Name: quantitative measurement of &#947;-secretase-mediated amyloid precursor protein and notch cleavage in cell-based luciferase reporter assay platforms
Uploaded: 2018-01-25T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Measurement of ÃŽÂ³-Secretase-mediated Amyloid Precursor Protein and Notch Cleavage in Cell-based Luciferase Reporter Assay Platforms at JoVE.com

يشكر المؤلفون "مرفق الأساسية" المعهد الخلوي و "علم الأحياء أورجانيسميك"، "سينيكا"، الحصول على الدعم التقني. هذه الدراسة كانت تدعمها وزارة العلوم والتكنولوجيا، تايوان (الأكثر 103-2320-B-001-016-MY3 إلى يوسف-واو. L.)، برنامج الابتكار متعدية للتنمية الصيدلانية البيولوجية – التكنولوجيا الداعمة للمحور الأساسي المخطط (NP7 إلى. ي.)، وسينيكا (ليوسف-).

1-قياس "إشارات مراسل لوسيفراس"، والتي تناظر الانقسام γ-سيكريتاسي للتطبيق--C99 أو NΔE
ملاحظة: يرجى الرجوع إلى المنشورات السابقة أوصاف مفصلة لتوليد CG ونغ خلايا20،21.
<ol><li>
بذور الخلايا نغ أو CG (20، 000 خلايا/جيدا) على ميكروبلاتيس 96-جيدا في وحدة تخزي?...

<ol>
	<li>Selkoe, D. J., Hardy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+amyloid+hypothesis+of+Alzheimer's+disease+at+25+years.">The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease at 25 years.</a> EMBO Mol Med. 8 (6), 595-608 (2016).</li><li>Wolfe, M. S., Guenette, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=APP+at+a+glance.">APP at a glance.</a> J Cell Sci. 120 (Pt 18), 3157-3161 (2007).</li><li>Karran, E., Mercken, M., De Strooper, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+amyloid+cascade+hypothesis+for+Alzheimer's+disease:+an+appraisal+for+the+development+of+therapeutics.">The amyloid cascade hypothesis for Alzheimer's disease: an appraisal for the development of therapeutics.</a> Nat Rev Drug Discov. 10 (9), 698-712 (2011).</li><li>Citron, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alzheimer's+disease:+strategies+for+disease+modification.">Alzheimer's disease: strategies for disease modification.</a> Nat Rev Drug Discov. 9 (5), 387-398 (2010).</li><li>Vassar, R., Kovacs, D. M., Yan, R., Wong, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+beta-secretase+enzyme+BACE+in+health+and+Alzheimer's+disease:+regulation,+cell+biology,+function,+and+therapeutic+potential.">The beta-secretase enzyme BACE in health and Alzheimer's disease: regulation, cell biology, function, and therapeutic potential.</a> J Neurosci. 29 (41), 12787-12794 (2009).</li><li>Parks, A. L., Curtis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presenilin+diversifies+its+portfolio.">Presenilin diversifies its portfolio.</a> Trends Genet. 23 (3), 140-150 (2007).</li><li>Kukar, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate-targeting+gamma-secretase+modulators.">Substrate-targeting gamma-secretase modulators.</a> Nature. 453 (7197), 925-929 (2008).</li><li>Kounnas, M. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+gamma-secretase+reduces+beta-amyloid+deposition+in+a+transgenic+mouse+model+of+Alzheimer's+disease.">Modulation of gamma-secretase reduces beta-amyloid deposition in a transgenic mouse model of Alzheimer's disease.</a> Neuron. 67 (5), 769-780 (2010).</li><li>Thathiah, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+orphan+G+protein-coupled+receptor+3+modulates+amyloid-beta+peptide+generation+in+neurons.">The orphan G protein-coupled receptor 3 modulates amyloid-beta peptide generation in neurons.</a> Science. 323 (5916), 946-951 (2009).</li><li>Flajolet, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Alzheimer's+disease+amyloid-beta+formation+by+casein+kinase+I.">Regulation of Alzheimer's disease amyloid-beta formation by casein kinase I.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (10), 4159-4164 (2007).</li><li>Eisele, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gleevec+increases+levels+of+the+amyloid+precursor+protein+intracellular+domain+and+of+the+amyloid-beta+degrading+enzyme+neprilysin.">Gleevec increases levels of the amyloid precursor protein intracellular domain and of the amyloid-beta degrading enzyme neprilysin.</a> Mol Biol Cell. 18 (9), 3591-3600 (2007).</li><li>He, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gamma-secretase+activating+protein+is+a+therapeutic+target+for+Alzheimer's+disease.">Gamma-secretase activating protein is a therapeutic target for Alzheimer's disease.</a> Nature. 467 (7311), 95-98 (2010).</li><li>Haapasalo, A., Kovacs, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+many+substrates+of+presenilin/gamma-secretase.">The many substrates of presenilin/gamma-secretase.</a> J Alzheimers Dis. 25 (1), 3-28 (2011).</li><li>Gillman, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+and+Evaluation+of+BMS-708163,+a+Potent,+Selective+and+Orally+Bioavailable+gamma-Secretase+Inhibitor.">Discovery and Evaluation of BMS-708163, a Potent, Selective and Orally Bioavailable gamma-Secretase Inhibitor.</a> ACS Med Chem Lett. 1 (3), 120-124 (2010).</li><li>Hopkins, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ACS+chemical+neuroscience+molecule+spotlight+on+Begacestat+(GSI-953).">ACS chemical neuroscience molecule spotlight on Begacestat (GSI-953).</a> ACS Chem Neurosci. 3 (1), 3-4 (2012).</li><li>Yang, T., Arslanova, D., Gu, Y., Augelli-Szafran, C., Xia, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+gamma-secretase+modulation+differentiates+inhibitor+compound+selectivity+between+two+substrates+Notch+and+amyloid+precursor+protein.">Quantification of gamma-secretase modulation differentiates inhibitor compound selectivity between two substrates Notch and amyloid precursor protein.</a> Mol Brain. 1, 15 (2008).</li><li>McKee, T. D., Loureiro, R. M., Dumin, J. A., Zarayskiy, V., Tate, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+cell-based+method+for+determining+the+gamma-secretase+enzyme+activity+against+both+Notch+and+APP+substrates.">An improved cell-based method for determining the gamma-secretase enzyme activity against both Notch and APP substrates.</a> J Neurosci Methods. 213 (1), 14-21 (2013).</li><li>Basi, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+precursor+protein+selective+gamma-secretase+inhibitors+for+treatment+of+Alzheimer's+disease.">Amyloid precursor protein selective gamma-secretase inhibitors for treatment of Alzheimer's disease.</a> Alzheimers Res Ther. 2 (6), 36 (2010).</li><li>Liao, Y. F., Tang, Y. C., Chang, M. Y., Wang, B. J., Hu, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+small+molecular+(D)-leucinamides+as+potent,+Notch-sparing+gamma-secretase+modulators.">Discovery of small molecular (D)-leucinamides as potent, Notch-sparing gamma-secretase modulators.</a> Eur J Med Chem. 79, 143-151 (2014).</li><li>Liao, Y. F., Wang, B. J., Cheng, H. T., Kuo, L. H., Wolfe, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+necrosis+factor-alpha,+interleukin-1beta,+and+interferon-gamma+stimulate+gamma-secretase-mediated+cleavage+of+amyloid+precursor+protein+through+a+JNK-dependent+MAPK+pathway.">Tumor necrosis factor-alpha, interleukin-1beta, and interferon-gamma stimulate gamma-secretase-mediated cleavage of amyloid precursor protein through a JNK-dependent MAPK pathway.</a> J Biol Chem. 279 (47), 49523-49532 (2004).</li><li>Wang, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ErbB2+regulates+autophagic+flux+to+modulate+the+proteostasis+of+APP-CTFs+in+Alzheimer's+disease.">ErbB2 regulates autophagic flux to modulate the proteostasis of APP-CTFs in Alzheimer's disease.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (15), E3129-E3138 (2017).</li><li>Sevigny, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+antibody+aducanumab+reduces+Abeta+plaques+in+Alzheimer's+disease.">The antibody aducanumab reduces Abeta plaques in Alzheimer's disease.</a> Nature. 537 (7618), 50-56 (2016).</li><li>Golde, T. E., Koo, E. H., Felsenstein, K. M., Osborne, B. A., Miele, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=gamma-Secretase+inhibitors+and+modulators.">gamma-Secretase inhibitors and modulators.</a> Biochim Biophys Acta. 1828 (12), 2898-2907 (2013).</li><li>Coric, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Prodromal+Alzheimer+Disease+With+Avagacestat:+A+Randomized+Clinical+Trial.">Targeting Prodromal Alzheimer Disease With Avagacestat: A Randomized Clinical Trial.</a> JAMA Neurol. 72 (11), 1324-1333 (2015).</li><li>Mitani, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+between+gamma-secretase+inhibitors+and+modulators+on+cognitive+function+in+amyloid+precursor+protein-transgenic+and+nontransgenic+mice.">Differential effects between gamma-secretase inhibitors and modulators on cognitive function in amyloid precursor protein-transgenic and nontransgenic mice.</a> J Neurosci. 32 (6), 2037-2050 (2012).</li><li>Penninkilampi, R., Brothers, H. M., Eslick, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+Agents+Targeting+gamma-Secretase+Increase+Risk+of+Cancer+and+Cognitive+Decline+in+Alzheimer's+Disease+Patients:+A+Systematic+Review+and+Meta-Analysis.">Pharmacological Agents Targeting gamma-Secretase Increase Risk of Cancer and Cognitive Decline in Alzheimer's Disease Patients: A Systematic Review and Meta-Analysis.</a> J Alzheimers Dis. 53 (4), 1395-1404 (2016).</li></ol>

أقامت إيمانا راسخا الدور الحاسم ل Aβ في الآلية المرضية لإعلان22 نتائج واعدة من محاكمة 1b مرحلة العلاج المناعي أدوكانوماب للإعلان وتشير إلى أن نهج مكافحة Aβ لا تزال استراتيجية قابلة للتطبيق لوضع إعلان لمكافحة المخدرات. هنا، يمكننا وصف يستند إلى الخلية فحوصات لقياس proteolysis γ-سيكري...

ويعتقد أن السبب الرئيسي في نيوروديجينيريشن في أدمغة المرضى الذين يعانون من مرض الزهايمر (AD)1oligomeric أشكال اميلويد-بيتا (Aβ). الببتيدات Aβ تنتجها الانقسام التدرجي لبروتين اميلويد السلائف (APP)، أولاً ب β-سيكريتاسي ثم γ-سيكريتاسي2. في العقد الماضي، ركزت النهج العلاجي تجاه معاملة الإعلان على منع Aβ الإنتاج3. معظم الدراسات ركزت على أما زيادة النشاط α-سيكريتاسي، الذي يمكن أن يحول دون الانقسام γ-سيكريتاسي للتطبيق ومما خفض إنتاج Aβ، أو تثبيط الأنشطة γ-سيكريتاسي β-و/أو4. ولسوء الحظ، تثبيط غير انتقائية نتائج سيكريتاسيس β أو γ في الآثار الجانبية التي لا يمكن تجنبها التي سبب التدخل مع أداء الأخرى ركائز الفسيولوجية سيكريتاسي β و γ5،6. وأفادت الدراسات الأخيرة فيما يتعلق بمثبطات γ-سيكريتاسي، اكتشاف عدد من المغيرون الكيميائية والجينية التي يمكن أن تنظم إنتاج Aβ أثناء ممارسة آثار لا تذكر على تجهيز أساسي γ-سيكريتاسي-بوساطة من الدرجة7 ،،من89،10،11،12، إلا أن العلاجات الناجحة لم توضع بعد. وهكذا، كذلك مبررة شاشات منهجية لاكتشاف رواية المعدلات الوراثية والكيميائية التي قد تعدل بشكل انتقائي γ-سيكريتاسي-بوساطة تجهيز التطبيق.
من المعروف أن تهزم أكثر من 90 من البروتينات المختلفة ترتكز على غشاء γ-سيكريتاسي. بين ركائز هذه هي الدرجة، ونشاطها أمر حاسم لتحديد مصير الخلية والتمايز خلال التنمية13. تحوير بشكل انتقائي التطبيق γ-سيكريتاسي-حفز المعالجة في الغياب التأثير على درجة تجهيز ستكون ضرورية للتقليل إلى أدنى حد الآثار الجانبية المتعلقة بالشق من مثبطات γ-سيكريتاسي، وهذه الانتقائية ويعتقد أن عامل أساسي الذي سوف إملاء فعالية بيولوجية المغيرون γ-سيكريتاسي المحتملة للمعالجة المزمنة للإعلان. وقد كان هناك عدد من مشتقات أريلسولفوناميدي، مثل GSI-953 (بيجاسيستات)، وخدمات إدارة المباني-708163 (أفاجاسيستات)، التي وجدت لمعرض تثبيط قوية وانتقائية γ-سيكريتاسي14،15. دراسة سابقة أظهرت أنه يمكن ملاحظة التفاضلية تثبيط الانقسام γ-سيكريتاسي التطبيق ودرجة استخدام مقايسة كمية على أساس أليسا في تركيبة مع فيفو التحقق من استخدام الزرد16. وعلاوة على ذلك، أنشئت نماذج التحليل يستند إلى الخلية لمعالجة انتقائية الركيزة المحتملة γ-سيكريتاسي نحو التطبيق والدرجة17،18. استخدام بروتوكولات مماثلة لتلك الموصوفة هنا، لقد اكتشفنا مؤخرا فئة جديدة من (د)-ليوسيناميديس أن تعدل أظهرت الانقسام γ-سيكريتاسي للتطبيق مع الانتقائية تجنيب حز19. معا، هذه المجموعة من الدراسات يوفر دليلاً لمفهوم دعم الفكرة القائلة بأن الانتقائية الركازة/توافر γ-سيكريتاسي يمكن أن تخضع للتحوير الكيميائي والتحقق التجريبي. ومع ذلك، هذه المنابر المقايسة غالباً ما تعتمد على قراءات الإنتاجية منخفضة نسبيا والنهج ذات العمالة الكثيفة التي قد لا تفي بالمعايير الصناعية لبرامج اكتشاف المخدرات.
ونحن قد ولدت مؤخرا فحوصات الجينات مراسل لوسيفراس يستند إلى الخلية التي يمكن أن تحدد كمياً نشاط الحفاز γ-سيكريتاسي نحو اثنين من ركائز متميزة والجزء الطرفي ج حمض 99 الأمينية للتطبيق (التطبيق--C99) وفي خارج الخلية حذف المجال الشق الببتيد (NΔE). وقد استخدمت على نطاق واسع كركائز مباشرة من γ-سيكريتاسي في فحوصات مختلفة التطبيق--C99 و NΔE. لتوليد فحوصات الجينات مراسل لوسيفراس متجانسة ومتسقة للانقسام γ-سيكريتاسي للتطبيق--C99 أو NΔE، نحن إنشاء خط الخلية مستقرة المستمدة من HEK واحد (CG) مؤثرا يعبر عن Gal4 اليراع يحركها مروج لوسيفراس مراسل ( Gal4-Luc) والتطبيق--C99 Gal4/VP16-معلم الانصهار البروتين (C99-GV). وبالإضافة إلى ذلك، أنشأنا آخر خط الخلية مستقرة المستمدة من HEK (الحرس الوطني) مؤثرا يعبر عن لوك Gal4 و NΔE Gal4/VP16-معلم (NΔE-GV). باستخدام هذه الاختبارات رواية الركيزة الخاصة γ-سيكريتاسي، نقدم الآن طريقة لتقدير وتميز نشاط الحفاز γ-سيكريتاسي تجاه ركائز متميزة (التطبيق--C99 في الخلايا CG)، أو NΔE في خلايا الحرس الوطني. وعلاوة على ذلك، صممت فحوصات محددة الركازة γ-سيكريتاسي أن تفضي إلى منصات فحص محتوى عالية. هذه الاختبارات التي تم إنشاؤها حديثا γ-سيكريتاسي يمكن أن يمهد لاكتشاف المغيرون رواية γ-سيكريتاسي التي يمكن أن تحسن الوظائف المعرفية بقمع إنتاج Aβ دون التماس تثبيط الشق غير مرغوب فيه لعلاج الجيل المقبل للإعلان.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>VictorLight luminescence plate reader</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>2030-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Class II, Type 2 Biological Safety Cabinet</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1300 Series A2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CL-387,785</td>
			<td>EMD Calbiochem</td>
			<td>233100-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPT</td>
			<td>Merck</td>
			<td>565770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12100046</td>
			<td>main compnent of growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>16000044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blasticidin</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A1113903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeocin</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>R25005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygromycin B</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10687010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytomer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>BR717805 Aldrich</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well microplate</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>156545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T7660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steady-Glo luciferase assay reagent</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidified CO2 incubator</td>
			<td>Revco</td>
			<td>Ultima II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-REx293 cell line</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R71007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wallac 1420 software version 3.0</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td>instrument control software of the luminescence microplate reader</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative measurement of &#947;-secretase-mediated amyloid precursor protein and notch cleavage in cell-based luciferase reporter assay platforms

وقد وضعنا على زوج من فحوصات الجينات مراسل يستند إلى الخلية قياس كمي الانقسام γ-سيكريتاسي من ركائز متميزة. هذه المخطوطة يصف الإجراءات التي يمكن استخدامها لرصد الانقسام γ-سيكريتاسي-بوساطة من التطبيق--C99 أو الدرجة، واستخدام نظام مراسل لوسيفراس اليراع يحركها المروج Gal4. ووضعت هذه فحوصات ستابلي المشترك ترانسفيكتينج الخلايا HEK293 مع الجينات مراسل يحركها Gal4 لوسيفراس وأما الجزء الطرفي ج Gal4/VP16-معلم للتطبيق (التطبيق--C99؛ CG الخلايا)، أو Gal4/VP16-معلم الدرجة-ΔE (NΔE؛ خلايا الحرس الوطني). استخدام هذه الاختبارات مراسل في نفس الوقت، وقد أثبتنا أن المانع ErbB2، CL-387,785، تفضيلي يمكن قمع انشقاق γ-سيكريتاسي للتطبيق--C99 في الخلايا الفريق الاستشاري، ولكن لا NΔE في خلايا الحرس الوطني. الردود التفاضلية التي أظهرتها الخلايا الفريق الاستشاري، والحرس الوطني، عندما تعامل مع CL-387,785، تمثل سمة مفضل المغيرون γ-سيكريتاسي، وهذه الردود في تناقض صارخ مع عموم-تثبيط γ-سيكريتاسي الناجمة عن ضابت. لدينا دراسات توفير دليل مباشر على أن أنشطة γ-سيكريتاسي تجاه ركائز مختلفة يمكن أن تكون متباينة في سياق خلوية. قد تكون هذه الاختبارات الجديدة وبالتالي أدوات مفيدة في اكتشاف الأدوية لتحسين العلاجات الإعلانية.

تثبيط ErbB2 من CL-387,785 يمكن أن تعزز خلطات معالجة التطبيق--C99 Γ --سيكريتاسي دون التأثير على الانقسام والدرجة إنشاء تحليل يستند إلى الخلية التي يمكن قياس كمي الانقسام proteolytic من الركازة خاصة γ-سيكريتاسي، نحن تولدها خط الخلية المستمدة من HEK293 الفريق ال?...

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Measurement of ÃŽÂ³-Secretase-mediated Amyloid Precursor Protein and Notch Cleavage in Cell-based Luciferase Reporter Assay Platforms at JoVE.com

Quantitative Measurement of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â³-Secretase-mediated Amyloid Precursor Protein and Notch Cleavage in Cell-based Luciferase Reporter Assay Platforms

القياس الكمي لبروتين اميلويد السلائف γ-سيكريتاسي-بوساطة والانقسام الشق في لوسيفراس يستند إلى الخلية مراسل منصات المقايسة

أننا قد ولدت بنجاح فحوصات محددة الركازة γ-سيكريتاسي اثنين. كلا فحوصات يستند إلى الخلية المعروضة هنا مصممة لقياس الأنشطة الانزيمية γ-سيكريتاسي عن طريق إخراج الصحافيين لوسيفراس اليراع.

We have developed a pair of cell-based reporter gene assays to quantitatively measure &#947;-secretase cleavage of distinct substrates. This manuscript ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Quantitative Measurement of &#947;-Secretase-mediated Amyloid Precursor Protein and Notch Cleavage in Cell-based Luciferase Reporter Assay Platforms

Selection of Aptamers for Amyloid &beta;-Protein, the Causative Agent of Alzheimer&#39;s Disease

Selection of Aptamers for Amyloid ÃƒÅ½Ã‚Â²-Protein, the Causative Agent of Alzheimer's Disease

اختيار الأبتامرات للبروتين اميلويد - β ، والمسبب لمرض الزهايمر

Alzheimer's disease (AD) is a progressive, age-dependent, neurodegenerative disorder with an insidious course that renders its presymptomatic diagnosis ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

تعيش خلية التصوير الحسي للخلايا السليمة في الجهاز السلائف ذبابة الفاكهة شرانق

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

A Galvanotaxis Assay for Analysis of Neural Precursor Cell Migration Kinetics in an Externally Applied Direct Current Electric Field

A الفحص انجذاب غلفاني لتحليل حركية العصبية السلائف الهجرة خلية في الحقل الحالي مباشرة التطبيقية خارجيا الكهربائية

The discovery of neural stem and progenitor  cells (collectively termed neural precursor cells) (NPCs) in the adult  mammalian brain has led to a body of ...

High-throughput Analysis of Mammalian Olfactory Receptors: Measurement of Receptor Activation via Luciferase Activity

تحليل الإنتاجية العالية من الثدييات شمي المستقبلات: قياس مستقبلات التنشيط عبر luciferase المراسل آخر

Odorants create unique and overlapping patterns of olfactory receptor activation, allowing a family of approximately 1,000 murine and 400 human receptors ...

Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

الكشف عن<em&gt; في الموقع</em&gt; مجمعات البروتين البروتين في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; اليرقية الموصل العصبي العضلي عن طريق القرب ربط الفحص

Discs large (Dlg) is a conserved member of the membrane-associated guanylate kinase family, and serves as a major scaffolding protein at the larval ...

Stereotaxic Infusion of Oligomeric Amyloid-beta into the Mouse Hippocampus

تسريب التجسيمي من بلازميدة قليلة القسيمات اميلويد بيتا في الحصين ماوس

Alzheimer&#8217;s disease is a neurodegenerative disease affecting the aging population. A key neuropathological feature of the disease is the ...

Quantitative Measurement of Relative Retinoic Acid Levels in E8.5 Embryos and Neurosphere Cultures Using the F9 RARE-Lacz Cell-based Reporter Assay

القياس الكمي لمستويات حمض الريتينويك النسبية في E8.5 الأجنة وNeurosphere الثقافات باستخدام F9 نادر-Lacz القائم على خلية مراسل الفحص

Retinoic acid (RA) is an important developmental morphogen that coordinates anteroposterior and dorsoventral axis patterning, somitic differentiation, ...

Modeling Amyloid-&#946;42 Toxicity and Neurodegeneration in Adult Zebrafish Brain

Modeling Amyloid-ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²42 Toxicity and Neurodegeneration in Adult Zebrafish Brain

النمذجة سمية اميلويد-β42 ونيوروديجينيريشن في المخ الزرد الكبار

Alzheimer's disease (AD) is a debilitating neurodegenerative disease in which accumulation of toxic amyloid-&#946;42 (A&#946;42) peptides leads to ...

Assay Development for High Content Quantification of Sod1 Mutant Protein Aggregate Formation in Living Cells

التنمية المقايسة للقياس الكمي المحتوى عالية Sod1 البروتين متحولة تشكيل التجميعية في الخلايا الحية

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disease that can be caused by inherited mutations in the gene encoding copper-zinc ...

Quantitative Autoradiographic Method for Determination of Regional Rates of Cerebral Protein Synthesis In Vivo

طريقة الأوتوراديوغرافية الكمية لتحديد المعدلات الإقليمية لتخليق البروتين الدماغي في فيفو

Protein synthesis is required for development and maintenance of neuronal function and is involved in adaptive changes in the nervous system. Moreover, it ...