Name: highly sensitive and quantitative detection of proteins and their isoforms by capillary isoelectric focusing method
Uploaded: 2018-09-19T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Highly Sensitive and Quantitative Detection of Proteins and Their Isoforms by Capillary Isoelectric Focusing Method at JoVE.com

Författaren tack Prof. Lena Claesson-Welsh, Uppsala universitet för hennes stöd för att utveckla detta projekt. Dessutom tack författaren Ross Smith och Lena Claesson-Welsh, Uppsala universitet för deras kritisk läsning och förslag för att förbättra manuskriptet.

1. cell kultur, stimulering och Lysis
Obs: Denna metod kan användas med många celltyper. För att illustrera metoden, beskrivs ett exempel som använder mänskliga navel ven endotelceller (HUVECs).
<ol><li>Kultur HUVECs på gelatin-belagd, 10 cm petriskålar i endotelceller basala medium med lämpligt tillskott (se Tabell för material), och som också innehåller 5% FCS, epidermal tillväxtfaktor (5 ng/mL), vaskulär endotelial tillväxtfaktor (VEGF: 0,5 ng/mL), grundläg...

<ol>
	<li>O'Neill, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isoelectric+focusing+technology+quantifies+protein+signaling+in+25+cells.">Isoelectric focusing technology quantifies protein signaling in 25 cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (44), 16153-16158 (2006).</li><li>Aspinall-O'Dea, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody-based+detection+of+protein+phosphorylation+status+to+track+the+efficacy+of+novel+therapies+using+nanogram+protein+quantities+from+stem+cells+and+cell+lines.">Antibody-based detection of protein phosphorylation status to track the efficacy of novel therapies using nanogram protein quantities from stem cells and cell lines.</a> Nat Protoc. 10 (1), 149-168 (2015).</li><li>Fan, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanofluidic+proteomic+assay+for+serial+analysis+of+oncoprotein+activation+in+clinical+specimens.">Nanofluidic proteomic assay for serial analysis of oncoprotein activation in clinical specimens.</a> Nat Med. 15 (5), 566-571 (2009).</li><li>Padhan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+sensitivity+isoelectric+focusing+to+establish+a+signaling+biomarker+for+the+diagnosis+of+human+colorectal+cancer.">High sensitivity isoelectric focusing to establish a signaling biomarker for the diagnosis of human colorectal cancer.</a> BMC Cancer. 16 (1), 683 (2016).</li><li>Sun, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGFR2+induces+c-Src+signaling+and+vascular+permeability+in+vivo+via+the+adaptor+protein+TSAd.">VEGFR2 induces c-Src signaling and vascular permeability in vivo via the adaptor protein TSAd.</a> J Exp Med. 209 (7), 1363-1377 (2012).</li><li>Iacovides, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+quantification+of+AKT+isoforms+and+phosphoforms+in+breast+cancer+using+a+novel+nanofluidic+immunoassay.">Identification and quantification of AKT isoforms and phosphoforms in breast cancer using a novel nanofluidic immunoassay.</a> Mol Cell Proteomics. 12 (11), 3210-3220 (2013).</li><li>Price, F. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+JAK-STAT+signaling+stimulates+adult+satellite+cell+function.">Inhibition of JAK-STAT signaling stimulates adult satellite cell function.</a> Nat Med. 20 (10), 1174-1181 (2014).</li><li>Unger, F. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoproteomic+analysis+of+ischemia-dependent+changes+in+signaling+protein+phosphorylation+in+colorectal+normal+and+cancer+tissue.">Nanoproteomic analysis of ischemia-dependent changes in signaling protein phosphorylation in colorectal normal and cancer tissue.</a> J Transl Med. 14, 6 (2016).</li><li>Urasaki, Y., Pizzorno, G., Le, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+uridine+administration+induces+fatty+liver+and+pre-diabetic+conditions+in+mice.">Chronic uridine administration induces fatty liver and pre-diabetic conditions in mice.</a> PLoS One. 11 (1), e0146994 (2016).</li><li>Schmidt, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Case-specific+potentiation+of+glioblastoma+drugs+by+pterostilbene.">Case-specific potentiation of glioblastoma drugs by pterostilbene.</a> Oncotarget. 7 (45), 73200-73215 (2016).</li></ol>

Känslighet och upplösning av proteiner är avgörande för proteomiska forskning om biologiska prover. Det är stort värde i att kunna identifiera proteiner som finns i minuten mängder i celler. cIEF kan erbjuda förbättrad känslighet och upplösning för påvisande av proteiner och deras isoformer4.
Denna teknik har använts framgångsrikt i många proteomiska forskning rapporter5,6,<sup class=...

Kapillär isoelektrisk fokusering (cIEF) är en automatiserad, kapillär-baserad immunoassay som löser proteiner på grundval av deras avgift1,2,3. Det är mycket reproducerbara och kan lösa proteiner och deras post-translationally modifierade isoformer snabbt och kvantitativt. Den presenterar ett alternativ till konventionella metoder såsom western blotting. Även western blotting är mycket bra för att bekräfta förekomsten av rikliga proteiner i lättillgängliga prover; variabilitet, tidsförbrukning och noggrann kvantitering alla närvarande utmaningar, i synnerhet när man undersöker biologiska vävnadsprover. Indeed, variabilitet är ett inneboende problem i western blotting, så finns det flera steg inblandade, såsom lastning och körning av SDS-PAGE geler, överföring av proteiner på membran, inkubation med olika reagens (t.ex., primära och sekundära antikroppar, ECL), och utvecklingen på röntgen film4. För närvarande, förbättras western blotting tekniken med genomförandet av digital inspelning av Kemiluminiscens signaler (digitala västernfilmer). Nyligen, ett automatiserat western blotting system har utvecklats, nämligen kapillären västra, som är ett handsfree- och gel-fria system. Hela analysen är automatiserad efter inläsningen av en prov tallrik (prover med alla nödvändiga reagens) i system3,4. Instrumentet kommer att utföra alla steg såsom protein separation, immobilisering av proteiner på kapillär vägg, antikropp inkubationer, tvättar mellan olika steg, och utveckling och kvantifiering av Kemiluminiscens signalerna. CIEF proceduren presenteras här ger således högre upplösning och känslighet.
Denna metod är känslig, som signaler kan genereras och kvantifieras från pikogram proteiner1. Hög känslighet med utmärkt reproducerbarhet gör denna teknik mycket användbar för analys av kliniska prover. Det kan upptäcka samt skilja post translationell modifiering (t.ex. olika fosforyleras protein isoformer) av proteiner. Denna teknik har använts framgångsrikt att dissekera olika signalering vägar4,5 i kliniska studier som syftar till att utveckla nya therapeutics i cancer3, och det har stor potential för protein biomarkör och drug discovery .

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="920">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:367px;">NanoPro 1000</td>
			<td style="width:107px;">ProteinSimple</td>
			<td style="width:301px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Premix G2, pH 5&#8211;8 (nested) separation gradient, pH 2&#8211;4 plug</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-972</td>
			<td>Ampholyte premix</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DMSO inhibitor mix</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-510</td>
			<td>Phosphatase inhibitors; for cIEF 1:50 dilution used</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Aqueous Inhibitor Mix</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-482</td>
			<td>Protease inhibitor; for cIEF 1:25 dilution used</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">pI standard ladder 3</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-646</td>
			<td>For cIEF 1:60 dilution used</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sample diluent</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-649</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Antibody diluent&#160;</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Wash concentrate</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>041-108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Anolyte Refill</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Catholyte Refill</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-338</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Peroxide XDR</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>041-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Luminol</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Bicine/CHAPS Lysis Buffer</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Capillaries-Charge Separation (1 pack) for&#160;</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>CBS700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Assay Plate/Lid Kit</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Peroxidase-AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)&#160;</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch&#160;</td>
			<td>711-035-152</td>
			<td>For cIEF used (1: 300)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Peroxidase-AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)&#160;</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch&#160;</td>
			<td>715-035-150</td>
			<td>For cIEF used (1: 300)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Phospho-Erk 1/2 Primary Antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9101</td>
			<td>For cIEF used (1: 50)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Pan Erk Primary Antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9102</td>
			<td>For cIEF used (1: 100)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Compass software</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">HUVEC</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>PCS-100-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MV2 (EBM-2)</td>
			<td>PromoCell</td>
			<td>&#160;C-22221</td>
			<td>Endothelia cell basal medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Endothelial Cell Growth Medium MV2 SupplementPack</td>
			<td>PromoCell</td>
			<td>C-39221</td>
			<td>Supplementation to MV2 above</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">VEGFA</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Long R3 IGF</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>85580C/I1146</td>
			<td>Insulin-like growth factor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bioruptor (Sonicator)</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>B01020001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BCA Protein Assay kit&#160;</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>NP0322BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NuPAG MOPS SDS Running Buffer (20X)</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>NP0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NuPAGE Transfer Buffer (20X)</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>NP0006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Immobilon PVDF membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microfuge tube vortexer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Microtiter plate adapter for centrifuge</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Pipettors&#160;</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Tips</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Ice</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

highly sensitive and quantitative detection of proteins and their isoforms by capillary isoelectric focusing method

Immunoblotting har blivit en rutin teknik i många laboratorier för protein karakterisering från biologiska prover. Följande protokoll ger en alternativ strategi, kapillär isoelektrisk fokusering (cIEF), med många fördelar jämfört med konventionella immunoblotting. Detta är en antikroppsbaserade, automatisk, snabb och kvantitativa metod där ett komplett western blotting förfarande äger rum inuti en ultrathin kapillär. Denna teknik inte kräver en gel att överföra till ett membran, strippning av blotting, eller Röntga filmar, som vanligtvis krävs för konventionella immunoblotting. Här, proteiner är separerade enligt sin laddning (isoelektrisk punkt, pI), med mindre än en mikroliter (400 nL) av totalt protein lysate. Efter elektrofores, proteiner är orörlig på kapillär väggarna av ultraviolett ljus behandling, följt av primära och sekundära (pepparrotsperoxidas (HRP) konjugerade) antikropp inkubation, vars bindande upptäcks genom förbättrad chemiluminescence (ECL), genererar en ljussignal som kan fångas och inspelad av en avgift – tillsammans enhet (CCD) kamera. Den digitala bilden kan analyseras och kvantifieras (topparea) med hjälp av programvara. Proceduren hög genomströmning kan hantera 96 prover på en gång; är mycket känslig, med protein upptäckt i intervallet pikogram; och producerar mycket reproducerbara resultat på grund av automatisering. Alla dessa aspekter är ytterst värdefulla när kvantiteten av prover (t.ex., vävnadsprover och biopsier) är en begränsande faktor. Tekniken har bredare program, inklusive screening för droger eller antikroppar, biomarkör identifiering och diagnostiska ändamål.

Design av en ny analys: En assay plattan layout visas i figur 1A. Maximally, kan 96 brunnarna användas från 384-väl plattan i block av 12 brunnar för varje villkor (antikropp). Varje block av 12 brunnar kan starta antingen från A1-A12 eller A13-A24. Färgkodade rader tillåter en att skilja prover eller reagenser från varandra. I mallen assay (figur 1B), relevant information för att kan särskilda analys l...

Watch this Scientific Journal Video about Highly Sensitive and Quantitative Detection of Proteins and Their Isoforms by Capillary Isoelectric Focusing Method at JoVE.com

Highly Sensitive and Quantitative Detection of Proteins and Their Isoforms by Capillary Isoelectric Focusing Method

Kapillär isoelektrisk fokusering är en antikroppsbaserade, ultrasensitive, hög genomströmning teknik, möjliggör detaljerad karakterisering av proteiner och deras isoformer från extremt små biologiska prover. Nedan beskrivs ett protokoll för detektion och kvantifiering av specifika proteiner och deras isoformer på ett automatiserat och robotiserade sätt.

Mycket känslig och kvantitativa påvisande av proteiner och deras isoformer av kapillär isoelektrisk fokusering metod

Immunoblotting has become a routine technique in many laboratories for protein characterization from biological samples. The following protocol provides ...

Denna metod kan hjälpa till att besvara viktiga frågor inom det biomedicinska forskningsfältet, såsom biomarkörupptäckt, läkemedelsupptäckt, diagnostik och screening av läkemedel eller antikroppar. Den största fördelen med denna teknik är att det är hög-genomströmning och kan upptäcka proteinisoformer på ett mycket reproducerbart sätt. Konsekvenserna av denna teknik sträcker sig mot diagnos av många sjukdomar eftersom det kan mäta drabbade proteiner eller deras isoformer.Även om denna metod kan ge insikt i cell-signalering vägar, det kan också tillämpas på andra system där specifika proteiner måste analyseras. Visuell demonstration av denna metod är kritisk eftersom analysen steg är svåra att lära sig på grund av tricks, såsom att ta bort bubblor, lastning plattan, et cetera. Först, förbereda en prov spädningsvätska mix genom att lägga till en mikroliter av DMSO-hämmare mix och två mikroliter av proteashämmare till 47 mikroliter prov spädningsmedel, så att den slutliga koncentrationen av DMSO och proteashämmare är en X.Späd tidigare isolerade protein lysates med hjälp av prov spädningsblandningen för att erhålla de önskade koncentrationerna.Därefter lägger du till 3,325 mikroliter av standardstege, sex mikroliter proteashämmare och tre mikroliter av DMSO-hämmare till 137,675 mikroliter av antholitpremix. Vortex provet minst 15 sekunder och hålla på is. Blanda de två beredda lösningarna i ett ett till tre-förhållande så att de slutliga koncentrationerna av DMSO-proteashämmare och den isoelektriska punktstandardstegen är en X och proteinerna i kapillären når de slutliga önskade koncentrationerna.Efter att proteinerna har tillsatts i provblandningen kommer alla steg att utföras på is eller vid fyra grader Celsius. Placera en 384-brunnsplatta på is. Ladda tio mikroliter av provet blanda i lämplig brunn av plattan, enligt assay mall layout utformad med den automatiserade Västra blotting system programvara.Efter detta späd de primära och sekundära antikropparna med antikroppsspädningsvätska. Sedan pipetter tio mikroliter av primära antikroppar och 15 mikroliter av sekundära antikroppar i varje brunn. Därefter blanda luminol och peroxid XDR i en ett till ett förhållande.Pipett 15 mikroliter av luminolperoxidblandningen i varje brunn. När proverna och reagants har lagts till plattan, centrifug i tio minuter vid 2500 gånger G och fyra grader Celsius att snurra ner vätskan och ta bort bubblorna. Om det fortfarande finns bubblor, ta bort dem manuellt med hjälp av en tunn pipettspets.Öppna den automatiserade Western blotting system programvara och klicka new'från arkivet menyn. Gå till layoutrutan och tilldela platser för reagants och prover i 384-brunnsplattan. Gör en reagant uppdrag genom att klicka på en brunn var som helst i blocket.Markera ett radblock med 12 brunnar vardera. Därefter går du till layoutfönstrets verktygsfält och sätter in ett prov-, primär-, sekundär- eller luminolradblock. Gå till protokollrutan och välj en plats på Reagant i plattan.Klicka sedan på cellen i exempelkolumnen och välj reagant på den nedrullningsgardna menyn. På samma sätt väljer du platserna reagant för den primära, sekundära och luminol för varje cykel. Klicka på cellerna en i taget i primär- eller sekundärantikroppskolumnen och ändra inkubationstiderna om det behövs.Lägg sedan till cykler genom att klicka på Add'button i protokollavsnittet. I mallrutan anger du information som gäller provet, till exempel identiteten för de primära och sekundära antikropparna, deras katalognummer och utspädningar. Spara den nya analysfilen.Innan du klickar på start'-knappen, kontrollera snabbt layouten för att se till att allt är korrekt. Nu, klicka på start'för att börja körningen. Programvaran kommer att uppmana användaren att ta bort avfallet, att fylla på vatten och kapillärlåda, att lägga anolit och catholite till resurs facket, att lägga till tvätt buffert, och att ladda plattan i den kylda prov facket.Ett instrument statusfält kommer att visas på datorskärmen ett par minuter efter körningen har startat. Klicka på körsammanfattningen'skärmen för att se status- och separationsrutorna. För att observera elektroforesseparationen i en kapillär, spela upp separationsfilmen för den kapillären genom att klicka på önskad cykel och sedan klicka på uppspelningsknappen i kontrollpanelen.Öppna körfilen och välj analysskärmfliken. Klicka edit'och sedan analysis'to ändra isoelektrisk punktområdet. Applicera den tillämpliga isoelektriska punktstandarden.Lägg till en topppassning och lägg till ett toppnamn. Slutligen väljer du de data som ska användas i fliken toppar och exporterar data för vidare analys. Elektroferogrammet av fosforylerade extracellulära signalreglerade kinaser från vaskulär endoteltillväxt-faktor stimuleras lysates visas här.Det finns mycket hög induktion av fosforylerade proteiner som observerats med vaskulär endoteltillväxtfaktor. Insetet visar den endogena lastningsstyrningen, HSP 70, som anger liknande lastning av prover för både obehandlade och behandlade prover. I en konventionell immunoblot upptäcktes endast två band, trots att fosforylterade extracellulära signal-reglerade kinas proteiner löstes i fyra toppar genom kapillär isoelektrisk fokusering analys.Elektroferogrammet av extracellulära signalreglerade kinaser från vaskulär endoteltillväxtfaktor stimulerade lysater visas här. Insetet visar samma lastningskontroll som används parallellt. En konventionell immunoblot visar endast två band som motsvarar extracellulära signal-reglerade kinas en och extracellulära signal-reglerade kinas två.Medan med kapillär isoelektrisk fokusering, de extracellulära signal-reglerade kinas proteiner löstes i sex toppar, motsvarande alla fyra olika fosforylerade toppar och två un-fosforylerade toppar. När behärskar, denna teknik kan göras i några timmar, beroende på antalet cykler, om det utförs på rätt sätt. Samtidigt som man försöker detta förfarande, Det är viktigt att komma ihåg att använda högre antikroppskoncentrationer jämfört med konventionella immunoblots.Visuell demonstration av denna metod är kritisk eftersom analysen steg är svåra att lära sig på grund av tricks, såsom att ta bort bubblor, lastning plattan, et cetera. Efter att ha sett den här videon, bör du ha en god förståelse för hur man utformar en analys, förbereda prover, köra analysen, och analysera data för att observera olika isoformer av ditt protein.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Highly Sensitive and Rapid Fluorescence Detection with a Portable FRET Analyzer

Mycket känslig och snabb fluorescensdetektion med en bärbar FRET Analyzer

Recent improvements in F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) sensors have enabled their use to detect various small molecules including ions and ...

An Efficient Method for the Isolation of Highly Purified RNA from Seeds for Use in Quantitative Transcriptome Analysis

En effektiv metod för isolering av högrenat RNA från frön för användning i kvantitativ transkriptom analys

Plant seeds accumulate large amounts of storage reserves comprising biodegradable organic matter. Humans rely on seed storage reserves for food and as ...

Capillary Electrophoresis Separation of Monoclonal Antibody Isoforms Using a Neutral Capillary

Kapillärelektrofores Separation av monoklonal antikropp isoformer med hjälp av en neutral kapillär

Biotherapeutic proteins, such as monoclonal antibodies (mAbs), are feasible alternatives for the treatment of chronic-degenerative diseases. The ...

Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

Metod för att visualisera och analysera membraninteragerande proteiner genom transmissionselektronmikroskopi

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

Formation of Covalent DNA Adducts by Enzymatically Activated Carcinogens and Drugs In Vitro and Their Determination by 32P-postlabeling

Formation of Covalent DNA Adducts by Enzymatically Activated Carcinogens and Drugs In Vitro and Their Determination by 32P-postlabeling

Bildandet av kovalent DNA addukter av enzymatiskt aktiverade carcinogener och droger In Vitro och deras beslutsamhet av 32P-postlabeling

Covalent DNA adducts formed by chemicals or drugs with carcinogenic potency are judged as one of the most important factors in the initiation phase of ...

Detection of Detergent-sensitive Interactions Between Membrane Proteins

Påvisande av tvättmedel-känsliga samspelet mellan membranproteiner

Our ability to explore protein-protein interactions is the key to understanding regulatory connections in the cell. However, detection of protein-protein ...

Quantitative and Qualitative Method for Sphingomyelin by LC-MS Using Two Stable Isotopically Labeled Sphingomyelin Species

Kvantitativ och kvalitativ metod för ceramidas av LC-MS med två stabila Isotopically märkt ceramidas arter

We present a method of analyzing sphingomyelin (SM) qualitatively and quantitatively by liquid chromatography-electrospray Ionization-tandem mass ...

Analysis of AtHIRD11 Intrinsic Disorder and Binding Towards Metal Ions by Capillary Gel Electrophoresis and Affinity Capillary Electrophoresis

Analys av AtHIRD11 inneboende sjukdom och bindande mot metalljoner genom kapillär gelelektrofores och affinitet kapillärelektrofores

Plants are strongly dependent on their environment. In order to adjust to stressful changes (e.g., drought and high salinity), higher plants evolve ...

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Påvisande av Heterodimerization av Protein isoformer använder en in Situ närhet Ligation Assay

Regulated protein-protein interactions are a guiding principle for many signaling events, and the detection of such events is an important element in ...

Use of Recombinant Fusion Proteins in a Fluorescent Protease Assay Platform and Their In-gel Renaturation

Användning av rekombinanta fusionsproteinerna i en fluorescerande proteas Assay plattform och deras i-gel utvinningsarbete

Proteases are intensively studied enzymes due to their essential roles in several biological pathways of living organisms and in pathogenesis; therefore, ...