Name: quantitative measurement of &#947;-secretase-mediated amyloid precursor protein and notch cleavage in cell-based luciferase reporter assay platforms
Uploaded: 2018-01-25T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Measurement of ÃŽÂ³-Secretase-mediated Amyloid Precursor Protein and Notch Cleavage in Cell-based Luciferase Reporter Assay Platforms at JoVE.com

Die Autoren danken den Core Facility der Institute der zellulären und Organismische Biologie, Academia Sinica, für technischen Support. Diese Studie wurde unterstützt durch das Ministerium für Wissenschaft und Technologie, Taiwan (die meisten 103-2320-B-001-016-MY3, Y.-F. L.), das Programm für Translationale Innovation der biopharmazeutischen Entwicklung – Technologie unterstützt Plattform Achse Schema (NP7, Y. v.l.), und Academia Sinica (, Y.-v.l.).

1. Messung der Luciferase Reporter Signale, die γ-Sekretase Spaltung des APP-C99 oder NΔE entsprechen
Hinweis: Lesen Sie bitte den vorherigen Veröffentlichungen für detaillierte Beschreibungen der Generation von CG und NG Zellen20,21.
<ol><li>
Seed NG oder CG Zellen (20, 000 Zellen/Brunnen) auf 96-Well-Mikrotiterplatten zu einem Endvolumen von 200 μl/Well im Wachstumsmedium, der Dulbeccos geändert Eagle Medium (DMEM) zu...

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	<li>Selkoe, D. J., Hardy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+amyloid+hypothesis+of+Alzheimer's+disease+at+25+years.">The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease at 25 years.</a> EMBO Mol Med. 8 (6), 595-608 (2016).</li><li>Wolfe, M. S., Guenette, S. 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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate-targeting+gamma-secretase+modulators.">Substrate-targeting gamma-secretase modulators.</a> Nature. 453 (7197), 925-929 (2008).</li><li>Kounnas, M. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+gamma-secretase+reduces+beta-amyloid+deposition+in+a+transgenic+mouse+model+of+Alzheimer's+disease.">Modulation of gamma-secretase reduces beta-amyloid deposition in a transgenic mouse model of Alzheimer's disease.</a> Neuron. 67 (5), 769-780 (2010).</li><li>Thathiah, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+orphan+G+protein-coupled+receptor+3+modulates+amyloid-beta+peptide+generation+in+neurons.">The orphan G protein-coupled receptor 3 modulates amyloid-beta peptide generation in neurons.</a> Science. 323 (5916), 946-951 (2009).</li><li>Flajolet, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Alzheimer's+disease+amyloid-beta+formation+by+casein+kinase+I.">Regulation of Alzheimer's disease amyloid-beta formation by casein kinase I.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (10), 4159-4164 (2007).</li><li>Eisele, Y. 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A., Miele, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=gamma-Secretase+inhibitors+and+modulators.">gamma-Secretase inhibitors and modulators.</a> Biochim Biophys Acta. 1828 (12), 2898-2907 (2013).</li><li>Coric, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Prodromal+Alzheimer+Disease+With+Avagacestat:+A+Randomized+Clinical+Trial.">Targeting Prodromal Alzheimer Disease With Avagacestat: A Randomized Clinical Trial.</a> JAMA Neurol. 72 (11), 1324-1333 (2015).</li><li>Mitani, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+between+gamma-secretase+inhibitors+and+modulators+on+cognitive+function+in+amyloid+precursor+protein-transgenic+and+nontransgenic+mice.">Differential effects between gamma-secretase inhibitors and modulators on cognitive function in amyloid precursor protein-transgenic and nontransgenic mice.</a> J Neurosci. 32 (6), 2037-2050 (2012).</li><li>Penninkilampi, R., Brothers, H. M., Eslick, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+Agents+Targeting+gamma-Secretase+Increase+Risk+of+Cancer+and+Cognitive+Decline+in+Alzheimer's+Disease+Patients:+A+Systematic+Review+and+Meta-Analysis.">Pharmacological Agents Targeting gamma-Secretase Increase Risk of Cancer and Cognitive Decline in Alzheimer's Disease Patients: A Systematic Review and Meta-Analysis.</a> J Alzheimers Dis. 53 (4), 1395-1404 (2016).</li></ol>

Die vielversprechenden Ergebnisse aus Phase 1 b-Studie von Aducanumab Immuntherapie für AD haben die kritische Rolle von Aβ in der Pathogenese der AD22 fest etabliert und legen nahe, dass Anti-Aβ Ansätze noch eine tragfähige Strategie für die Entwicklung von Anti-AD Drogen sind. Hier beschreiben wir zellbasierte Assays für die Quantifizierung der γ-Sekretase-katalysierte Proteolyse von APP-C99 und NΔE mit Firefly Luciferase Reporter Systemen. APP-C99 und NΔE sind die zwei am meisten gut ...

Oligomere Formen von Amyloid-β (Aβ) sind vermutlich die Hauptursache für Neurodegeneration in den Gehirnen von Patienten mit Alzheimer-Krankheit (AD)1. Aβ-Peptide werden durch die schrittweise Spaltung des Amyloid-Precursor-Protein (APP), zuerst durch β-Sekretase und dann durch γ-Sekretase2produziert. In den letzten zehn Jahren haben therapeutische Ansätze zur Behandlung der AD zur Verhinderung der Aβ Produktion3konzentriert. Die meisten Studien konzentrierten sich auf entweder die Vermehrung der α-Sekretase Aktivität, die γ-Sekretase Spaltung des APP schließt und dadurch verringern die Produktion von Aβ oder die Hemmung der β-und/oder γ-Sekretase Aktivitäten4. Leider sind nichtselektiven Hemmung β oder γ-Secretases führt zu unvermeidbaren Nebenwirkungen, die durch Störung der Tätigkeit der anderen physiologischen Substraten von β und γ-Sekretase5,6. Neuere Studien haben im Hinblick auf γ-Sekretase-Inhibitoren die Entdeckung einer Reihe von chemischen und genetischen Modulatoren berichtet, die Aβ-Produktion beim ausüben vernachlässigbarer Auswirkungen auf die wesentlichen γ-Sekretase-vermittelten Verarbeitung von Notch7 regulieren können ,8,9,10,11,12, jedoch erfolgreiche Therapie noch nicht entwickelt worden. So sind weitere systematische Bildschirme gerechtfertigt, um neuartige chemische und genetische Modifikatoren zu entdecken, die selektiv γ-Sekretase-vermittelten APP Verarbeitung modulieren kann.
Γ-Sekretase ist bekannt, mehr als 90 verschiedene Membran verankerte Proteine zu Spalten. Unter diesen Substraten ist Kerbe, deren Tätigkeit für Zelle Schicksal Entschlossenheit und Differenzierung während der Entwicklung13entscheidend. Selektiv modulierende γ-Sekretase-katalysierte APP Verarbeitung ohne wird Kerbe zu beeinträchtigen Verarbeitung wesentlich zur Minimierung Kerbe-bezogene Nebenwirkungen von γ-Sekretase-Inhibitoren, und diese Selektivität wird angenommen, dass ein primärer Faktor ist, dass die biologische Wirksamkeit von potenziellen γ-Sekretase Modulatoren für die chronische Behandlung von AD zu diktieren. Es wurden eine Reihe von Arylsulfonamide-Derivaten, wie GSI-953 (Begacestat) und BMS-708163 (Avagacestat), die gefunden wurden, potent und selektive Hemmung der γ-Sekretase14,15auszustellen. Eine frühere Studie hat gezeigt, dass die differenzielle Hemmung der γ-Sekretase Spaltung der APP und Kerbe mit einer quantitativen ELISA-basierten Test in Kombination mit in Vivo Validierung mithilfe von Zebrafisch16beobachtet werden kann. Darüber hinaus wurden zellbasierte Assays Paradigmen eingerichtet, an die potentielle Substrat Selektivität der γ-Sekretase in Richtung APP und Kerbe17,18. Unter Verwendung von Protokollen zu den beschriebenen ähnlich hierin, wir haben vor kurzem entdeckt eine neuartige Klasse von (D)-Leucinamides, die γ-Sekretase Spaltung des APP mit Notch-schonende Selektivität19potent modulieren. Diese Sammlung von Studien bilden zusammen ein Proof-of-Concept unterstützt die Vorstellung, die die Substrat Selektivität/Verfügbarkeit der γ-Sekretase chemische Modulation und experimentelle Verifikation unterworfen werden können. Dieser Assay-Plattformen setzen jedoch häufig auf relativ niedrigen Durchsatz auslesen und arbeitsintensive Ansätze, die industriellen Standards für Drug Discovery-Programme nicht erfüllen könnte.
Wir haben vor kurzem zellbasierte Luciferase Reporter-gen Assays generiert, die quantitativ, die katalytische Aktivität der γ-Sekretase gegenüber zwei unterschiedliche Substrate, die 99-amino Acid C-terminale Fragment der APP (APP-C99) und der extrazellulären bestimmen Domain gelöscht Kerbe Peptid (NΔE). APP-C99 und NΔE haben weithin als direkte Substrate der γ-Sekretase in verschiedenen Tests eingesetzt. Homogen und konsistent Luciferase Reporter-gen Assays für die γ-Sekretase Spaltung des APP-C99 oder NΔE generieren, erzielten wir ein HEK abgeleitet stabile Zelllinie (CG), die konstitutiv eine Gal4 Projektträger-gesteuerte Firefly Luciferase Reporter (ausdrückt Gal4-Luc) und Gal4/VP16-Tags APP-C99 Schmelzverfahren Protein (C99-GV). Darüber hinaus erzielten wir ein weiteres HEK abgeleitet stabile Zelllinie (NG), die konstitutiv Gal4-Luc und Gal4/VP16-markierten NΔE (NΔE-GV) ausdrückt. Mit dieser neuartigen Substrat-spezifische γ-Sekretase-Assays, bieten wir jetzt eine Methode zu quantifizieren und die katalytische Aktivität der γ-Sekretase auf unterschiedlichen Substraten (APP-C99 in CG-Zellen) oder NΔE in NG Zellen zu unterscheiden. Darüber hinaus wurden die Substrat-spezifische γ-Sekretase-Assays entwickelt, um High-Content-Screening Plattformen förderlich sein. Diese neu erzeugten γ-Sekretase-Assays könnte den Weg für die Entdeckung des neuartigen γ-Sekretase Modulatoren ebnen, die kognitive Funktion zu verbessern könnte, durch die Unterdrückung von Aβ-Produktion ohne unerwünschte Kerbe Hemmung für die Behandlung der nächsten Generation zu entlocken der AD.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>VictorLight luminescence plate reader</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>2030-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Class II, Type 2 Biological Safety Cabinet</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1300 Series A2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CL-387,785</td>
			<td>EMD Calbiochem</td>
			<td>233100-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPT</td>
			<td>Merck</td>
			<td>565770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12100046</td>
			<td>main compnent of growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>16000044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blasticidin</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A1113903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeocin</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>R25005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygromycin B</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10687010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytomer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>BR717805 Aldrich</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well microplate</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>156545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T7660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steady-Glo luciferase assay reagent</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidified CO2 incubator</td>
			<td>Revco</td>
			<td>Ultima II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-REx293 cell line</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R71007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wallac 1420 software version 3.0</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td>instrument control software of the luminescence microplate reader</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative measurement of &#947;-secretase-mediated amyloid precursor protein and notch cleavage in cell-based luciferase reporter assay platforms

Wir haben ein paar zellbasierte Reporter-gen Assays zur Messung quantitativ γ-Sekretase Spaltung von unterschiedlichen Substraten entwickelt. Dieses Manuskript beschreibt Verfahren, die verwendet werden, um die γ-Sekretase-vermittelte Spaltung des APP-C99 oder Kerbe, mit einem Gal4 Projektträger-gesteuerte Firefly Luciferase Reporter System zu überwachen. Diese Tests wurden festgelegten stabil Co transfecting HEK293 Zellen mit Gal4-driven Luciferase Reporter-gen und entweder das Gal4/VP16-Tags C-terminale Fragment App (APP-C99; CG-Zellen), oder die Gal4/VP16-Tags Kerbe-ΔE (NΔE; NG-Zellen). Parallele Nutzung dieser Reporter-Assays, wir haben gezeigt, dass ein ErbB2-Inhibitor, CL-387.785, bevorzugt γ-Sekretase Spaltung des APP-C99 in CG Zellen, aber nicht NΔE in NG Zellen unterdrücken können. Die differenzierten Antworten, ausgestellt durch die CG und NG Zellen, wenn Sie mit CL-387.785, behandelt eine bevorzugte charakteristisch für γ-Sekretase Modulatoren, dar, die diese Antworten stehen in krassem Gegensatz zu der Pan-Hemmung der γ-Sekretase induziert durch DAPT. Unsere Studien bieten direkte Beweise dass γ-Sekretase Tätigkeiten auf verschiedenen Substraten in einem zellulären Kontext unterschieden werden können. Diese neue Assays kann daher nützliche Werkzeuge in der Drogeentdeckung für verbesserte AD-Therapien.

Hemmung der ErbB2 von CL-387.785 kann die Verarbeitung von APP-C99 von differentiell fördern Γ -Sekretase ohne Kerbe Spaltung Um eine zellbasierte Assays zu etablieren, die die proteolytische Spaltung eines bestimmten γ-Sekretase-Substrats quantitativ messen kann, erzielten wir die HEK293 abgeleitet CG-Zell-Linie durch stabile Co Transfektion von einem Tetracyclin-induzierbaren C unheilbar Gal4/VP16-Tags APP-C99 und eine Gal4 Projek...

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Measurement of ÃŽÂ³-Secretase-mediated Amyloid Precursor Protein and Notch Cleavage in Cell-based Luciferase Reporter Assay Platforms at JoVE.com

Quantitative Measurement of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â³-Secretase-mediated Amyloid Precursor Protein and Notch Cleavage in Cell-based Luciferase Reporter Assay Platforms

Quantitative Messung der γ-Sekretase-vermittelten Amyloid-Precursor-Protein und Notch Spaltung in zellbasierten Luciferase Reporter Assay Plattformen

Wir haben erfolgreich zwei Substrat-spezifische γ-Sekretase Assays generiert. Beiden zellbasierte Assays, die hier vorgestellten sollen γ-Sekretase enzymatischen Aktivitäten über den Ausgang des Firefly Luciferase Reporter zu quantifizieren.

We have developed a pair of cell-based reporter gene assays to quantitatively measure &#947;-secretase cleavage of distinct substrates. This manuscript ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Quantitative Measurement of &#947;-Secretase-mediated Amyloid Precursor Protein and Notch Cleavage in Cell-based Luciferase Reporter Assay Platforms

Selection of Aptamers for Amyloid &beta;-Protein, the Causative Agent of Alzheimer&#39;s Disease

Selection of Aptamers for Amyloid ÃƒÅ½Ã‚Â²-Protein, the Causative Agent of Alzheimer's Disease

Selektion von Aptameren für Amyloid β-Protein, dem Erreger der Alzheimer-Krankheit

Alzheimer's disease (AD) is a progressive, age-dependent, neurodegenerative disorder with an insidious course that renders its presymptomatic diagnosis ...

Forschung

Neurowissenschaften

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Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-Cell-Imaging von Sinnesorgan Vorläuferzellen im Intact Drosophila Puppen

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

A Galvanotaxis Assay for Analysis of Neural Precursor Cell Migration Kinetics in an Externally Applied Direct Current Electric Field

A Galvanotaxis Assay für die Analyse von neuralen Vorläuferzellen Cell Migration Kinetics in einem von außen angelegten Direct Current Electric Field

The discovery of neural stem and progenitor  cells (collectively termed neural precursor cells) (NPCs) in the adult  mammalian brain has led to a body of ...

High-throughput Analysis of Mammalian Olfactory Receptors: Measurement of Receptor Activation via Luciferase Activity

Hochdurchsatz-Analyse von Säugetiergeruchsrezeptoren: Die Messung der Rezeptoraktivierung über Luciferaseaktivität

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Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

Detektion<em&gt; In-situ-</em&gt; Protein-Protein-Komplexe bei der<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven Neuromuskuläre Junction Mit Proximity Ligation Assay

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Alzheimer&#8217;s disease is a neurodegenerative disease affecting the aging population. A key neuropathological feature of the disease is the ...

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Retinoic acid (RA) is an important developmental morphogen that coordinates anteroposterior and dorsoventral axis patterning, somitic differentiation, ...

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Modeling Amyloid-ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²42 Toxicity and Neurodegeneration in Adult Zebrafish Brain

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Protein synthesis is required for development and maintenance of neuronal function and is involved in adaptive changes in the nervous system. Moreover, it ...