Name: quantitative measurement of &#947;-secretase-mediated amyloid precursor protein and notch cleavage in cell-based luciferase reporter assay platforms
Uploaded: 2018-01-25T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Measurement of ÃŽÂ³-Secretase-mediated Amyloid Precursor Protein and Notch Cleavage in Cell-based Luciferase Reporter Assay Platforms at JoVE.com

De auteurs bedanken de faciliteit van de kern van het Instituut voor cellulaire en Organismic biologie, Academia Sinica, voor technische ondersteuning. Deze studie werd ondersteund door het ministerie van wetenschap en technologie, Taiwan (meest 103-2320-B-001-016-MY3 aan Y.-F. L.), het programma voor translationeel innovatie van biofarmaceutische ontwikkeling-technologie ter ondersteuning van Platform as in Scheme (NP7 aan Y.-F.L.), en de Academia Sinica (aan Y.-F.L.).

1. meting van de Luciferase verslaggever signalen, die met de splitsing van de γ-Secretase van APP-C99 of NΔE corresponderen
Opmerking: Raadpleeg de eerdere publicaties voor meer gedetailleerde beschrijvingen van de generatie van CG en NG cellen20,21.
<ol><li>
Zaad NG of CG cellen (20, 000 cellen/well) op 96-Wells microplates op een eindvolume van 200 μl per putje in groeimedium dat is samengesteld uit Dulbecco van bewerkt...

<ol>
	<li>Selkoe, D. J., Hardy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+amyloid+hypothesis+of+Alzheimer's+disease+at+25+years.">The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease at 25 years.</a> EMBO Mol Med. 8 (6), 595-608 (2016).</li><li>Wolfe, M. S., Guenette, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=APP+at+a+glance.">APP at a glance.</a> J Cell Sci. 120 (Pt 18), 3157-3161 (2007).</li><li>Karran, E., Mercken, M., De Strooper, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+amyloid+cascade+hypothesis+for+Alzheimer's+disease:+an+appraisal+for+the+development+of+therapeutics.">The amyloid cascade hypothesis for Alzheimer's disease: an appraisal for the development of therapeutics.</a> Nat Rev Drug Discov. 10 (9), 698-712 (2011).</li><li>Citron, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alzheimer's+disease:+strategies+for+disease+modification.">Alzheimer's disease: strategies for disease modification.</a> Nat Rev Drug Discov. 9 (5), 387-398 (2010).</li><li>Vassar, R., Kovacs, D. M., Yan, R., Wong, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+beta-secretase+enzyme+BACE+in+health+and+Alzheimer's+disease:+regulation,+cell+biology,+function,+and+therapeutic+potential.">The beta-secretase enzyme BACE in health and Alzheimer's disease: regulation, cell biology, function, and therapeutic potential.</a> J Neurosci. 29 (41), 12787-12794 (2009).</li><li>Parks, A. L., Curtis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presenilin+diversifies+its+portfolio.">Presenilin diversifies its portfolio.</a> Trends Genet. 23 (3), 140-150 (2007).</li><li>Kukar, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate-targeting+gamma-secretase+modulators.">Substrate-targeting gamma-secretase modulators.</a> Nature. 453 (7197), 925-929 (2008).</li><li>Kounnas, M. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+gamma-secretase+reduces+beta-amyloid+deposition+in+a+transgenic+mouse+model+of+Alzheimer's+disease.">Modulation of gamma-secretase reduces beta-amyloid deposition in a transgenic mouse model of Alzheimer's disease.</a> Neuron. 67 (5), 769-780 (2010).</li><li>Thathiah, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+orphan+G+protein-coupled+receptor+3+modulates+amyloid-beta+peptide+generation+in+neurons.">The orphan G protein-coupled receptor 3 modulates amyloid-beta peptide generation in neurons.</a> Science. 323 (5916), 946-951 (2009).</li><li>Flajolet, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Alzheimer's+disease+amyloid-beta+formation+by+casein+kinase+I.">Regulation of Alzheimer's disease amyloid-beta formation by casein kinase I.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (10), 4159-4164 (2007).</li><li>Eisele, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gleevec+increases+levels+of+the+amyloid+precursor+protein+intracellular+domain+and+of+the+amyloid-beta+degrading+enzyme+neprilysin.">Gleevec increases levels of the amyloid precursor protein intracellular domain and of the amyloid-beta degrading enzyme neprilysin.</a> Mol Biol Cell. 18 (9), 3591-3600 (2007).</li><li>He, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gamma-secretase+activating+protein+is+a+therapeutic+target+for+Alzheimer's+disease.">Gamma-secretase activating protein is a therapeutic target for Alzheimer's disease.</a> Nature. 467 (7311), 95-98 (2010).</li><li>Haapasalo, A., Kovacs, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+many+substrates+of+presenilin/gamma-secretase.">The many substrates of presenilin/gamma-secretase.</a> J Alzheimers Dis. 25 (1), 3-28 (2011).</li><li>Gillman, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+and+Evaluation+of+BMS-708163,+a+Potent,+Selective+and+Orally+Bioavailable+gamma-Secretase+Inhibitor.">Discovery and Evaluation of BMS-708163, a Potent, Selective and Orally Bioavailable gamma-Secretase Inhibitor.</a> ACS Med Chem Lett. 1 (3), 120-124 (2010).</li><li>Hopkins, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ACS+chemical+neuroscience+molecule+spotlight+on+Begacestat+(GSI-953).">ACS chemical neuroscience molecule spotlight on Begacestat (GSI-953).</a> ACS Chem Neurosci. 3 (1), 3-4 (2012).</li><li>Yang, T., Arslanova, D., Gu, Y., Augelli-Szafran, C., Xia, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+gamma-secretase+modulation+differentiates+inhibitor+compound+selectivity+between+two+substrates+Notch+and+amyloid+precursor+protein.">Quantification of gamma-secretase modulation differentiates inhibitor compound selectivity between two substrates Notch and amyloid precursor protein.</a> Mol Brain. 1, 15 (2008).</li><li>McKee, T. D., Loureiro, R. M., Dumin, J. A., Zarayskiy, V., Tate, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+cell-based+method+for+determining+the+gamma-secretase+enzyme+activity+against+both+Notch+and+APP+substrates.">An improved cell-based method for determining the gamma-secretase enzyme activity against both Notch and APP substrates.</a> J Neurosci Methods. 213 (1), 14-21 (2013).</li><li>Basi, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+precursor+protein+selective+gamma-secretase+inhibitors+for+treatment+of+Alzheimer's+disease.">Amyloid precursor protein selective gamma-secretase inhibitors for treatment of Alzheimer's disease.</a> Alzheimers Res Ther. 2 (6), 36 (2010).</li><li>Liao, Y. F., Tang, Y. C., Chang, M. Y., Wang, B. J., Hu, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+small+molecular+(D)-leucinamides+as+potent,+Notch-sparing+gamma-secretase+modulators.">Discovery of small molecular (D)-leucinamides as potent, Notch-sparing gamma-secretase modulators.</a> Eur J Med Chem. 79, 143-151 (2014).</li><li>Liao, Y. F., Wang, B. J., Cheng, H. T., Kuo, L. H., Wolfe, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+necrosis+factor-alpha,+interleukin-1beta,+and+interferon-gamma+stimulate+gamma-secretase-mediated+cleavage+of+amyloid+precursor+protein+through+a+JNK-dependent+MAPK+pathway.">Tumor necrosis factor-alpha, interleukin-1beta, and interferon-gamma stimulate gamma-secretase-mediated cleavage of amyloid precursor protein through a JNK-dependent MAPK pathway.</a> J Biol Chem. 279 (47), 49523-49532 (2004).</li><li>Wang, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ErbB2+regulates+autophagic+flux+to+modulate+the+proteostasis+of+APP-CTFs+in+Alzheimer's+disease.">ErbB2 regulates autophagic flux to modulate the proteostasis of APP-CTFs in Alzheimer's disease.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (15), E3129-E3138 (2017).</li><li>Sevigny, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+antibody+aducanumab+reduces+Abeta+plaques+in+Alzheimer's+disease.">The antibody aducanumab reduces Abeta plaques in Alzheimer's disease.</a> Nature. 537 (7618), 50-56 (2016).</li><li>Golde, T. E., Koo, E. H., Felsenstein, K. M., Osborne, B. A., Miele, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=gamma-Secretase+inhibitors+and+modulators.">gamma-Secretase inhibitors and modulators.</a> Biochim Biophys Acta. 1828 (12), 2898-2907 (2013).</li><li>Coric, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Prodromal+Alzheimer+Disease+With+Avagacestat:+A+Randomized+Clinical+Trial.">Targeting Prodromal Alzheimer Disease With Avagacestat: A Randomized Clinical Trial.</a> JAMA Neurol. 72 (11), 1324-1333 (2015).</li><li>Mitani, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+between+gamma-secretase+inhibitors+and+modulators+on+cognitive+function+in+amyloid+precursor+protein-transgenic+and+nontransgenic+mice.">Differential effects between gamma-secretase inhibitors and modulators on cognitive function in amyloid precursor protein-transgenic and nontransgenic mice.</a> J Neurosci. 32 (6), 2037-2050 (2012).</li><li>Penninkilampi, R., Brothers, H. M., Eslick, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+Agents+Targeting+gamma-Secretase+Increase+Risk+of+Cancer+and+Cognitive+Decline+in+Alzheimer's+Disease+Patients:+A+Systematic+Review+and+Meta-Analysis.">Pharmacological Agents Targeting gamma-Secretase Increase Risk of Cancer and Cognitive Decline in Alzheimer's Disease Patients: A Systematic Review and Meta-Analysis.</a> J Alzheimers Dis. 53 (4), 1395-1404 (2016).</li></ol>

De veelbelovende resultaten van een fase 1b trial van aducanumab immunotherapie voor AD de kritische rol van Aβ hebben verankerd in de pathogenese van AD22 en suggereren dat anti-Aβ benaderingen nog steeds een levensvatbare strategie voor de ontwikkeling van anti-van de AD geneesmiddelen. We beschrijven hier, cel-gebaseerde testen voor het kwantificeren van de γ-secretase-gekatalyseerde proteolyse van APP-C99 en NΔE met behulp van firefly luciferase verslaggever systemen. APP-C99 en NΔE zijn ...

Oligomere vormen van amyloid-β (Aβ) worden verondersteld te zijn de primaire oorzaak van neurodegeneratie in de hersenen van patiënten die lijden aan de ziekte van Alzheimer (AD)1. Aβ peptides worden geproduceerd door de stapsgewijze splitsing van amyloïde precursor eiwit (APP), eerst door β-secretase, en vervolgens door γ-secretase2. In het afgelopen decennium, hebben therapeutische benaderingen naar behandeling van advertentie gericht op de preventie van Aβ productie3. De meerderheid van de studies hebben gericht op ofwel de vergroting van α-secretase activiteit, die kan beletsel γ-secretase splitsing van APP en daardoor verminderen de productie van Aβ of de remming van β-en/of γ-secretase activiteiten4. Helaas, niet-selectieve inhibitie van β - of γ-secretases resultaten in onvermijdelijk bijwerkingen zijn die als gevolg van interferentie met de werking van andere fysiologische substraten voor β - en γ-secretase5,6. Ten aanzien van de γ-secretase-remmers, hebben recente studies gerapporteerd de ontdekking van een aantal chemische en genetische modulatoren die Aβ productie regelen kan filtreerpapier te verwaarlozen effecten op de essentiële γ-secretase-gemedieerde verwerking van Inkeping7 ,8,9,10,11,12, echter succesvol therapeutics zijn nog niet ontwikkeld. Dus zijn verdere systematische schermen gerechtvaardigd om te ontdekken van nieuwe genetische en chemische parameters die selectief γ-secretase-gemedieerde APP verwerking moduleren kunnen.
Γ-Secretase is bekend dat het klieven van meer dan 90 verschillende membraan-verankerd eiwitten. Onder deze substraten is Notch, waarvan de activiteit is van cruciaal belang voor de cel lot vastberadenheid en differentiatie tijdens ontwikkeling13. Selectief modulerende γ-secretase-gekatalyseerde APP verwerking in de afwezigheid van invloed zijn op de inkeping verwerking essentieel voor minimaliseren Notch-gerelateerde bijwerkingen van γ-secretase-remmers, en deze selectiviteit wordt beschouwd als een primaire factor die zal dicteren van de biologische werkzaamheid van potentiële γ-secretase modulatoren voor de chronische behandeling van AD. Er zijn een aantal arylsulfonamide derivaten, zoals GSI-953 (begacestat) en BMS-708163 (avagacestat), die zijn gevonden om te exposeren krachtige en selectieve remming van de γ-secretase14,15. Een eerdere studie heeft aangetoond dat de differentiële remming van de γ-secretase splitsing van APP en Notch kan worden waargenomen met behulp van een kwantitatieve ELISA gebaseerde bepaling in combinatie met in vivo validatie met behulp van de zebravis16. Bovendien zijn assay cel-gebaseerde paradigma's vastgesteld om aan te pakken van de potentiële substraat selectiviteit van γ-secretase naar APP en Notch17,18. Met behulp van protocollen vergelijkbaar met die beschreven hierin, we hebben onlangs ontdekt een nieuwe klasse van (D)-leucinamides die krachtig γ-secretase splitsing van APP met inkeping-sparend selectiviteit19 moduleren. Samen, biedt deze collectie van studies een bewijs-van-concept ter ondersteuning van het idee dat het substraat selectiviteit en beschikbaarheid van γ-secretase onderworpen aan chemische modulatie en experimentele verificatie worden kan. Echter, deze assay platformen vaak rekenen op relatief lage-doorvoer uitlezingen en arbeidsintensieve benaderingen die mogelijk niet voldoen aan industriële normen voor de drug discovery-programma's.
We hebben recentelijk gegenereerde cel-gebaseerde luciferase reporter gene assays die kwantitatief bepalend kunnen zijn voor de katalytische activiteit van γ-secretase naar twee verschillende substraten, de 99-amino acid C-terminal fragment van APP (APP-C99) en de extracellulaire domein-verwijderd Notch peptide (NΔE). Zowel de NΔE als de APP-C99 hebben wijd gebruikt als directe substraten voor γ-secretase in verschillende testen. Voor het genereren van homogene en consistente luciferase reporter gene assays voor de splitsing van de γ-secretase van APP-C99 of NΔE, we genereerden een HEK afkomstige stabiele cellijn (CG) die constitutively een Gal4 promotor gestuurde firefly luciferase verslaggever (uitdrukt Gal4-Luc) en Gal4/VP16-gelabeld APP-C99 fusieproteïne (C99-GV). Bovendien, we genereerden een ander HEK afkomstige stabiele cellijn (NG) die constitutively Gal4-Luc en Gal4/VP16-gelabeld NΔE (NΔE-GV uitdrukt). Met behulp van deze roman substraat-specifieke γ-secretase-tests, bieden we nu een methode om te kwantificeren en te onderscheiden van de katalytische activiteit van γ-secretase naar verschillende substraten (APP-C99 in CG cellen) of NΔE in NG cellen. Bovendien waren de substraat-specifieke γ-secretase-tests ontworpen om dat bevorderlijk is voor hoge-content screening platformen. Deze tests nieuw gegenereerde γ-secretase zou de weg vrij voor de ontdekking van nieuwe γ-secretase modulatoren, die zouden kunnen cognitieve functie verbeteren door het onderdrukken van Aβ productie zonder aanleiding kunnen geven tot ongewenste remming van de inkeping voor de behandeling van de volgende generatie van advertentie.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>VictorLight luminescence plate reader</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>2030-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Class II, Type 2 Biological Safety Cabinet</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1300 Series A2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CL-387,785</td>
			<td>EMD Calbiochem</td>
			<td>233100-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPT</td>
			<td>Merck</td>
			<td>565770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12100046</td>
			<td>main compnent of growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>16000044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blasticidin</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A1113903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeocin</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>R25005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygromycin B</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10687010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytomer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>BR717805 Aldrich</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well microplate</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>156545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T7660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steady-Glo luciferase assay reagent</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidified CO2 incubator</td>
			<td>Revco</td>
			<td>Ultima II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-REx293 cell line</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R71007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wallac 1420 software version 3.0</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td>instrument control software of the luminescence microplate reader</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative measurement of &#947;-secretase-mediated amyloid precursor protein and notch cleavage in cell-based luciferase reporter assay platforms

We hebben een paar van cel-gebaseerde reporter gene assays voor het kwantitatief meten van γ-secretase splitsing van verschillende substraten ontwikkeld. Dit manuscript worden procedures beschreven die kunnen worden gebruikt om te controleren γ-secretase-gemedieerde splitsing van APP-C99 of Inkeping, met behulp van een Gal4 promotor gestuurde firefly luciferase verslaggever systeem. Deze testen werden opgericht door stabiel transfecting mede HEK293 cellen met het Gal4-gedreven luciferase verslaggever gen en ofwel het C-terminal Gal4/VP16-gelabeld fragment van APP (APP-C99; CG-cellen), of de Gal4/VP16-gelabeld Notch-ΔE (NΔE; NG cellen). Met behulp van deze verslaggever assays parallel, we hebben aangetoond dat een ErbB2-remmer, CL-387,785, bij voorkeur γ-secretase splitsing van APP-C99 in CG cellen, maar niet NΔE in NG cellen kunt onderdrukken. De differentiële reacties tentoongesteld door de CG en NG cellen, wanneer behandeld met CL-387,785, vertegenwoordigen een voorkeur kenmerkend voor γ-secretase modulatoren, en deze antwoorden staan in schril contrast tot de pan-remming van de γ-secretase geïnduceerd door DAPT. Ons onderzoek levert direct bewijs dat γ-secretase activiteiten naar verschillende ondergronden kunnen worden onderscheiden in een cellulaire context. Deze nieuwe testen kunnen dus nuttige hulpmiddelen in drugontdekking voor verbeterde AD therapieën.

Remming van ErbB2 door CL-387,785 kan de verwerking van APP-C99 door differentieel bevorderen Γ -secretase zonder Notch decollete Om vast te stellen een cel-gebaseerde test die kwantitatief het Proteolytische splijten van een bijzonder γ-secretase substraat kan meten, we genereerden de HEK293 afkomstige CG cellijn door stabiele CO transfectie van een tetracycline-afleidbare C-terminaal Gal4/VP16-gelabeld APP-C99 en een Gal4 promotor ...

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Measurement of ÃŽÂ³-Secretase-mediated Amyloid Precursor Protein and Notch Cleavage in Cell-based Luciferase Reporter Assay Platforms at JoVE.com

Quantitative Measurement of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â³-Secretase-mediated Amyloid Precursor Protein and Notch Cleavage in Cell-based Luciferase Reporter Assay Platforms

Kwantitatieve meting van de γ-Secretase-gemedieerde amyloïde Precursor proteïne en Notch decollete in cel-gebaseerde Luciferase verslaggever Assay platformen

We hebben met succes twee substraat-specifieke γ-secretase tests gegenereerd. Zowel cel-gebaseerde testen hier gepresenteerd zijn ontworpen om het kwantificeren van de enzymatische activiteiten γ-secretase via de uitgang van firefly luciferase verslaggevers.

We have developed a pair of cell-based reporter gene assays to quantitatively measure &#947;-secretase cleavage of distinct substrates. This manuscript ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Quantitative Measurement of &#947;-Secretase-mediated Amyloid Precursor Protein and Notch Cleavage in Cell-based Luciferase Reporter Assay Platforms

Selection of Aptamers for Amyloid &beta;-Protein, the Causative Agent of Alzheimer&#39;s Disease

Selection of Aptamers for Amyloid ÃƒÅ½Ã‚Â²-Protein, the Causative Agent of Alzheimer's Disease

Selectie van Aptameren voor amyloid β-eiwit, de verwekker van de ziekte van Alzheimer

Alzheimer's disease (AD) is a progressive, age-dependent, neurodegenerative disorder with an insidious course that renders its presymptomatic diagnosis ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell imaging van zintuig voorloper cellen in Intact Drosophila Poppen

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

A Galvanotaxis Assay for Analysis of Neural Precursor Cell Migration Kinetics in an Externally Applied Direct Current Electric Field

Een Galvanotaxis Assay voor Analyse van neurale precursoren celmigratie Kinetics in een extern aangelegd Direct Current Electric Field

The discovery of neural stem and progenitor  cells (collectively termed neural precursor cells) (NPCs) in the adult  mammalian brain has led to a body of ...

High-throughput Analysis of Mammalian Olfactory Receptors: Measurement of Receptor Activation via Luciferase Activity

High-throughput analyse van zoogdieren reukreceptoren: Meting van de Receptor Activering via Luciferaseactiviteit

Odorants create unique and overlapping patterns of olfactory receptor activation, allowing a family of approximately 1,000 murine and 400 human receptors ...

Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

Detectie van<em&gt; In Situ</em&gt; Eiwit-eiwit complexen in de<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvale Neuromusculaire Junction Met behulp van Proximity ligatiebepaling

Discs large (Dlg) is a conserved member of the membrane-associated guanylate kinase family, and serves as a major scaffolding protein at the larval ...

Stereotaxic Infusion of Oligomeric Amyloid-beta into the Mouse Hippocampus

Stereotaxische Infusion van Oligomere amyloid-beta in de Mouse Hippocampus

Alzheimer&#8217;s disease is a neurodegenerative disease affecting the aging population. A key neuropathological feature of the disease is the ...

Quantitative Measurement of Relative Retinoic Acid Levels in E8.5 Embryos and Neurosphere Cultures Using the F9 RARE-Lacz Cell-based Reporter Assay

Kwantitatieve meting van relatieve retinoïnezuur Levels in E8.5 embryo&#39;s en neurosfeerculturen Met behulp van de F9 RARE-lacZ-Cell gebaseerde Reporter Assay

Retinoic acid (RA) is an important developmental morphogen that coordinates anteroposterior and dorsoventral axis patterning, somitic differentiation, ...

Modeling Amyloid-&#946;42 Toxicity and Neurodegeneration in Adult Zebrafish Brain

Modeling Amyloid-ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²42 Toxicity and Neurodegeneration in Adult Zebrafish Brain

Modelleren van Amyloid-β42 toxiciteit en neurodegeneratie in volwassen Zebrafish hersenen

Alzheimer's disease (AD) is a debilitating neurodegenerative disease in which accumulation of toxic amyloid-&#946;42 (A&#946;42) peptides leads to ...

Assay Development for High Content Quantification of Sod1 Mutant Protein Aggregate Formation in Living Cells

Assay ontwikkeling voor hoge inhoud kwantificering van Sod1 Mutant eiwit statistische vorming in levende cellen

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disease that can be caused by inherited mutations in the gene encoding copper-zinc ...

Quantitative Autoradiographic Method for Determination of Regional Rates of Cerebral Protein Synthesis In Vivo

Kwantitatieve autoradiografische methode voor de bepaling van de regionale tarieven van cerebrale eiwitsynthese in vivo

Protein synthesis is required for development and maintenance of neuronal function and is involved in adaptive changes in the nervous system. Moreover, it ...