Name: highly sensitive and quantitative detection of proteins and their isoforms by capillary isoelectric focusing method
Uploaded: 2018-09-19T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Highly Sensitive and Quantitative Detection of Proteins and Their Isoforms by Capillary Isoelectric Focusing Method at JoVE.com

Yazar Prof. Lena Claesson-Welsh, Uppsala Üniversitesi, İsveç bu proje geliştirmek için ona destek için teşekkürler. Ayrıca, yazar Ross Smith ve Lena Claesson-Welsh, Uppsala Üniversitesi'nde kendi eleştirel okuma ve el yazması geliştirmek için öneriler için teşekkürler.

1. hücre kültürü, stimülasyon ve lizis
Not: Bu yöntem çok hücre türü ile kullanılabilir. Yöntem göstermek için örnek insan göbek damar endotel hücreleri (HUVECs) kullanarak tanımlanır.
<ol><li>Kültür HUVECs uygun takviyesi ile endotel hücre bazal ortamda 10 cm Petri yemekleri jelatin kaplı (bkz. Tablo reçetesi) ve ayrıca % 5 FCS, epidermal büyüme faktörü (5 ng/mL), vasküler endotelyal büyüme faktörü içeren (VEGF: 0,5 ng/mL), temel FGF (10 n...

<ol>
	<li>O'Neill, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isoelectric+focusing+technology+quantifies+protein+signaling+in+25+cells.">Isoelectric focusing technology quantifies protein signaling in 25 cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (44), 16153-16158 (2006).</li><li>Aspinall-O'Dea, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody-based+detection+of+protein+phosphorylation+status+to+track+the+efficacy+of+novel+therapies+using+nanogram+protein+quantities+from+stem+cells+and+cell+lines.">Antibody-based detection of protein phosphorylation status to track the efficacy of novel therapies using nanogram protein quantities from stem cells and cell lines.</a> Nat Protoc. 10 (1), 149-168 (2015).</li><li>Fan, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanofluidic+proteomic+assay+for+serial+analysis+of+oncoprotein+activation+in+clinical+specimens.">Nanofluidic proteomic assay for serial analysis of oncoprotein activation in clinical specimens.</a> Nat Med. 15 (5), 566-571 (2009).</li><li>Padhan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+sensitivity+isoelectric+focusing+to+establish+a+signaling+biomarker+for+the+diagnosis+of+human+colorectal+cancer.">High sensitivity isoelectric focusing to establish a signaling biomarker for the diagnosis of human colorectal cancer.</a> BMC Cancer. 16 (1), 683 (2016).</li><li>Sun, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGFR2+induces+c-Src+signaling+and+vascular+permeability+in+vivo+via+the+adaptor+protein+TSAd.">VEGFR2 induces c-Src signaling and vascular permeability in vivo via the adaptor protein TSAd.</a> J Exp Med. 209 (7), 1363-1377 (2012).</li><li>Iacovides, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+quantification+of+AKT+isoforms+and+phosphoforms+in+breast+cancer+using+a+novel+nanofluidic+immunoassay.">Identification and quantification of AKT isoforms and phosphoforms in breast cancer using a novel nanofluidic immunoassay.</a> Mol Cell Proteomics. 12 (11), 3210-3220 (2013).</li><li>Price, F. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+JAK-STAT+signaling+stimulates+adult+satellite+cell+function.">Inhibition of JAK-STAT signaling stimulates adult satellite cell function.</a> Nat Med. 20 (10), 1174-1181 (2014).</li><li>Unger, F. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoproteomic+analysis+of+ischemia-dependent+changes+in+signaling+protein+phosphorylation+in+colorectal+normal+and+cancer+tissue.">Nanoproteomic analysis of ischemia-dependent changes in signaling protein phosphorylation in colorectal normal and cancer tissue.</a> J Transl Med. 14, 6 (2016).</li><li>Urasaki, Y., Pizzorno, G., Le, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+uridine+administration+induces+fatty+liver+and+pre-diabetic+conditions+in+mice.">Chronic uridine administration induces fatty liver and pre-diabetic conditions in mice.</a> PLoS One. 11 (1), e0146994 (2016).</li><li>Schmidt, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Case-specific+potentiation+of+glioblastoma+drugs+by+pterostilbene.">Case-specific potentiation of glioblastoma drugs by pterostilbene.</a> Oncotarget. 7 (45), 73200-73215 (2016).</li></ol>

Duyarlılık ve kararlılık proteinlerin biyolojik örnekler proteomik araştırma için çok önemli. Hücrelerdeki dakika miktarlarda olan proteinleri tespit etmek mümkün olmakta çok değerli şey. cIEF geliştirilmiş hassasiyet ve proteinler ve onların izoformlarının4tespiti için çözünürlük sunabilir.
Bu teknoloji birçok proteomik araştırma raporları5,6,7' ...

Kapiller isoelectric (cIEF) odaklanarak proteinler onların ücret1,2,3temel alınarak giderir, kılcal tabanlı otomatik immunoassay olduğunu. Bu son derece tekrarlanabilir ve proteinler ve onların post-translationally değiştirilmiş izoformlarının hızla ve kantitatif çözme yeteneğine sahip olduğunu. Western Blot gibi geleneksel yöntemlerle bir alternatif sunar. Western blot kolayca erişilebilir örnekleri bol proteinlerin varlığı teyit için çok iyi olmakla birlikte; değişkenliği, zaman tüketimi ve doğru Nefelometri tüm mevcut sorunlar, özellikle biyolojik doku örnekleri incelerken. Nitekim, değişkenlik içsel bir sorun western Blot, olarak orada çok sayıda adımları, yükleme ve SDS-sayfa jelleri kaçmaktan, proteinler membran, üzerine transferi gibi çeşitli reaktifleri ile kuluçka dahil (Örn., birincil ve ikincil antikorlar, ECL) ve geliştirme üzerine röntgen filmi4. Halen, Batı blotting tekniği dijital kayıt chemiluminescent sinyal (dijital westernler) uygulanması ile gelişiyor. Son zamanlarda, otomatik bir Batı blotting sistem geliştirilmiştir, daha yakışıklı-özgür ve jel içermeyen sistemi olan yani kılcal Batı. Tüm tahlil sistem3,4örnek plaka (tüm gerekli reaktifler örnekleriyle) yüklenmesini takiben otomatikleştirilmiştir. Araç protein ayırma gibi tüm adımları gerçekleştirir tutuklaması üzerine kapiller duvarı, antikor incubations, proteinlerin farklı adımlar ve geliştirme ve miktar chemiluminescent sinyallerin arasında yıkar. Böylece, burada sunulan cIEF yordam daha yüksek çözünürlük ve hassasiyet sağlar.
Bu yöntem olarak oluşturulan ve proteinler1EAG'yi sayısal sinyalleri duyarlıdır. Mükemmel tekrarlanabilirlik yüksek hassasiyet bu teknoloji klinik örneklerin analizi için çok kullanışlıdır. Bu tespit yayılımının sonrası translasyonel modifikasyon (Örneğin, farklı fosforile protein izoformlarının) proteinlerin ayırt. Bu teknoloji farklı sinyal yolları4,5 kanser3yeni tedavi geliştirmeyi amaçlayan klinik çalışmalarda incelemek için başarıyla kullanılmaktadır ve protein biyomarker ve ilaç keşfi için büyük bir potansiyele sahip .

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="920">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:367px;">NanoPro 1000</td>
			<td style="width:107px;">ProteinSimple</td>
			<td style="width:301px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Premix G2, pH 5&#8211;8 (nested) separation gradient, pH 2&#8211;4 plug</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-972</td>
			<td>Ampholyte premix</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DMSO inhibitor mix</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-510</td>
			<td>Phosphatase inhibitors; for cIEF 1:50 dilution used</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Aqueous Inhibitor Mix</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-482</td>
			<td>Protease inhibitor; for cIEF 1:25 dilution used</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">pI standard ladder 3</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-646</td>
			<td>For cIEF 1:60 dilution used</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sample diluent</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-649</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Antibody diluent&#160;</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Wash concentrate</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>041-108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Anolyte Refill</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Catholyte Refill</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-338</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Peroxide XDR</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>041-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Luminol</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Bicine/CHAPS Lysis Buffer</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Capillaries-Charge Separation (1 pack) for&#160;</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>CBS700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Assay Plate/Lid Kit</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>040-663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Peroxidase-AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)&#160;</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch&#160;</td>
			<td>711-035-152</td>
			<td>For cIEF used (1: 300)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Peroxidase-AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)&#160;</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch&#160;</td>
			<td>715-035-150</td>
			<td>For cIEF used (1: 300)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Phospho-Erk 1/2 Primary Antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9101</td>
			<td>For cIEF used (1: 50)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Pan Erk Primary Antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9102</td>
			<td>For cIEF used (1: 100)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Compass software</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">HUVEC</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>PCS-100-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MV2 (EBM-2)</td>
			<td>PromoCell</td>
			<td>&#160;C-22221</td>
			<td>Endothelia cell basal medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Endothelial Cell Growth Medium MV2 SupplementPack</td>
			<td>PromoCell</td>
			<td>C-39221</td>
			<td>Supplementation to MV2 above</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">VEGFA</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Long R3 IGF</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>85580C/I1146</td>
			<td>Insulin-like growth factor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bioruptor (Sonicator)</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>B01020001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BCA Protein Assay kit&#160;</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>NP0322BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NuPAG MOPS SDS Running Buffer (20X)</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>NP0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NuPAGE Transfer Buffer (20X)</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>NP0006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Immobilon PVDF membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microfuge tube vortexer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Microtiter plate adapter for centrifuge</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Pipettors&#160;</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Tips</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Ice</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

highly sensitive and quantitative detection of proteins and their isoforms by capillary isoelectric focusing method

Immunoblotting biyolojik örneklerinden protein karakterizasyonu için birçok laboratuarlarında rutin bir teknik haline gelmiştir. Aşağıdaki iletişim kuralı bir alternatif strateji sağlar, kapiller isoelectric (cIEF), pek çok avantajı ile odaklama için geleneksel immunoblotting karşılaştırıldığında. Bu yordamın tamamı Batı blotting bir ultrathin kılcal içinde gerçekleştiği bir antikor tabanlı, otomatik, hızlı ve nicel bir yöntemdir. Bu teknik bir membran lekesi sıyırma, aktarmak için bir jel gerektirmez veya geleneksel immunoblotting için genellikle gerekli olan filmler, x-ışını. Burada, proteinler onların ücret (isoelectric noktası; pI) göre kullanarak daha az bir microliter ayrılır (400 nL) Toplam protein lysate. Elektroforez sonra proteinler, kapiller duvarları ultraviyole ışık tedavisi, birincil ve ikincil (horseradish peroksidaz (HRP) Birleşik) tarafından takip tarafından immobilize antikor kuluçka bağlantısını aracılığıyla algılandığında, gelişmiş Kemiluminesan (ECL), yakalanan ve bir şarj kuplajlı cihaz (CCD) kamera tarafından kaydedilen bir ışık sinyal üreten. Dijital görüntü analiz edilebilir ve (pik alanı) sayısal yazılım kullanarak. Bu yüksek üretilen iş yordamı 96 örnekleri teker teker işleyebilir; Son derece hassas, protein algılama picogram aralığında olduğunu; ve otomasyon nedeniyle son derece tekrarlanabilir sonuçlar üretir. Örnekleri (Örneğin, doku örnekleri ve biyopsi) miktarı kısıtlayıcı bir faktör olduğunda tüm bu yönleriyle son derece değerlidir. Teknik uyuşturucu veya antikorlar, biyomarker keşif ve tanılama amacıyla tarama dahil olmak üzere de, daha geniş uygulama alanı vardır.

Yeni bir testin tasarım: Bir tahlil plaka Düzen Şekil 1Aile gösterilir. Sonuna kadar 96 wells 384-şey plaka blok 12 Wells (antikor) her koşul için kullanılabilir. Her blok 12 Wells A1-A12 veya A13-A24 başlayabilirsiniz. Renk kodlu satır örnekleri ya da reaktifler birbirinden ayırt etmek izin. Tahlil şablon (Şekil 1B), ilgili bilgi için bu özel tahlil, hangi-ebilmek var olmak kullanılmış sonuç ...

Watch this Scientific Journal Video about Highly Sensitive and Quantitative Detection of Proteins and Their Isoforms by Capillary Isoelectric Focusing Method at JoVE.com

Highly Sensitive and Quantitative Detection of Proteins and Their Isoforms by Capillary Isoelectric Focusing Method

Kapiller isoelectric odaklanarak proteinler ve onların izoformlarının son derece küçük biyolojik örneklerinden detaylı karakterizasyonu etkinleştirme bir antikor tabanlı, vericiyi, yüksek üretilen iş, tekniğidir. Aşağıda bir protokol olarak algılanmasını ve miktar belirli proteinlerin ve onların izoformlarının otomatik ve robotized bir şekilde açıklanmıştır.

Proteinler ve onların izoformlarının kapiller Isoelectric odaklanarak yöntemi tarafından son derece hassas ve nicel tespiti

Immunoblotting has become a routine technique in many laboratories for protein characterization from biological samples. The following protocol provides ...

Bu yöntem biyomedikal araştırma alanında biyomarker keşfi, ilaç keşfi, teşhis ve ilaç veya antikor ların taranması gibi anahtar soruların yanıtlatılabiliyor. Bu tekniğin en büyük avantajı yüksek verimli olması ve protein izoformlarını son derece tekrarlanabilir bir şekilde tespit edebildiğidir. Etkilenen proteinleri veya izoformlarını ölçebildiği için bu tekniğin etkileri birçok hastalığın tanısına kadar uzanır.Bu yöntem hücre sinyalyolları hakkında bilgi sağlasa da, spesifik proteinlerin analiz edilmesi gereken diğer sistemlere de uygulanabilir. Bu yöntemin görsel gösterimi, kabarcıkların kaldırılması, plakanın yüklenmesi vesaire gibi hileler nedeniyle öğrenmenin zor olduğu için bu yöntemin görsel gösterimi çok önemlidir. İlk olarak, bir mikrolitre DMSO inhibitörü karışımı ve iki mikrolitre proteaz inhibitörünün 47 mikrolitre numune seyrelticisine ekleyerek bir örnek seyreltici karışımı hazırlayın, böylece DMSO ve proteaz inhibitörlerinin son konsantrasyonu bir X.Dilute daha önce izole edilmiş protein lisatları kullanarak istenilen konsantrasyonları elde etmek için.Sonra, standart merdiven 3.325 mikrolitre ekleyin, proteaz inhibitörü altı mikrolitre, ve antholite premix 137.675 mikrolitre DMSO inhibitörü üç mikrolitre. En az 15 saniye lik numuneyi girve buzda tut. DMSO proteaz inhibitörlerinin ve izoelektrik nokta standart merdivenin son konsantrasyonlarının bir X olması ve kılcal damardaki proteinlerin istenilen son konsantrasyonlara ulaşması için hazırlanan iki çözeltiyi bir veya üç oranında karıştırın.Proteinler örnek karışıma eklendikten sonra, tüm adımlar buzda veya dört santigrat derecede gerçekleştirilir. Buz üzerine 384 kuyuluk bir tabak yerleştirin. Otomatik Batı lekeleme sistemi yazılımı ile tasarlanan test şablonu düzenine göre, numune karışımının on mikrolitresini plakanın uygun kuyuya yükleyin.Bunu takiben, antikor dilüent ile primer ve sekonder antikorları seyreltin. Daha sonra, pipet her kuyuya 10 mikrolitre primer antikor ve 15 mikrolitre ikincil antikor. Sonra, luminol ve peroksit XDR bir oran bir karıştırın.Pipet 15 mikrolitre luminol peroksit her kuyuya karışır. Numuneler ve reagantlar tabağa eklendikten sonra, 2500 kez G'de on dakika santrifüj ve sıvıyı aşağı döndürmek ve kabarcıkları çıkarmak için dört santigrat derece. Kabarcıklar hala varsa, ince bir pipet ucu kullanarak el ile kaldırın.Otomatik Western blotting sistem yazılımını açın ve dosya menüsünden new''yi tıklatın. Düzen bölmesine gidin ve 384 kuyuluk plakadaki reagant'lar ve numuneler için konumlar atayın. Bloğun herhangi bir yerindeki bir kuyuyu tıklatarak bir reagant ataması yapın.Her biri 12 kuyudan oluşan bir satır bloğu seçin. Ardından, düzen bölmesi araç çubuğuna gidin ve bir örnek, birincil, ikincil veya luminol satır bloğu ekleyin. Protokol bölmesine gidin ve plakada bir reagant konumu seçin.Ardından, örnek sütundaki hücreyi tıklatın ve açılır menüden reagant'ı seçin. Aynı şekilde, her döngü için birincil, ikincil ve luminol için reagant konumlarını seçin. Birincil veya ikincil antikor sütununda hücreleri teker teker tıklatın ve gerekirse kuluçka sürelerini değiştirin.Ardından, protokol bölümündeki Ekle düğmesini tıklatarak döngüler ekleyin. Şablon bölmesine, birincil ve ikincil antikorların kimliği, katalog numaraları ve seyreltmeleri gibi örnekle ilgili bilgileri girin. Yeni bir ait sonuç dosyasını kaydedin.Başlat düğmesini tıklatmadan önce, her şeyin doğru olduğundan emin olmak için düzeni hızlıca kontrol edin. Şimdi, çalıştırmaya başlamak için başlat'ı tıklatın. Yazılım, kullanıcıdan atıkları temizlemesini, su ve kılcal kutuyu doldurmasını, kaynak tepsisine anolit ve katolit eklemesini, yıkama tamponu eklemesini ve plakayı soğutulmuş numune tepsisine yüklemesini ister.Çalışma başladıktan birkaç dakika sonra bilgisayar ekranında bir enstrüman durum çubuğu görüntülenir. Durum ve ayırma bölmelerini görmek için çalıştır özeti'nin ekranına tıklayın. Bir kılcal damarda elektroforez in ayrımını gözlemlemek için, istenilen döngüyü tıklayıp kontrol panelindeki oynat düğmesine tıklayarak o kılcal damar için ayırma filmini oynayın.Çalıştır dosyasını açın ve çözümleme ekranı sekmesini seçin. Izoelektrik nokta aralığını değiştirmek için edit've ardından analiz'e tıklayın. Uygun izoelektrik nokta standardını uygulayın.Bir tepe sığdırma ekleyin ve bir tepe adı ekleyin. Son olarak, zirveler sekmesinde kullanılacak verileri seçin ve daha fazla analiz için verileri dışa aktarın. Vasküler endotelyal büyüme faktörü uyarılmış lysates fosforilted ekstrasellüler sinyal-regüle kinazelektroferogramı burada gösterilmiştir.Vasküler endotelyal büyüme faktörü ile gözlenen fosforitane proteinlerin çok yüksek indüksiyonu vardır. Inset endojen yükleme kontrolü gösterir, HSP 70, hem işlenmemiş ve tedavi örnekleri için örneklerin benzer yükleme gösteren. Konvansiyonel bir immünoblotta, fosforiile hücre dışı sinyal leregüle kiyaz proteinleri kapiller izoelektrik odaklama analizi ile dört tepeye ayrılmıştıne rağmen sadece iki bant saptamıştır.Vasküler endotelyal büyüme faktörü uyarılmış lysates gelen ekstrasellüler sinyal regüle kinazelektroferogramı burada gösterilmiştir. Inset paralel olarak kullanılan aynı yükleme denetimini gösterir. Konvansiyonel bir immünoblot sadece iki bant ekstrasellüler sinyal-regüle kizaz bir ve ekstrasellüler sinyal-regüle kiaz iki karşılık gösterir.Kapiller izoelektrik odaklama ile ise, hücre dışı sinyal-regüle kinaaz proteinleri dört farklı fosforilted zirveleri ve iki un-fosforile peaks karşılık gelen altı zirveleri olarak çözüldü. Bir kez hakim, bu teknik birkaç saat içinde yapılabilir, döngülerin sayısına bağlı olarak, düzgün yapılırsa. Bu prosedürü çalışırken, konvansiyonel immünoblots ile karşılaştırıldığında daha yüksek antikor konsantrasyonları kullanmayı unutmayın önemlidir.Bu yöntemin görsel gösterimi, kabarcıkların kaldırılması, plakanın yüklenmesi vesaire gibi hileler nedeniyle öğrenmenin zor olduğu için önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, proteininizin farklı izoformlarını gözlemlemek için verileri nasıl tasarlayacağınızı, numuneleri nasıl hazırlayacağınızı, testetmeyi nasıl çalıştırabileceğinizi iyi anlamalısınız.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Highly Sensitive and Rapid Fluorescence Detection with a Portable FRET Analyzer

Taşınabilir FRET Analyzer ile son derece hassas ve hızlı Floresan Algılama

Recent improvements in F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) sensors have enabled their use to detect various small molecules including ions and ...

An Efficient Method for the Isolation of Highly Purified RNA from Seeds for Use in Quantitative Transcriptome Analysis

Kantitatif Transkriptom analizinde kullanım için tohumlar yüksek oranda saf RNA&#39;nın izolasyonu için etkili bir yöntem

Plant seeds accumulate large amounts of storage reserves comprising biodegradable organic matter. Humans rely on seed storage reserves for food and as ...

Capillary Electrophoresis Separation of Monoclonal Antibody Isoforms Using a Neutral Capillary

Nötr Kılcal kullanılarak monoklonal antikor izoformlannın Kapiler Elektroforez Ayırma

Biotherapeutic proteins, such as monoclonal antibodies (mAbs), are feasible alternatives for the treatment of chronic-degenerative diseases. The ...

Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

Yöntem gözünüzde canlandırın ve Transmisyon Elektron Mikroskobu Membran Etkileşen Proteinler Analiz için

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

Formation of Covalent DNA Adducts by Enzymatically Activated Carcinogens and Drugs In Vitro and Their Determination by 32P-postlabeling

Formation of Covalent DNA Adducts by Enzymatically Activated Carcinogens and Drugs In Vitro and Their Determination by 32P-postlabeling

Kovalent DNA oluşumu enzimatik aktif kanserojen ve uyuşturucu Vitro ve kararlılıklarını 32P-postlabeling tarafından Adducts

Covalent DNA adducts formed by chemicals or drugs with carcinogenic potency are judged as one of the most important factors in the initiation phase of ...

Detection of Detergent-sensitive Interactions Between Membrane Proteins

Membran proteinlerinin Hofstede deterjan duyarlı tespiti

Our ability to explore protein-protein interactions is the key to understanding regulatory connections in the cell. However, detection of protein-protein ...

Quantitative and Qualitative Method for Sphingomyelin by LC-MS Using Two Stable Isotopically Labeled Sphingomyelin Species

Sphingomyelin türler Sphingomyelin LC-MS iki kararlı Isotopically kullanarak tarafından için nicel ve nitel yöntemi etiketli

We present a method of analyzing sphingomyelin (SM) qualitatively and quantitatively by liquid chromatography-electrospray Ionization-tandem mass ...

Analysis of AtHIRD11 Intrinsic Disorder and Binding Towards Metal Ions by Capillary Gel Electrophoresis and Affinity Capillary Electrophoresis

AtHIRD11 içsel bozukluğu ve bağlama kapiller Jel Elektroforez ve benzeşme kapiler Elektroforez Metal iyonları doğru Analizi

Plants are strongly dependent on their environment. In order to adjust to stressful changes (e.g., drought and high salinity), higher plants evolve ...

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Heterodimerization in Situ yakınlık ligasyonu tahlil kullanarak Protein izoformlarının tespiti

Regulated protein-protein interactions are a guiding principle for many signaling events, and the detection of such events is an important element in ...

Use of Recombinant Fusion Proteins in a Fluorescent Protease Assay Platform and Their In-gel Renaturation

Rekombinant füzyon protein flüoresan proteaz tahlil Platform ve onların jel Renaturation kullanımı

Proteases are intensively studied enzymes due to their essential roles in several biological pathways of living organisms and in pathogenesis; therefore, ...