Name: quantitative measurement of &#947;-secretase-mediated amyloid precursor protein and notch cleavage in cell-based luciferase reporter assay platforms
Uploaded: 2018-01-25T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Measurement of ÃŽÂ³-Secretase-mediated Amyloid Precursor Protein and Notch Cleavage in Cell-based Luciferase Reporter Assay Platforms at JoVE.com

המחברים מודים המתקן הליבה של המכון של הסלולר, ביולוגיה אורגניזם, אקדמיה Sinica, על תמיכה טכנית. מחקר זה נתמך על ידי משרד המדע, הטכנולוגיה, טייוואן (ביותר 103-2320-B-001-016-MY3 עד י'-F. ל'), התוכנית לחדשנות Translational ההתפתחות ביולוגיות – טכנולוגיית התומכת פלטפורמה ציר ערכת (NP7 ל י'-F.L.), ו Sinica אקדמיה (לי'-F.L.).

1. מדידה של אותות כתב לוציפראז, אשר תואמות את המחשוף γ-Secretase של APP-C99 או NΔE
הערה: נא עיין על פרסומים קודמים על תיאורים מפורטים של הדור של CG ו NG תאים20,21.
<ol><li>
זרע תאים NG או CG (20, 000 תאים/טוב) על גבי microplates 96-ובכן-נפח סופי של 200 μL היטב במדיום הגידול ה?...

<ol>
	<li>Selkoe, D. J., Hardy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+amyloid+hypothesis+of+Alzheimer's+disease+at+25+years.">The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease at 25 years.</a> EMBO Mol Med. 8 (6), 595-608 (2016).</li><li>Wolfe, M. S., Guenette, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=APP+at+a+glance.">APP at a glance.</a> J Cell Sci. 120 (Pt 18), 3157-3161 (2007).</li><li>Karran, E., Mercken, M., De Strooper, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+amyloid+cascade+hypothesis+for+Alzheimer's+disease:+an+appraisal+for+the+development+of+therapeutics.">The amyloid cascade hypothesis for Alzheimer's disease: an appraisal for the development of therapeutics.</a> Nat Rev Drug Discov. 10 (9), 698-712 (2011).</li><li>Citron, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alzheimer's+disease:+strategies+for+disease+modification.">Alzheimer's disease: strategies for disease modification.</a> Nat Rev Drug Discov. 9 (5), 387-398 (2010).</li><li>Vassar, R., Kovacs, D. M., Yan, R., Wong, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+beta-secretase+enzyme+BACE+in+health+and+Alzheimer's+disease:+regulation,+cell+biology,+function,+and+therapeutic+potential.">The beta-secretase enzyme BACE in health and Alzheimer's disease: regulation, cell biology, function, and therapeutic potential.</a> J Neurosci. 29 (41), 12787-12794 (2009).</li><li>Parks, A. L., Curtis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presenilin+diversifies+its+portfolio.">Presenilin diversifies its portfolio.</a> Trends Genet. 23 (3), 140-150 (2007).</li><li>Kukar, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate-targeting+gamma-secretase+modulators.">Substrate-targeting gamma-secretase modulators.</a> Nature. 453 (7197), 925-929 (2008).</li><li>Kounnas, M. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+gamma-secretase+reduces+beta-amyloid+deposition+in+a+transgenic+mouse+model+of+Alzheimer's+disease.">Modulation of gamma-secretase reduces beta-amyloid deposition in a transgenic mouse model of Alzheimer's disease.</a> Neuron. 67 (5), 769-780 (2010).</li><li>Thathiah, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+orphan+G+protein-coupled+receptor+3+modulates+amyloid-beta+peptide+generation+in+neurons.">The orphan G protein-coupled receptor 3 modulates amyloid-beta peptide generation in neurons.</a> Science. 323 (5916), 946-951 (2009).</li><li>Flajolet, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Alzheimer's+disease+amyloid-beta+formation+by+casein+kinase+I.">Regulation of Alzheimer's disease amyloid-beta formation by casein kinase I.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (10), 4159-4164 (2007).</li><li>Eisele, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gleevec+increases+levels+of+the+amyloid+precursor+protein+intracellular+domain+and+of+the+amyloid-beta+degrading+enzyme+neprilysin.">Gleevec increases levels of the amyloid precursor protein intracellular domain and of the amyloid-beta degrading enzyme neprilysin.</a> Mol Biol Cell. 18 (9), 3591-3600 (2007).</li><li>He, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gamma-secretase+activating+protein+is+a+therapeutic+target+for+Alzheimer's+disease.">Gamma-secretase activating protein is a therapeutic target for Alzheimer's disease.</a> Nature. 467 (7311), 95-98 (2010).</li><li>Haapasalo, A., Kovacs, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+many+substrates+of+presenilin/gamma-secretase.">The many substrates of presenilin/gamma-secretase.</a> J Alzheimers Dis. 25 (1), 3-28 (2011).</li><li>Gillman, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+and+Evaluation+of+BMS-708163,+a+Potent,+Selective+and+Orally+Bioavailable+gamma-Secretase+Inhibitor.">Discovery and Evaluation of BMS-708163, a Potent, Selective and Orally Bioavailable gamma-Secretase Inhibitor.</a> ACS Med Chem Lett. 1 (3), 120-124 (2010).</li><li>Hopkins, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ACS+chemical+neuroscience+molecule+spotlight+on+Begacestat+(GSI-953).">ACS chemical neuroscience molecule spotlight on Begacestat (GSI-953).</a> ACS Chem Neurosci. 3 (1), 3-4 (2012).</li><li>Yang, T., Arslanova, D., Gu, Y., Augelli-Szafran, C., Xia, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+gamma-secretase+modulation+differentiates+inhibitor+compound+selectivity+between+two+substrates+Notch+and+amyloid+precursor+protein.">Quantification of gamma-secretase modulation differentiates inhibitor compound selectivity between two substrates Notch and amyloid precursor protein.</a> Mol Brain. 1, 15 (2008).</li><li>McKee, T. D., Loureiro, R. M., Dumin, J. A., Zarayskiy, V., Tate, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+cell-based+method+for+determining+the+gamma-secretase+enzyme+activity+against+both+Notch+and+APP+substrates.">An improved cell-based method for determining the gamma-secretase enzyme activity against both Notch and APP substrates.</a> J Neurosci Methods. 213 (1), 14-21 (2013).</li><li>Basi, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+precursor+protein+selective+gamma-secretase+inhibitors+for+treatment+of+Alzheimer's+disease.">Amyloid precursor protein selective gamma-secretase inhibitors for treatment of Alzheimer's disease.</a> Alzheimers Res Ther. 2 (6), 36 (2010).</li><li>Liao, Y. F., Tang, Y. C., Chang, M. Y., Wang, B. J., Hu, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+small+molecular+(D)-leucinamides+as+potent,+Notch-sparing+gamma-secretase+modulators.">Discovery of small molecular (D)-leucinamides as potent, Notch-sparing gamma-secretase modulators.</a> Eur J Med Chem. 79, 143-151 (2014).</li><li>Liao, Y. F., Wang, B. J., Cheng, H. T., Kuo, L. H., Wolfe, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+necrosis+factor-alpha,+interleukin-1beta,+and+interferon-gamma+stimulate+gamma-secretase-mediated+cleavage+of+amyloid+precursor+protein+through+a+JNK-dependent+MAPK+pathway.">Tumor necrosis factor-alpha, interleukin-1beta, and interferon-gamma stimulate gamma-secretase-mediated cleavage of amyloid precursor protein through a JNK-dependent MAPK pathway.</a> J Biol Chem. 279 (47), 49523-49532 (2004).</li><li>Wang, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ErbB2+regulates+autophagic+flux+to+modulate+the+proteostasis+of+APP-CTFs+in+Alzheimer's+disease.">ErbB2 regulates autophagic flux to modulate the proteostasis of APP-CTFs in Alzheimer's disease.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (15), E3129-E3138 (2017).</li><li>Sevigny, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+antibody+aducanumab+reduces+Abeta+plaques+in+Alzheimer's+disease.">The antibody aducanumab reduces Abeta plaques in Alzheimer's disease.</a> Nature. 537 (7618), 50-56 (2016).</li><li>Golde, T. E., Koo, E. H., Felsenstein, K. M., Osborne, B. A., Miele, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=gamma-Secretase+inhibitors+and+modulators.">gamma-Secretase inhibitors and modulators.</a> Biochim Biophys Acta. 1828 (12), 2898-2907 (2013).</li><li>Coric, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Prodromal+Alzheimer+Disease+With+Avagacestat:+A+Randomized+Clinical+Trial.">Targeting Prodromal Alzheimer Disease With Avagacestat: A Randomized Clinical Trial.</a> JAMA Neurol. 72 (11), 1324-1333 (2015).</li><li>Mitani, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+between+gamma-secretase+inhibitors+and+modulators+on+cognitive+function+in+amyloid+precursor+protein-transgenic+and+nontransgenic+mice.">Differential effects between gamma-secretase inhibitors and modulators on cognitive function in amyloid precursor protein-transgenic and nontransgenic mice.</a> J Neurosci. 32 (6), 2037-2050 (2012).</li><li>Penninkilampi, R., Brothers, H. M., Eslick, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+Agents+Targeting+gamma-Secretase+Increase+Risk+of+Cancer+and+Cognitive+Decline+in+Alzheimer's+Disease+Patients:+A+Systematic+Review+and+Meta-Analysis.">Pharmacological Agents Targeting gamma-Secretase Increase Risk of Cancer and Cognitive Decline in Alzheimer's Disease Patients: A Systematic Review and Meta-Analysis.</a> J Alzheimers Dis. 53 (4), 1395-1404 (2016).</li></ol>

מבטיח תוצאות ממשפט בשלב 1b של חיסוני aducanumab עבור לספירה הקימו בחוזקה את תפקיד קריטי Aβ בפתוגנזה של המודעה22 ולהציע כי גישות אנטי-Aβ הם עדיין אסטרטגיה קיימא עבור הפיתוח של תרופות אנטי-לספירה. כאן, אנו מתארים מבוססת תא מבחני לכימות תנועת proteolysis γ-secretase-מזורז של APP-C99 ו- NΔE שימוש גחלילי?...

צורות oligomeric של עמילואיד-β (Aβ) מאמינים כי הגורם העיקרי הקשורים ניוון מוחיים במוחם של חולים הסובלים מחלת אלצהיימר (AD)1. Aβ פפטידים מופקים על ידי המחשוף stepwise של חלבון עמילואיד קודמן (APP), תחילה לפי β-secretase ולאחר מכן ב- γ-secretase2. בעשור האחרון, גישות טיפוליות כלפי הטיפול של המודעה התמקדו למניעת ייצור Aβ3. הרוב המכריע של המחקרים התמקדו גם הגדלת הפעילות α-secretase, אשר ניתן למנוע γ-secretase המחשוף של APP, ובכך להקטין את הייצור של Aβ, או עיכוב של פעילויות β-ו/או γ-secretase4. למרבה הצער, לא בררניים עיכוב של β - או γ-secretases תוצאות תופעות לוואי בלתי נמנע כי הם עקב הפרעה תפקוד אחרים סובסטרטים פיזיולוגיים של β - ו γ-secretase5,6. לגבי מעכבי γ-secretase, מחקרים שנעשו לאחרונה דיווחו על הגילוי של מספר מאפננים כימי, גנטיים המווסתים Aβ הייצור תוך הפעלת אפקטים זניח על עיבוד וγ secretase-בתיווך חיוני חריץ7 ,8,9,10,11,12, עם זאת, הרפוי מוצלחת עדיין לא פותחו. לפיכך, בהמשך מסכי שיטתית הן מוצדקת לגלות מכפילי גנטי וכימיים הרומן זה באופן סלקטיבי יכול לווסת את עיבוד APP וγ secretase-בתיווך.
Γ-Secretase ידוע קליב יותר מ-90 חלבונים שונים המעוגנת ממברנה. בין אלה סובסטרטים הוא חריץ, שפעילותם היא קריטית עבור תא בנחישות גורל ובידול במהלך פיתוח13. באופן סלקטיבי להתכוונן APP וγ-secretase-מזורז עיבוד בהיעדרו של להשפיע על הרמה עיבוד יהיה חיוני ומזעור הקשורות חריץ תופעות לוואי של מעכבי γ-secretase, סלקטיביות זו נחשבת גורם העיקרי יהיה להכתיב את היעילות הביולוגי של פוטנציאל מאפננים γ-secretase לטיפול כרוני של המודעה. היו מספר נגזרות arylsulfonamide, כגון GSI-953 (begacestat) ועב מ- 708163 (avagacestat), נמצאו שהפגינו עיכוב חזק, סלקטיבי של γ-secretase14,15. מחקר קודם הראה כי עיכוב דיפרנציאלית של פצילות γ-secretase של האפליקציה, חריץ יכול להיות שנצפו שימוש assay מבוסס-אליסה כמותית בשילוב עם ויוו אימות באמצעות דג זברה16. יתר על כן, פרדיגמות assay מבוססת תא הוקמו לפנות את מידת הבררנות המצע פוטנציאלי של γ-secretase לכיוון APP ודרגה17,18. באמצעות פרוטוקולים דומה מהמתואר בזאת, לאחרונה גילינו מחלקה הרומן של (D)-leucinamides זה מנע בעוצמה לווסת את המחשוף γ-secretase של האפליקציה עם סלקטיביות ממעט דרגה19. יחד, זה אוסף של מחקרים מספק הוכחה-של-קונספט תומך התפישה. המצע סלקטיביות/הזמינות של γ-secretase יכול להיות כפופים אפנון כימי ואימות ניסיוני. עם זאת, פלטפורמות assay אלה מסתמכים בדרך כלל על המפרט תפוקה נמוכה יחסית וגישות מהגידולים שלא יכול לעמוד תקני התעשייה לתוכניות גילוי סמים.
יש לנו לאחרונה שנוצר לוציפראז מבוססת תא כתב ג'ין מבחני שיכול לקבוע באופן כמותי את פעילות קטליטית γ-secretase כלפי שני מצעים שונים, הרסיס C-מסוף חומצה אמינו 99 של האפליקציה (APP-C99) חוץ-תאית תחום שנמחקו חריץ פפטיד (NΔE). APP-C99 וגם NΔE היה בשימוש נרחב בשם דיאלקטריים ישירה של γ-secretase במבחני שונות. כדי ליצור הומוגניות ועקבית לוציפראז כתב ג'ין מבחני למחשוף γ-secretase של APP-C99 או NΔE, יצרנו נגזר HEK תא יציב שורה אחת (CG) המבטאת צורונים (כתב Gal4 לוציפראז מונחה יזם גחלילית Gal4-Luc), חלבון כימרי Gal4/VP16-מתויג APP-C99 (C99-GV). בנוסף, יצרנו עוד קו נגזר HEK תא יציב (NG) המבטאת צורונים Gal4-לוק ו מתויג-Gal4/VP16 NΔE (NΔE-GV). אנחנו עכשיו באמצעות מבחני הרומן המצע ספציפיים γ-secretase אלה, מספקות שיטה לכמת, להבחין בין פעילות קטליטית γ-secretase לכיוון סובסטרטים שונים (APP-C99 בתאים CG), או NΔE בתאים NG. יתר על כן, מבחני המצע ספציפיים γ-secretase נועדו תוליחתמ פלטפורמות הקרנה גבוהה-תוכן. מבחני החדש שנוצר γ-secretase אלה יכול לסלול את הדרך עבור גילוי מאפננים γ הרומן-secretase יכול לשפר את התפקוד הקוגניטיבי על-ידי דיכוי ייצור Aβ ללא העלאת עיכוב דרגה בלתי רצויים לטיפול הדור הבא של AD.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>VictorLight luminescence plate reader</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>2030-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Class II, Type 2 Biological Safety Cabinet</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1300 Series A2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CL-387,785</td>
			<td>EMD Calbiochem</td>
			<td>233100-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPT</td>
			<td>Merck</td>
			<td>565770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12100046</td>
			<td>main compnent of growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>16000044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blasticidin</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A1113903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeocin</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>R25005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygromycin B</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10687010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytomer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>BR717805 Aldrich</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well microplate</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>156545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T7660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steady-Glo luciferase assay reagent</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidified CO2 incubator</td>
			<td>Revco</td>
			<td>Ultima II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-REx293 cell line</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R71007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wallac 1420 software version 3.0</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td>instrument control software of the luminescence microplate reader</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative measurement of &#947;-secretase-mediated amyloid precursor protein and notch cleavage in cell-based luciferase reporter assay platforms

פיתחנו זוג כתב מבוססת תא מבחני ג'ין למדוד באופן כמותי את המחשוף γ-secretase של סובסטרטים ברורים. כתב יד זה מתאר הליכים בהם ניתן לעקוב אחר γ secretase-בתיווך המחשוף של APP-C99 או חריץ, באמצעות Gal4 מונחה יזם גחלילית לוציפראז כתב מערכת. מבחני אלה הוקמו על ידי stably משותפת transfecting תאים HEK293 עם הגן כתב לוציפראז מונחה-Gal4, או הרסיס Gal4/VP16-מתויגים ' C-מסוף של האפליקציה (APP-C99; תאים CG), או את Gal4/VP16-מתויגים ' החריץ-ΔE (NΔE; NG תאים). באמצעות אלה מבחני כתב במקביל, הראו כי מעכב ErbB2, CL-387,785, מעדיפים יכול לדכא γ-secretase המחשוף של APP-C99 בתאים CG, אבל לא NΔE בתאים NG. התגובות דיפרנציאלית הוצגו על ידי התאים CG ו- NG, כאשר מטופלים עם CL-387,785, מייצגים מאפיין המועדפת עבור γ-secretase מאפננים, תגובות אלה הן בניגוד הפאן-עיכוב של γ-secretase המושרה על ידי DAPT. המחקרים שלנו מספקים עדות ישירה כי ניתן להבחין γ-secretase פעילויות לקראת סובסטרטים בהקשר הסלולר. מבחני חדשים אלה ולכן ייתכן כלים שימושיים, גילוי תרופות טיפולים לספירה משופרת.

עיכוב של ErbB2 מאת CL-387,785 באופן שונה יכול לקדם את העיבוד של APP-C99 על ידי Γ -secretase מבלי להשפיע על הרמה המחשוף להקים assay מבוססת תא שיכול למדוד באופן כמותי את המחשוף הפרוטאוליטי של מצע מסוים γ-secretase, יצרנו את שורת התאים CG נגזר HEK293 על ידי תרביות תאים שותף ...

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Measurement of ÃŽÂ³-Secretase-mediated Amyloid Precursor Protein and Notch Cleavage in Cell-based Luciferase Reporter Assay Platforms at JoVE.com

Quantitative Measurement of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â³-Secretase-mediated Amyloid Precursor Protein and Notch Cleavage in Cell-based Luciferase Reporter Assay Platforms

מדידה כמותית של חלבונים וγ Secretase-בתיווך קודמן עמילואיד, המחשוף דרגה ב מבוססת תא לוציפראז כתב Assay פלטפורמות

יש לנו בהצלחה שנוצר שני מבחני המצע ספציפיים γ-secretase. שני מבחני מבוססת תא המובאת כאן נועדו לכמת פעילויות אנזימטיות γ-secretase דרך הפלט של גחלילית לוציפראז כתבים.

We have developed a pair of cell-based reporter gene assays to quantitatively measure &#947;-secretase cleavage of distinct substrates. This manuscript ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Quantitative Measurement of &#947;-Secretase-mediated Amyloid Precursor Protein and Notch Cleavage in Cell-based Luciferase Reporter Assay Platforms

Selection of Aptamers for Amyloid &beta;-Protein, the Causative Agent of Alzheimer&#39;s Disease

Selection of Aptamers for Amyloid ÃƒÅ½Ã‚Â²-Protein, the Causative Agent of Alzheimer's Disease

מבחר Aptamers עבור חלבון β עמילואיד, הסוכן סיבתי של מחלת אלצהיימר

Alzheimer's disease (AD) is a progressive, age-dependent, neurodegenerative disorder with an insidious course that renders its presymptomatic diagnosis ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-תא הדמיה של תאים מבשר חושי האיברים אינטקט תסיסנית גלמים

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

A Galvanotaxis Assay for Analysis of Neural Precursor Cell Migration Kinetics in an Externally Applied Direct Current Electric Field

Assay Galvanotaxis לניתוח של קינטיקס נדידת תאים העצביים המבשר בשדה חשמלי נוכחי לשימוש חיצוני ישיר

The discovery of neural stem and progenitor  cells (collectively termed neural precursor cells) (NPCs) in the adult  mammalian brain has led to a body of ...

High-throughput Analysis of Mammalian Olfactory Receptors: Measurement of Receptor Activation via Luciferase Activity

ניתוח תפוקה גבוהה של קולטני ריח יונקים: מדידה של קולטן הפעלה באמצעות בלוציפראז פעילות

Odorants create unique and overlapping patterns of olfactory receptor activation, allowing a family of approximately 1,000 murine and 400 human receptors ...

Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

זיהוי של<em&gt; באתר</em&gt; מכלולי חלבון-חלבון ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; הזחל Neuromuscular צומת שימוש סמיכות קשירת Assay

Discs large (Dlg) is a conserved member of the membrane-associated guanylate kinase family, and serves as a major scaffolding protein at the larval ...

Stereotaxic Infusion of Oligomeric Amyloid-beta into the Mouse Hippocampus

עירוי stereotaxic של Oligomeric עמילואיד-ביתא להיפוקמפוס העכבר

Alzheimer&#8217;s disease is a neurodegenerative disease affecting the aging population. A key neuropathological feature of the disease is the ...

Quantitative Measurement of Relative Retinoic Acid Levels in E8.5 Embryos and Neurosphere Cultures Using the F9 RARE-Lacz Cell-based Reporter Assay

מדידה כמותית של רמות חומצה רטינואית יחסית ב E8.5 עוברים neurosphere תרבויות באמצעות assay Reporter F9 נדיר- lacZ מבוססי תאים

Retinoic acid (RA) is an important developmental morphogen that coordinates anteroposterior and dorsoventral axis patterning, somitic differentiation, ...

Modeling Amyloid-&#946;42 Toxicity and Neurodegeneration in Adult Zebrafish Brain

Modeling Amyloid-ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²42 Toxicity and Neurodegeneration in Adult Zebrafish Brain

מידול עמילואיד-β42 רעילות, הקשורים ניוון מוחיים במוח דג זברה למבוגרים

Alzheimer's disease (AD) is a debilitating neurodegenerative disease in which accumulation of toxic amyloid-&#946;42 (A&#946;42) peptides leads to ...

Assay Development for High Content Quantification of Sod1 Mutant Protein Aggregate Formation in Living Cells

פיתוח assay על כימות תוכן גבוהה של היווצרות צבירה של מוטציה בחלבון Sod1 בתאים חיים

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disease that can be caused by inherited mutations in the gene encoding copper-zinc ...

Quantitative Autoradiographic Method for Determination of Regional Rates of Cerebral Protein Synthesis In Vivo

השיטה הכמותית האוטומטית לקביעת שיעורי הסינתזה של חלבון מוחי בVivo

Protein synthesis is required for development and maintenance of neuronal function and is involved in adaptive changes in the nervous system. Moreover, it ...