Name: quantitative measurement of &#947;-secretase-mediated amyloid precursor protein and notch cleavage in cell-based luciferase reporter assay platforms
Uploaded: 2018-01-25T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Measurement of ÃŽÂ³-Secretase-mediated Amyloid Precursor Protein and Notch Cleavage in Cell-based Luciferase Reporter Assay Platforms at JoVE.com

लेखकों ने तकनीकी सहायता के लिए सेलुलर और जीव जीव विज्ञान, जगत् Sinica संस्थान की कोर सुविधा का शुक्रिया अदा किया । इस अध्ययन को विज्ञान और प्रौद्योगिकी मंत्रालय, ताइवान (सबसे 103-2320-B-001-016-MY3 को वाइ.-एफ. के द्वारा समर्थित किया गया था. एल), के लिए कार्यक्रम के अनुवाद नवाचार के लिए--प्रौद्योगिकी समर्थन मंच धुरी योजना (NP7 to y.-F.L.), और शिक्षा Sinica (को y.-F.L.) ।

1. Luciferase रिपोर्टर संकेतों की माप, जो γ के अनुरूप-Secretase क्लीवेज of APP-C99 or NΔE
नोट: कृपया तटरक्षक और एनजी कोशिकाओं20,21की पीढ़ी के विस्तृत विवरण के लिए पिछले प्रकाशनों को देखें ।
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...

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	<li>Selkoe, D. J., Hardy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+amyloid+hypothesis+of+Alzheimer's+disease+at+25+years.">The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease at 25 years.</a> EMBO Mol Med. 8 (6), 595-608 (2016).</li><li>Wolfe, M. S., Guenette, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=APP+at+a+glance.">APP at a glance.</a> J Cell Sci. 120 (Pt 18), 3157-3161 (2007).</li><li>Karran, E., Mercken, M., De Strooper, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+amyloid+cascade+hypothesis+for+Alzheimer's+disease:+an+appraisal+for+the+development+of+therapeutics.">The amyloid cascade hypothesis for Alzheimer's disease: an appraisal for the development of therapeutics.</a> Nat Rev Drug Discov. 10 (9), 698-712 (2011).</li><li>Citron, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alzheimer's+disease:+strategies+for+disease+modification.">Alzheimer's disease: strategies for disease modification.</a> Nat Rev Drug Discov. 9 (5), 387-398 (2010).</li><li>Vassar, R., Kovacs, D. 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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate-targeting+gamma-secretase+modulators.">Substrate-targeting gamma-secretase modulators.</a> Nature. 453 (7197), 925-929 (2008).</li><li>Kounnas, M. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+gamma-secretase+reduces+beta-amyloid+deposition+in+a+transgenic+mouse+model+of+Alzheimer's+disease.">Modulation of gamma-secretase reduces beta-amyloid deposition in a transgenic mouse model of Alzheimer's disease.</a> Neuron. 67 (5), 769-780 (2010).</li><li>Thathiah, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+orphan+G+protein-coupled+receptor+3+modulates+amyloid-beta+peptide+generation+in+neurons.">The orphan G protein-coupled receptor 3 modulates amyloid-beta peptide generation in neurons.</a> Science. 323 (5916), 946-951 (2009).</li><li>Flajolet, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Alzheimer's+disease+amyloid-beta+formation+by+casein+kinase+I.">Regulation of Alzheimer's disease amyloid-beta formation by casein kinase I.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (10), 4159-4164 (2007).</li><li>Eisele, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gleevec+increases+levels+of+the+amyloid+precursor+protein+intracellular+domain+and+of+the+amyloid-beta+degrading+enzyme+neprilysin.">Gleevec increases levels of the amyloid precursor protein intracellular domain and of the amyloid-beta degrading enzyme neprilysin.</a> Mol Biol Cell. 18 (9), 3591-3600 (2007).</li><li>He, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gamma-secretase+activating+protein+is+a+therapeutic+target+for+Alzheimer's+disease.">Gamma-secretase activating protein is a therapeutic target for Alzheimer's disease.</a> Nature. 467 (7311), 95-98 (2010).</li><li>Haapasalo, A., Kovacs, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+many+substrates+of+presenilin/gamma-secretase.">The many substrates of presenilin/gamma-secretase.</a> J Alzheimers Dis. 25 (1), 3-28 (2011).</li><li>Gillman, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+and+Evaluation+of+BMS-708163,+a+Potent,+Selective+and+Orally+Bioavailable+gamma-Secretase+Inhibitor.">Discovery and Evaluation of BMS-708163, a Potent, Selective and Orally Bioavailable gamma-Secretase Inhibitor.</a> ACS Med Chem Lett. 1 (3), 120-124 (2010).</li><li>Hopkins, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ACS+chemical+neuroscience+molecule+spotlight+on+Begacestat+(GSI-953).">ACS chemical neuroscience molecule spotlight on Begacestat (GSI-953).</a> ACS Chem Neurosci. 3 (1), 3-4 (2012).</li><li>Yang, T., Arslanova, D., Gu, Y., Augelli-Szafran, C., Xia, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+gamma-secretase+modulation+differentiates+inhibitor+compound+selectivity+between+two+substrates+Notch+and+amyloid+precursor+protein.">Quantification of gamma-secretase modulation differentiates inhibitor compound selectivity between two substrates Notch and amyloid precursor protein.</a> Mol Brain. 1, 15 (2008).</li><li>McKee, T. D., Loureiro, R. M., Dumin, J. A., Zarayskiy, V., Tate, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+cell-based+method+for+determining+the+gamma-secretase+enzyme+activity+against+both+Notch+and+APP+substrates.">An improved cell-based method for determining the gamma-secretase enzyme activity against both Notch and APP substrates.</a> J Neurosci Methods. 213 (1), 14-21 (2013).</li><li>Basi, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+precursor+protein+selective+gamma-secretase+inhibitors+for+treatment+of+Alzheimer's+disease.">Amyloid precursor protein selective gamma-secretase inhibitors for treatment of Alzheimer's disease.</a> Alzheimers Res Ther. 2 (6), 36 (2010).</li><li>Liao, Y. F., Tang, Y. C., Chang, M. Y., Wang, B. J., Hu, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+small+molecular+(D)-leucinamides+as+potent,+Notch-sparing+gamma-secretase+modulators.">Discovery of small molecular (D)-leucinamides as potent, Notch-sparing gamma-secretase modulators.</a> Eur J Med Chem. 79, 143-151 (2014).</li><li>Liao, Y. F., Wang, B. J., Cheng, H. T., Kuo, L. H., Wolfe, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+necrosis+factor-alpha,+interleukin-1beta,+and+interferon-gamma+stimulate+gamma-secretase-mediated+cleavage+of+amyloid+precursor+protein+through+a+JNK-dependent+MAPK+pathway.">Tumor necrosis factor-alpha, interleukin-1beta, and interferon-gamma stimulate gamma-secretase-mediated cleavage of amyloid precursor protein through a JNK-dependent MAPK pathway.</a> J Biol Chem. 279 (47), 49523-49532 (2004).</li><li>Wang, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ErbB2+regulates+autophagic+flux+to+modulate+the+proteostasis+of+APP-CTFs+in+Alzheimer's+disease.">ErbB2 regulates autophagic flux to modulate the proteostasis of APP-CTFs in Alzheimer's disease.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (15), E3129-E3138 (2017).</li><li>Sevigny, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+antibody+aducanumab+reduces+Abeta+plaques+in+Alzheimer's+disease.">The antibody aducanumab reduces Abeta plaques in Alzheimer's disease.</a> Nature. 537 (7618), 50-56 (2016).</li><li>Golde, T. E., Koo, E. H., Felsenstein, K. M., Osborne, B. A., Miele, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=gamma-Secretase+inhibitors+and+modulators.">gamma-Secretase inhibitors and modulators.</a> Biochim Biophys Acta. 1828 (12), 2898-2907 (2013).</li><li>Coric, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Prodromal+Alzheimer+Disease+With+Avagacestat:+A+Randomized+Clinical+Trial.">Targeting Prodromal Alzheimer Disease With Avagacestat: A Randomized Clinical Trial.</a> JAMA Neurol. 72 (11), 1324-1333 (2015).</li><li>Mitani, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+between+gamma-secretase+inhibitors+and+modulators+on+cognitive+function+in+amyloid+precursor+protein-transgenic+and+nontransgenic+mice.">Differential effects between gamma-secretase inhibitors and modulators on cognitive function in amyloid precursor protein-transgenic and nontransgenic mice.</a> J Neurosci. 32 (6), 2037-2050 (2012).</li><li>Penninkilampi, R., Brothers, H. M., Eslick, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+Agents+Targeting+gamma-Secretase+Increase+Risk+of+Cancer+and+Cognitive+Decline+in+Alzheimer's+Disease+Patients:+A+Systematic+Review+and+Meta-Analysis.">Pharmacological Agents Targeting gamma-Secretase Increase Risk of Cancer and Cognitive Decline in Alzheimer's Disease Patients: A Systematic Review and Meta-Analysis.</a> J Alzheimers Dis. 53 (4), 1395-1404 (2016).</li></ol>

विज्ञापन के लिए aducanumab immunotherapy के एक चरण 1b परीक्षण से होनहार परिणामों को मजबूती से विज्ञापन की रोगजनन में Aβ की महत्वपूर्ण भूमिका की स्थापना की है22 और सुझाव है कि विरोधी Aβ दृष्टिकोण अभी भी विरोधी के व?...

amyloid-β (Aβ) के Oligomeric रूपों अल्जाइमर रोग (AD)1से पीड़ित रोगियों के दिमाग में neurodegeneration का प्राथमिक कारण माना जाता है । Aβ पेप्टाइड्स amyloid के प्रणेता प्रोटीन (एपीपी) के stepwise दरार द्वारा उत्पादित कर रहे हैं, पहले β-secretase द्वारा और फिर γ-secretase2। पिछले दशक में, विज्ञापन के उपचार की ओर चिकित्सीय दृष्टिकोण Aβ उत्पादन की रोकथाम पर ध्यान केंद्रित किया है3. अध्ययन के बहुमत या तो α-secretase गतिविधि है, जो अनुप्रयोग के γ-secretase क्लीवेज बाधा कर सकते हैं की वृद्धि पर ध्यान केंद्रित किया है और इस तरह Aβ के उत्पादन में कमी, या β के निषेध-और/या γ-secretase क्रियाएं4। दुर्भाग्य से, β-या γ-secretase के अन्य शारीरिक सब्सट्रेट के कामकाज के साथ हस्तक्षेप की वजह से कर रहे हैं कि अपरिहार्य दुष्प्रभावों में γ-secretases परिणाम के गैर-चयनात्मक निषेध--और,6. γ-secretase अवरोधकों के संबंध में, हाल के अध्ययनों से रासायनिक और आनुवंशिक मॉडुलन की एक संख्या है कि Aβ उत्पादन को विनियमित जबकि आवश्यक γ-secretase-7 पायदान के मध्यस्थता प्रसंस्करण पर नगण्य प्रभाव डालती कर सकते हैं की खोज की सूचना दी है ,8,9,10,11,12, तथापि, सफल चिकित्सकीय अभी तक विकसित नहीं किया गया है । इस प्रकार, आगे व्यवस्थित स्क्रीन γ-secretase मध्यस्थता एप्लिकेशन प्रसंस्करण चुन सकते हैं कि उपन्यास आनुवंशिक और रासायनिक संशोधक की खोज करने के लिए वारंट कर रहे हैं.
γ-Secretase से अधिक ९० अलग झिल्ली लंगर प्रोटीन से सट जाना जाता है । इन सब्सट्रेट के बीच पायदान है, जिनकी गतिविधि सेल भाग्य दृढ़ संकल्प और विकास के दौरान भेदभाव के लिए महत्वपूर्ण है13. चुनिंदा मॉडुलन γ-secretase-catalyzed APP प्रसंस्करण पायदान प्रसंस्करण को प्रभावित करने के अभाव में γ-secretase अवरोधकों के पायदान से संबंधित दुष्प्रभावों को कम करने के लिए आवश्यक हो जाएगा, और इस selectivity एक प्राथमिक कारक है कि होगा सोचा है विज्ञापन के जीर्ण उपचार के लिए संभावित γ-secretase संग्राहक की जैविक प्रभावकारिता का हुक्म । ऐसे जीएसआई के रूप में arylsulfonamide डेरिवेटिव, की एक संख्या रहे हैं-९५३ (begacestat) और बीएमएस-७०८१६३ (avagacestat), कि γ के शक्तिशाली और चयनात्मक निषेध प्रदर्शन पाया गया है-secretase14,15। एक पिछले अध्ययन का प्रदर्शन किया है कि γ की विभेदक निषेध-APP और पायदान के secretase दरार एक मात्रात्मक एलिसा का उपयोग कर देखा जा सकता है-के साथ संयोजन में परख आधारित vivo में मांयता zebrafish16का उपयोग कर । इसके अलावा, सेल-परख मानदंड आधारित स्थापित किया गया है संभावित सब्सट्रेट selectivity का पता करने के लिए γ-secretase ओर APP और पायदान17,18. प्रोटोकॉल का उपयोग यहां वर्णित उन लोगों के समान है, हम हाल ही में (डी) के एक उपंयास वर्ग की खोज की है-leucinamides है कि शक्तिशाली γ-secretase दरार APP की पायदान के साथ selectivity19बख्शना । एक साथ, अध्ययन के इस संग्रह धारणा है कि सब्सट्रेट selectivity/γ-secretase की उपलब्धता रासायनिक मॉडुलन और प्रयोगात्मक सत्यापन के अधीन किया जा सकता है का समर्थन अवधारणा एक सबूत प्रदान करता है । हालांकि, इन परख प्लेटफार्मों अक्सर अपेक्षाकृत कम प्रवाह readouts और श्रम गहन दृष्टिकोण है कि दवा खोज कार्यक्रमों के लिए औद्योगिक मानकों को पूरा नहीं हो सकता है पर भरोसा करते हैं ।
हम हाल ही में उत्पंन सेल आधारित luciferase रिपोर्टर जीन परख है कि मात्रात्मक दो अलग सब्सट्रेटों की ओर γ-secretase की उत्प्रेरक गतिविधि निर्धारित कर सकते हैं, ९९-एमिनो एसिड सी-app के टर्मिनल टुकड़ा (app-C99) और extracellular डोमेन-हटाए गए पायदान पेप्टाइड (NΔE) । दोनों अनुप्रयोग-C99 और NΔE व्यापक रूप से विभिंन परख में γ-secretase के प्रत्यक्ष सब्सट्रेट के रूप में इस्तेमाल किया गया है । γ के लिए सजातीय और लगातार luciferase रिपोर्टर जीन परख उत्पंन करने के लिए या तो अनुप्रयोग के secretase दरार-C99 या NΔE, हम एक HEK उत्पंन स्थिर सेल लाइन (तटरक्षक) है कि constitutively एक Gal4 प्रमोटर-चालित जुगनू luciferase रिपोर्टर व्यक्त ( Gal4-ल्यूक) and Gal4/VP16-tagged APP-C99 फ्यूजन प्रोटीन (C99-जीवी) । इसके अलावा, हम एक और HEK-व्युत्पंन स्थिर सेल लाइन (एनजी) है कि constitutively व्यक्त Gal4-ल्यूक और Gal4/VP16-टैग NΔE (NΔE-जीवी) उत्पंन । इन उपंयास सब्सट्रेट-विशिष्ट γ-secretase परख का उपयोग करना, अब हम एक तरीका है और अलग सब्सट्रेट (अनुप्रयोग-तटरक्षक कोशिकाओं में C99, या एनजी कोशिकाओं में NΔE) की ओर γ-secretase की उत्प्रेरक गतिविधि भेद प्रदान करते हैं । इसके अलावा, सब्सट्रेट विशिष्ट γ-secretase परख के लिए उच्च सामग्री स्क्रीनिंग प्लेटफार्मों के लिए अनुकूल हो डिजाइन किए गए थे । इन नव उत्पंन γ-secretase परख उपंयास γ की खोज-secretase मॉडुलन कि अगली पीढ़ी के उपचार के लिए अवांछनीय पायदान अवरोध को दूर करने के बिना Aβ उत्पादन को दबा कर संज्ञानात्मक समारोह में सुधार सकता है के लिए मार्ग प्रशस्त सकता है of AD.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>VictorLight luminescence plate reader</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>2030-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Class II, Type 2 Biological Safety Cabinet</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1300 Series A2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CL-387,785</td>
			<td>EMD Calbiochem</td>
			<td>233100-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPT</td>
			<td>Merck</td>
			<td>565770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12100046</td>
			<td>main compnent of growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>16000044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blasticidin</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A1113903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeocin</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>R25005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygromycin B</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10687010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytomer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>BR717805 Aldrich</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well microplate</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>156545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T7660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steady-Glo luciferase assay reagent</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidified CO2 incubator</td>
			<td>Revco</td>
			<td>Ultima II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-REx293 cell line</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R71007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wallac 1420 software version 3.0</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td>instrument control software of the luminescence microplate reader</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative measurement of &#947;-secretase-mediated amyloid precursor protein and notch cleavage in cell-based luciferase reporter assay platforms

हम सेल के एक जोड़ी विकसित किया है रिपोर्टर जीन परख मात्रात्मक मापने के लिए γ-secretase दरार अलग सब्सट्रेट के । इस पांडुलिपि प्रक्रियाओं है कि γ-secretase-या तो अनुप्रयोग की मध्यस्थता दरार-C99 या पायदान, एक Gal4 प्रमोटर चालित जुगनू luciferase रिपोर्टर प्रणाली का उपयोग कर की निगरानी करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है वर्णन करता है । इन परख Gal4 के साथ छुरा सह transfecting HEK293 कोशिकाओं द्वारा स्थापित किया गया luciferase रिपोर्टर जीन और या तो Gal4/VP16-टैग सी-अनुप्रयोग के टर्मिनल टुकड़ा (app-C99; तटरक्षक कोशिकाओं), या Gal4/VP16-tagged पायदान-ΔE (NΔE; एनजी कोशिकाओं) । समानांतर में इन रिपोर्टर परख का प्रयोग, हम प्रदर्शन किया है कि एक ErbB2 अवरोध करनेवाला, सीएल-३८७,७८५, तरजीही γ-अनुप्रयोग के secretase दरार-तटरक्षक कोशिकाओं में C99, लेकिन नहीं एनजी कोशिकाओं में NΔE को दबा सकते हैं । अंतर सीजी और एनजी कोशिकाओं द्वारा प्रदर्शित, जब सीएल-३८७,७८५ के साथ इलाज किया, γ-secretase मॉडुलन के लिए एक पसंदीदा विशेषता का प्रतिनिधित्व करते हैं, और इन प्रतिक्रियाओं पैन के विपरीत में कर रहे हैं-γ के निषेध-secretase DAPT द्वारा प्रेरित । हमारे अध्ययन प्रत्यक्ष सबूत है कि विभिंन सब्सट्रेट की ओर γ-secretase गतिविधियों एक सेलुलर संदर्भ में विभेदित किया जा सकता है प्रदान करते हैं । इन नए परख इसलिए बेहतर विज्ञापन चिकित्सा के लिए दवा की खोज में उपयोगी उपकरण हो सकता है ।

सीएल-३८७,७८५ द्वारा ErbB2 के निषेध अंतर एप्लिकेशन-C99 द्वारा अनुप्रयोग के प्रसंस्करण को बढ़ावा कर सकते हैं γ -पायदान दरार को प्रभावित किए बिना secretase एक सेल आधारित परख कि मात्रा...

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Quantitative Measurement of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â³-Secretase-mediated Amyloid Precursor Protein and Notch Cleavage in Cell-based Luciferase Reporter Assay Platforms

कोशिका-आधारित Luciferase रिपोर्टर परख प्लेटफार्मों में γ-Secretase-मध्यस्थता Amyloid प्रणेता प्रोटीन और पायदान दरार की मात्रात्मक माप

हम सफलतापूर्वक दो सब्सट्रेट-विशिष्ट γ-secretase परख उत्पंन किया है । दोनों सेल आधारित परख यहां प्रस्तुत γ यों तो जुगनू luciferase पत्रकारों के उत्पादन के माध्यम से secretase एंजाइमी गतिविधियों के लिए डिज़ाइन कर रहे हैं ।

We have developed a pair of cell-based reporter gene assays to quantitatively measure &#947;-secretase cleavage of distinct substrates. This manuscript ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Quantitative Measurement of &#947;-Secretase-mediated Amyloid Precursor Protein and Notch Cleavage in Cell-based Luciferase Reporter Assay Platforms

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Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

की जांच<em&gt; बगल में</emपर&gt; प्रोटीन प्रोटीन परिसरों<em&gt; ड्रोसोफिला</emनिकटता Ligation परख का उपयोग&gt; लारवल neuromuscular जंक्शन

Discs large (Dlg) is a conserved member of the membrane-associated guanylate kinase family, and serves as a major scaffolding protein at the larval ...

Stereotaxic Infusion of Oligomeric Amyloid-beta into the Mouse Hippocampus

माउस हिप्पोकैंपस में Oligomeric Amyloid-बीटा की Stereotaxic आसव

Alzheimer&#8217;s disease is a neurodegenerative disease affecting the aging population. A key neuropathological feature of the disease is the ...

Quantitative Measurement of Relative Retinoic Acid Levels in E8.5 Embryos and Neurosphere Cultures Using the F9 RARE-Lacz Cell-based Reporter Assay

E8.5 भ्रूण और neurosphere संस्कृतियों में सापेक्ष retinoic एसिड स्तर के मात्रात्मक मापन F9 दुर्लभ lacZ सेल आधारित रिपोर्टर परख का उपयोग

Retinoic acid (RA) is an important developmental morphogen that coordinates anteroposterior and dorsoventral axis patterning, somitic differentiation, ...

Modeling Amyloid-&#946;42 Toxicity and Neurodegeneration in Adult Zebrafish Brain

Modeling Amyloid-ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²42 Toxicity and Neurodegeneration in Adult Zebrafish Brain

मॉडलिंग Amyloid-β ४२ विषाक्तता और वयस्क Zebrafish मस्तिष्क में Neurodegeneration

Alzheimer's disease (AD) is a debilitating neurodegenerative disease in which accumulation of toxic amyloid-&#946;42 (A&#946;42) peptides leads to ...

Assay Development for High Content Quantification of Sod1 Mutant Protein Aggregate Formation in Living Cells

उच्च सामग्री के लिए परख विकास Sod1 उत्परिवर्ती प्रोटीन समग्र गठन के रहने की कोशिकाओं में ठहराव

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disease that can be caused by inherited mutations in the gene encoding copper-zinc ...

Quantitative Autoradiographic Method for Determination of Regional Rates of Cerebral Protein Synthesis In Vivo

विवो में सेरेब्रल प्रोटीन संश्लेषण की क्षेत्रीय दरों के निर्धारण के लिए मात्रात्मक ऑटोरेडियोग्राफिक विधि

Protein synthesis is required for development and maintenance of neuronal function and is involved in adaptive changes in the nervous system. Moreover, it ...