adjust to stressful changes (e.g., drought and high salinity), higher plants evolve ...

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Обнаружение Heterodimerization изоформ белка, используя Assay в Situ близости лигирование

Regulated protein-protein interactions are a guiding principle for many signaling events, and the detection of such events is an important element in ...

Use of Recombinant Fusion Proteins in a Fluorescent Protease Assay Platform and Their In-gel Renaturation

Использование рекомбинантных Fusion белков в платформу Assay флуоресцентные протеазы и их выемка в гель

Proteases are intensively studied enzymes due to their essential roles in several biological pathways of living organisms and in pathogenesis; therefore, ...