Name: quantitative measurement of &#947;-secretase-mediated amyloid precursor protein and notch cleavage in cell-based luciferase reporter assay platforms
Uploaded: 2018-01-25T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Measurement of ÃŽÂ³-Secretase-mediated Amyloid Precursor Protein and Notch Cleavage in Cell-based Luciferase Reporter Assay Platforms at JoVE.com

Les auteurs remercient le laboratoire central de l’Institut de cellulaire et la biologie organismique, l’Academia Sinica, pour le support technique. Cette étude a été financée par le ministère de la Science et technologie, Taïwan (plus 103-2320-B-001-016-MY3 à Y.-F. L.), le programme d’Innovation translationnelle du développement biopharmaceutique – technologie supportant la plateforme Axis Scheme (NP7 à Y.-F.L.) et l’Académie chinoise des sciences (à Y.-F.L.).

1. mesure des signaux rapporteur luciférase qui Correspond au clivage de la γ-sécrétase des APP-C99 ou NΔE
Remarque : Veuillez consulter les publications précédentes pour obtenir une description détaillée de la génération de CG et NG cellules20,21.
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Graines de cellules NG ou CG (20, 000 cellules/puits) sur Microplaque 96 puits à un volume final de 200 μL/puits dans le milieu qui est composé de Eagle mod...

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	<li>Selkoe, D. J., Hardy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+amyloid+hypothesis+of+Alzheimer's+disease+at+25+years.">The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease at 25 years.</a> EMBO Mol Med. 8 (6), 595-608 (2016).</li><li>Wolfe, M. S., Guenette, S. 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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate-targeting+gamma-secretase+modulators.">Substrate-targeting gamma-secretase modulators.</a> Nature. 453 (7197), 925-929 (2008).</li><li>Kounnas, M. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+gamma-secretase+reduces+beta-amyloid+deposition+in+a+transgenic+mouse+model+of+Alzheimer's+disease.">Modulation of gamma-secretase reduces beta-amyloid deposition in a transgenic mouse model of Alzheimer's disease.</a> Neuron. 67 (5), 769-780 (2010).</li><li>Thathiah, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+orphan+G+protein-coupled+receptor+3+modulates+amyloid-beta+peptide+generation+in+neurons.">The orphan G protein-coupled receptor 3 modulates amyloid-beta peptide generation in neurons.</a> Science. 323 (5916), 946-951 (2009).</li><li>Flajolet, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Alzheimer's+disease+amyloid-beta+formation+by+casein+kinase+I.">Regulation of Alzheimer's disease amyloid-beta formation by casein kinase I.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (10), 4159-4164 (2007).</li><li>Eisele, Y. 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A., Zarayskiy, V., Tate, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+cell-based+method+for+determining+the+gamma-secretase+enzyme+activity+against+both+Notch+and+APP+substrates.">An improved cell-based method for determining the gamma-secretase enzyme activity against both Notch and APP substrates.</a> J Neurosci Methods. 213 (1), 14-21 (2013).</li><li>Basi, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+precursor+protein+selective+gamma-secretase+inhibitors+for+treatment+of+Alzheimer's+disease.">Amyloid precursor protein selective gamma-secretase inhibitors for treatment of Alzheimer's disease.</a> Alzheimers Res Ther. 2 (6), 36 (2010).</li><li>Liao, Y. F., Tang, Y. C., Chang, M. Y., Wang, B. J., Hu, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+small+molecular+(D)-leucinamides+as+potent,+Notch-sparing+gamma-secretase+modulators.">Discovery of small molecular (D)-leucinamides as potent, Notch-sparing gamma-secretase modulators.</a> Eur J Med Chem. 79, 143-151 (2014).</li><li>Liao, Y. F., Wang, B. J., Cheng, H. T., Kuo, L. H., Wolfe, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+necrosis+factor-alpha,+interleukin-1beta,+and+interferon-gamma+stimulate+gamma-secretase-mediated+cleavage+of+amyloid+precursor+protein+through+a+JNK-dependent+MAPK+pathway.">Tumor necrosis factor-alpha, interleukin-1beta, and interferon-gamma stimulate gamma-secretase-mediated cleavage of amyloid precursor protein through a JNK-dependent MAPK pathway.</a> J Biol Chem. 279 (47), 49523-49532 (2004).</li><li>Wang, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ErbB2+regulates+autophagic+flux+to+modulate+the+proteostasis+of+APP-CTFs+in+Alzheimer's+disease.">ErbB2 regulates autophagic flux to modulate the proteostasis of APP-CTFs in Alzheimer's disease.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (15), E3129-E3138 (2017).</li><li>Sevigny, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+antibody+aducanumab+reduces+Abeta+plaques+in+Alzheimer's+disease.">The antibody aducanumab reduces Abeta plaques in Alzheimer's disease.</a> Nature. 537 (7618), 50-56 (2016).</li><li>Golde, T. E., Koo, E. H., Felsenstein, K. M., Osborne, B. A., Miele, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=gamma-Secretase+inhibitors+and+modulators.">gamma-Secretase inhibitors and modulators.</a> Biochim Biophys Acta. 1828 (12), 2898-2907 (2013).</li><li>Coric, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Prodromal+Alzheimer+Disease+With+Avagacestat:+A+Randomized+Clinical+Trial.">Targeting Prodromal Alzheimer Disease With Avagacestat: A Randomized Clinical Trial.</a> JAMA Neurol. 72 (11), 1324-1333 (2015).</li><li>Mitani, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+between+gamma-secretase+inhibitors+and+modulators+on+cognitive+function+in+amyloid+precursor+protein-transgenic+and+nontransgenic+mice.">Differential effects between gamma-secretase inhibitors and modulators on cognitive function in amyloid precursor protein-transgenic and nontransgenic mice.</a> J Neurosci. 32 (6), 2037-2050 (2012).</li><li>Penninkilampi, R., Brothers, H. M., Eslick, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+Agents+Targeting+gamma-Secretase+Increase+Risk+of+Cancer+and+Cognitive+Decline+in+Alzheimer's+Disease+Patients:+A+Systematic+Review+and+Meta-Analysis.">Pharmacological Agents Targeting gamma-Secretase Increase Risk of Cancer and Cognitive Decline in Alzheimer's Disease Patients: A Systematic Review and Meta-Analysis.</a> J Alzheimers Dis. 53 (4), 1395-1404 (2016).</li></ol>

Des résultats prometteurs d’un essai de phase 1 b sur de l’immunothérapie aducanumab AD ont fermement établi le rôle essentiel des bêta-amyloïdes dans la pathogenèse des AD22 et suggèrent que les approches anti-bêta-amyloïdes sont toujours une stratégie viable pour le développement de médicaments anti-AD. Nous décrivons ici les analyses cellulaires pour quantifier la protéolyse catalysée par γ-sécrétase des APP-C99 et NΔE à l’aide de systèmes de rapporteur luciférase f...

Les formes oligomères de β amyloïde (Aß) sont censés être la cause principale de la neurodégénérescence dans le cerveau des patients souffrant de la maladie d’Alzheimer (ma)1. Les peptides bêta-amyloïdes sont produites par le clivage progressif de la protéine précurseur de l’amyloïde (APP), tout d’abord par la β-secretase, puis par γ-sécrétase2. Au cours de la dernière décennie, des approches thérapeutiques vers un traitement d’AD ont mis l’accent sur la prévention de la production de bêta-amyloïdes3. La majorité des études ont porté sur soit l’augmentation de l’activité α-secretase, ce qui peut empêcher la γ-secretase clivage de l’APP et ainsi diminuer la production de bêta-amyloïdes ou l’inhibition de la β-et/ou γ-sécrétase activités4. Malheureusement, l’inhibition non-sélective de β - ou γ-secrétases entraîne des effets secondaires inévitables qui sont en raison de l’interférence avec le fonctionnement d’autres substrats physiologiques de β - et γ-sécrétase5,6. En ce qui concerne les inhibiteurs de la γ-secretase, des études récentes ont signalé la découverte d’un certain nombre de modulateurs chimiques et génétiques qui peuvent réglementer la production de bêta-amyloïdes tout en exerçant des effets négligeables sur la transformation de γ-sécrétase-mediated essentielle des encoche7 ,8,9,10,11,12, cependant, succès thérapeutiques n’ont pas encore été développé. Ainsi, plus systématiques écrans sont garantis pour découvrir de nouveaux modificateurs génétiques et chimiques qui pourraient moduler sélectivement le traitement d’APP véhiculée par γ-sécrétase.
Γ-sécrétase est connue en conjonction avec plus de 90 différentes protéines ancrées à la membrane. Parmi ces substrats est ordre, dont l’activité est essentielle pour déterminer le destin cellulaire et différenciation au cours du développement,13. Modulant sélectivement catalysée par γ-sécrétase APP traitement en l’absence d’affecter le cran traitement seront essentiel pour minimiser Notch-effets secondaires des inhibiteurs de la γ-secretase, et cette sélectivité est considérée comme des principaux facteurs qui seront dicter l’efficacité biologique de modulateurs de γ-sécrétase potentiels pour le traitement chronique de AD. Il y a eu un certain nombre de dérivés arylsulfonamide, tels que GSI-953 (begacestat) et le BMS-708163 (avagacestat), qui ont été affectés présentent une inhibition puissante et sélective de la γ-sécrétase14,15. Une étude antérieure a montré que l’inhibition différentielle de γ-sécrétase clivage de l’APP et l’encoche peut être observée à l’aide d’un test quantitatif par ELISA en combinaison avec validation en vivo à l’aide de poisson-zèbre,16. En outre, paradigmes de test basés sur les cellules ont été établis pour traiter la sélectivité de substrat potentiels de la γ-secretase vers APP et Notch17,18. À l’aide des protocoles similaires à celles décrites dans les présentes, nous avons récemment découvert une nouvelle classe de (D)-leucinamides qui modulent puissamment γ-sécrétase clivage de l’APP avec encoche d’épargne sélectivité19. Ensemble, ce recueil d’études fournit une preuve de concept soutenant l’idée que la sélectivité/disponibilité des substrats de la γ-secretase peut être soumis à la modulation chimique et vérification expérimentale. Toutefois, ces plates-formes de dosage dépendent souvent relativement faible débit lectures et approches à forte main-d'oeuvre qui pourraient respectent pas les normes industrielles pour les programmes de recherche.
Nous avons généré récemment dosages de gène de journaliste luciférase à base de cellules qui peuvent de déterminer quantitativement l’activité catalytique de la γ-secretase vers deux substrats distincts, le fragment de C-terminal acid amino-99 d’APP (APP-C99) et l’extracellulaire domaine-supprimé un peptide Notch (NΔE). Les APP-C99 et NΔE ont été couramment comme substrats directes de la γ-secretase lors d’essais différents. Pour générer des essais de gène journaliste luciférase homogène et cohérente pour le clivage de la γ-secretase de APP-C99 ou NΔE, nous avons généré une ligne de cellule stables dérivés HEK (CG) qui exprime constitutivement une Gal4 pilotée par le promoteur firefly luciferase reporter ( GAL4-Luc) et la protéine de fusion de Gal4/VP16-tag APP-C99 (C99-GV). En outre, nous avons généré une autre ligne de cellule stables dérivés HEK (NG) qui exprime constitutivement Gal4-Luc et Gal4/VP16-le tag NΔE (NΔE-GV). À l’aide de ces tests de nouveaux substrats spécifiques γ-secretase, nous fournissons maintenant une méthode permettant de quantifier et de distinguer l’activité catalytique de la γ-secretase vers différents substrats (APP-C99 dans les cellules CG), ou NΔE dans les cellules de NG. En outre, les dosages de substrat spécifique γ-sécrétase visaient à être propice aux plates-formes de criblage de haute teneur. Ces tests nouvellement généré γ-sécrétase pourraient ouvrir la voie à la découverte de nouveaux γ-sécrétase modulateurs susceptibles d’améliorer la fonction cognitive de supprimer la production de bêta-amyloïdes sans suscitant indésirable inhibition de cran pour le traitement de la nouvelle génération de AD.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>VictorLight luminescence plate reader</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>2030-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Class II, Type 2 Biological Safety Cabinet</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1300 Series A2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CL-387,785</td>
			<td>EMD Calbiochem</td>
			<td>233100-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPT</td>
			<td>Merck</td>
			<td>565770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12100046</td>
			<td>main compnent of growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>16000044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blasticidin</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A1113903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeocin</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>R25005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygromycin B</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10687010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytomer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>BR717805 Aldrich</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well microplate</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>156545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T7660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steady-Glo luciferase assay reagent</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidified CO2 incubator</td>
			<td>Revco</td>
			<td>Ultima II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-REx293 cell line</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R71007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wallac 1420 software version 3.0</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td>instrument control software of the luminescence microplate reader</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative measurement of &#947;-secretase-mediated amyloid precursor protein and notch cleavage in cell-based luciferase reporter assay platforms

Nous avons mis au point une paire de reporter sur les cellules des épreuves de gène pour mesurer quantitativement la γ-secretase clivage des substrats distincts. Ce manuscrit décrit les procédures qui peuvent être utilisés pour surveiller le clivage γ-sécrétase-mediated de APP-C99 ou Notch, utilisant un système de Gal4 firefly pilotée par le promoteur luciferase reporter. Ces tests ont été établies par stablement co transfectants cellules HEK293 avec le gène rapporteur luciférase axée sur la famille Gal4 et soit le fragment de Gal4/VP16-tag C-terminale de l’APP (APP-C99 ; Cellules CG), ou le tag Gal4/VP16 cran-ΔE (NΔE ; Cellules NG). À l’aide de ces tests de journaliste en parallèle, nous avons démontré qu’un inhibiteur de l’ErbB2, CL-387 785, préférentiellement pour supprimer le clivage γ-sécrétase des APP-C99 dans les cellules CG, mais pas NΔE dans les cellules de NG. Les réponses différentielles exposées par les cellules de la CG et NG, avec CL-387 785, représentent une caractéristique préférée pour modulateurs de la γ-secretase, et ces réponses sont en contraste frappant avec le pan-inhibition de la γ-secretase induite par DAPT. Nos études fournissent des preuves directes que les activités de γ-sécrétase vers différents substrats peuvent être différenciées dans un contexte cellulaire. Ces nouveaux tests peuvent donc être des outils utiles à la découverte de médicaments pour l’amélioration des traitements AD.

Inhibition de ErbB2 par CL-387 785 peut promouvoir différentiellement le traitement des APP-C99 par Γ -sécrétase sans affecter le clivage de l’encoche Pour établir un test cellulaire qui permet de mesurer quantitativement le clivage protéolytique d’un substrat particulier γ-secretase, nous avons généré la lignée de cellules HEK293 dérivés CG par transfection stable de co d’une tétracycline-inducible terminalement Ga...

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Measurement of ÃŽÂ³-Secretase-mediated Amyloid Precursor Protein and Notch Cleavage in Cell-based Luciferase Reporter Assay Platforms at JoVE.com

Quantitative Measurement of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â³-Secretase-mediated Amyloid Precursor Protein and Notch Cleavage in Cell-based Luciferase Reporter Assay Platforms

Mesure quantitative de la protéine précurseur de l’amyloïde véhiculée par γ-sécrétase et Notch clivage dans Cell-based Luciferase Reporter Assay plates-formes

Nous avons généré avec succès deux essais de substrat spécifique γ-sécrétase. Les deux analyses cellulaires présentés ici visent à quantifier les activités enzymatiques de la γ-secretase via la sortie de reporters luciférase firefly.

We have developed a pair of cell-based reporter gene assays to quantitatively measure &#947;-secretase cleavage of distinct substrates. This manuscript ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Quantitative Measurement of &#947;-Secretase-mediated Amyloid Precursor Protein and Notch Cleavage in Cell-based Luciferase Reporter Assay Platforms

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Sélection d&#39;aptamères pour amyloïde β-protéine, l&#39;agent causal de la maladie d&#39;Alzheimer

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Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disease that can be caused by inherited mutations in the gene encoding copper-zinc ...

Quantitative Autoradiographic Method for Determination of Regional Rates of Cerebral Protein Synthesis In Vivo

Méthode autoradiographique quantitative pour la détermination des taux régionaux de synthèse des protéines cérébrales In Vivo

Protein synthesis is required for development and maintenance of neuronal function and is involved in adaptive changes in the nervous system. Moreover, it ...