Name: quantitative measurement of &#947;-secretase-mediated amyloid precursor protein and notch cleavage in cell-based luciferase reporter assay platforms
Uploaded: 2018-01-25T12:30:00
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저자는 기술 지원에 대 한 연구소의 휴대 및 Organismic 생물학, 학계 Sinica의 핵심 시설을 감사합니다. 이 연구는 과학과 기술, 대만 (Y. f 가장 103-2320-B-001-016-MY3에 의해 지원 되었다 L.), 의약품 개발-기술 플랫폼 축 지원의 변환 혁신 프로그램 (Y. 플로리다에 NP7) 체계, 그리고 학계 Sinica (하 영-플로리다).

1. 해당 애플 리 케이 션-C99 또는 NΔE의 γ-Secretase 분열 하는 Luciferase 기자 신호 측정
참고: CG과 셀20,21의 세대에 대 한 자세한 설명에 대 한 이전 게시를 참조 하십시오.
<ol><li>
NG 또는 CG 셀 씨앗 (20, 000 셀/잘) 200 μ/잘 Dulbecco의 수정이 글 중간 (DMEM) 플러스 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 5 μ g/mL blasticidin, 250 μ g/mL 항생제 (예: ...

<ol>
	<li>Selkoe, D. J., Hardy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+amyloid+hypothesis+of+Alzheimer's+disease+at+25+years.">The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease at 25 years.</a> EMBO Mol Med. 8 (6), 595-608 (2016).</li><li>Wolfe, M. S., Guenette, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=APP+at+a+glance.">APP at a glance.</a> J Cell Sci. 120 (Pt 18), 3157-3161 (2007).</li><li>Karran, E., Mercken, M., De Strooper, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+amyloid+cascade+hypothesis+for+Alzheimer's+disease:+an+appraisal+for+the+development+of+therapeutics.">The amyloid cascade hypothesis for Alzheimer's disease: an appraisal for the development of therapeutics.</a> Nat Rev Drug Discov. 10 (9), 698-712 (2011).</li><li>Citron, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alzheimer's+disease:+strategies+for+disease+modification.">Alzheimer's disease: strategies for disease modification.</a> Nat Rev Drug Discov. 9 (5), 387-398 (2010).</li><li>Vassar, R., Kovacs, D. M., Yan, R., Wong, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+beta-secretase+enzyme+BACE+in+health+and+Alzheimer's+disease:+regulation,+cell+biology,+function,+and+therapeutic+potential.">The beta-secretase enzyme BACE in health and Alzheimer's disease: regulation, cell biology, function, and therapeutic potential.</a> J Neurosci. 29 (41), 12787-12794 (2009).</li><li>Parks, A. L., Curtis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presenilin+diversifies+its+portfolio.">Presenilin diversifies its portfolio.</a> Trends Genet. 23 (3), 140-150 (2007).</li><li>Kukar, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate-targeting+gamma-secretase+modulators.">Substrate-targeting gamma-secretase modulators.</a> Nature. 453 (7197), 925-929 (2008).</li><li>Kounnas, M. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+gamma-secretase+reduces+beta-amyloid+deposition+in+a+transgenic+mouse+model+of+Alzheimer's+disease.">Modulation of gamma-secretase reduces beta-amyloid deposition in a transgenic mouse model of Alzheimer's disease.</a> Neuron. 67 (5), 769-780 (2010).</li><li>Thathiah, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+orphan+G+protein-coupled+receptor+3+modulates+amyloid-beta+peptide+generation+in+neurons.">The orphan G protein-coupled receptor 3 modulates amyloid-beta peptide generation in neurons.</a> Science. 323 (5916), 946-951 (2009).</li><li>Flajolet, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Alzheimer's+disease+amyloid-beta+formation+by+casein+kinase+I.">Regulation of Alzheimer's disease amyloid-beta formation by casein kinase I.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (10), 4159-4164 (2007).</li><li>Eisele, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gleevec+increases+levels+of+the+amyloid+precursor+protein+intracellular+domain+and+of+the+amyloid-beta+degrading+enzyme+neprilysin.">Gleevec increases levels of the amyloid precursor protein intracellular domain and of the amyloid-beta degrading enzyme neprilysin.</a> Mol Biol Cell. 18 (9), 3591-3600 (2007).</li><li>He, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gamma-secretase+activating+protein+is+a+therapeutic+target+for+Alzheimer's+disease.">Gamma-secretase activating protein is a therapeutic target for Alzheimer's disease.</a> Nature. 467 (7311), 95-98 (2010).</li><li>Haapasalo, A., Kovacs, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+many+substrates+of+presenilin/gamma-secretase.">The many substrates of presenilin/gamma-secretase.</a> J Alzheimers Dis. 25 (1), 3-28 (2011).</li><li>Gillman, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+and+Evaluation+of+BMS-708163,+a+Potent,+Selective+and+Orally+Bioavailable+gamma-Secretase+Inhibitor.">Discovery and Evaluation of BMS-708163, a Potent, Selective and Orally Bioavailable gamma-Secretase Inhibitor.</a> ACS Med Chem Lett. 1 (3), 120-124 (2010).</li><li>Hopkins, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ACS+chemical+neuroscience+molecule+spotlight+on+Begacestat+(GSI-953).">ACS chemical neuroscience molecule spotlight on Begacestat (GSI-953).</a> ACS Chem Neurosci. 3 (1), 3-4 (2012).</li><li>Yang, T., Arslanova, D., Gu, Y., Augelli-Szafran, C., Xia, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+gamma-secretase+modulation+differentiates+inhibitor+compound+selectivity+between+two+substrates+Notch+and+amyloid+precursor+protein.">Quantification of gamma-secretase modulation differentiates inhibitor compound selectivity between two substrates Notch and amyloid precursor protein.</a> Mol Brain. 1, 15 (2008).</li><li>McKee, T. D., Loureiro, R. M., Dumin, J. A., Zarayskiy, V., Tate, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+cell-based+method+for+determining+the+gamma-secretase+enzyme+activity+against+both+Notch+and+APP+substrates.">An improved cell-based method for determining the gamma-secretase enzyme activity against both Notch and APP substrates.</a> J Neurosci Methods. 213 (1), 14-21 (2013).</li><li>Basi, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+precursor+protein+selective+gamma-secretase+inhibitors+for+treatment+of+Alzheimer's+disease.">Amyloid precursor protein selective gamma-secretase inhibitors for treatment of Alzheimer's disease.</a> Alzheimers Res Ther. 2 (6), 36 (2010).</li><li>Liao, Y. F., Tang, Y. C., Chang, M. Y., Wang, B. J., Hu, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+small+molecular+(D)-leucinamides+as+potent,+Notch-sparing+gamma-secretase+modulators.">Discovery of small molecular (D)-leucinamides as potent, Notch-sparing gamma-secretase modulators.</a> Eur J Med Chem. 79, 143-151 (2014).</li><li>Liao, Y. F., Wang, B. J., Cheng, H. T., Kuo, L. H., Wolfe, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+necrosis+factor-alpha,+interleukin-1beta,+and+interferon-gamma+stimulate+gamma-secretase-mediated+cleavage+of+amyloid+precursor+protein+through+a+JNK-dependent+MAPK+pathway.">Tumor necrosis factor-alpha, interleukin-1beta, and interferon-gamma stimulate gamma-secretase-mediated cleavage of amyloid precursor protein through a JNK-dependent MAPK pathway.</a> J Biol Chem. 279 (47), 49523-49532 (2004).</li><li>Wang, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ErbB2+regulates+autophagic+flux+to+modulate+the+proteostasis+of+APP-CTFs+in+Alzheimer's+disease.">ErbB2 regulates autophagic flux to modulate the proteostasis of APP-CTFs in Alzheimer's disease.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (15), E3129-E3138 (2017).</li><li>Sevigny, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+antibody+aducanumab+reduces+Abeta+plaques+in+Alzheimer's+disease.">The antibody aducanumab reduces Abeta plaques in Alzheimer's disease.</a> Nature. 537 (7618), 50-56 (2016).</li><li>Golde, T. E., Koo, E. H., Felsenstein, K. M., Osborne, B. A., Miele, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=gamma-Secretase+inhibitors+and+modulators.">gamma-Secretase inhibitors and modulators.</a> Biochim Biophys Acta. 1828 (12), 2898-2907 (2013).</li><li>Coric, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Prodromal+Alzheimer+Disease+With+Avagacestat:+A+Randomized+Clinical+Trial.">Targeting Prodromal Alzheimer Disease With Avagacestat: A Randomized Clinical Trial.</a> JAMA Neurol. 72 (11), 1324-1333 (2015).</li><li>Mitani, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+between+gamma-secretase+inhibitors+and+modulators+on+cognitive+function+in+amyloid+precursor+protein-transgenic+and+nontransgenic+mice.">Differential effects between gamma-secretase inhibitors and modulators on cognitive function in amyloid precursor protein-transgenic and nontransgenic mice.</a> J Neurosci. 32 (6), 2037-2050 (2012).</li><li>Penninkilampi, R., Brothers, H. M., Eslick, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+Agents+Targeting+gamma-Secretase+Increase+Risk+of+Cancer+and+Cognitive+Decline+in+Alzheimer's+Disease+Patients:+A+Systematic+Review+and+Meta-Analysis.">Pharmacological Agents Targeting gamma-Secretase Increase Risk of Cancer and Cognitive Decline in Alzheimer's Disease Patients: A Systematic Review and Meta-Analysis.</a> J Alzheimers Dis. 53 (4), 1395-1404 (2016).</li></ol>

광고에 대 한 aducanumab immunotherapy의 단계 1b 재판에서 유망한 결과 단단히 광고22 의 병 인에 Aβ의 중요 한 역할을 설립 하 고 안티-Aβ 접근은 여전히 안티 광고 약물의 개발에 대 한 실행 가능한 전략을 제안. 여기, 우리는 애플 리 케이 션-C99 및 반딧불 luciferase 기자 시스템을 사용 하 여 NΔE의 γ-secretase 촉매 베이스 측정을 위한 세포 기반 분석 설명 합니다. 응용 프로그램-C99 및 NΔE?...

아 밀 로이드 β (Aβ)의 oligomeric 모양은 neurodegeneration Alzheimer의 질병 (광고)1에서 고통 받는 환자의 두뇌에서의 주요 원인이 될 것으로 추정 된다. Aβ 펩 티 드 그리고 γ-secretase2β-secretase에 의해 처음으로 녹말 체 선구자 단백질 (APP)의 stepwise 분열에 의해 생산 됩니다. 지난 10 년간에서 광고의 치료로 치료 접근 Aβ 생산3의 예방에 집중 했다. 연구의 대부분은 애플 리 케이 션의 γ-secretase 분열을 배제 하 고 그로 인하여 Aβ의 생산 또는 β-및/또는 γ-secretase 활동4의 금지를 감소 수 있는 α-secretase 활동의 확대에 집중 했다. 불행히도, 피할 수 없는 부작용에 β 또는 γ secretases 결과의 비 선택적인 억제는 β와 γ-secretase5,6의 다른 생리 적인 기판의 기능 방해 예정 이다. Γ-secretase 억제제에 관한 최근 연구 화학 및 유전 변조기 노치7의 필수적인 γ-secretase 중재 처리에 사소한 영향을 발휘 하는 동안 Aβ 생산을 통제할 수 있는 수의 발견 보고 그러나 ,,89,10,11,12,, 성공적인 치료 아직 개발 하지 않은. 따라서, 더 체계적인 스크린은 보증 소설 유전과 화학 한정자 선택적으로 γ-secretase 중재 애플 리 케이 션 처리를 조절 수 있습니다 발견.
Γ-Secretase 이상의 90 다른 막 정박 단백질을 쪼개로 알려져 있다. 이러한 기판 중 그 활동은 세포 운명 결정과 분화 개발13과정에 대 한 중요 한 단계가입니다. 선택적으로 변조 γ-secretase 촉매 응용 프로그램 부재에 처리에 영향을 미치는 노치의 처리 부작용에 대 한 최소화 노치 관련 γ-secretase 억제제의 필수적인 되며이 선택도 기본 요소가 될 것으로 생각 됩니다. 광고의 만성 치료에 대 한 잠재적인 γ-secretase 변조기의 생물학적 효능을 지정 합니다. 다양 한 arylsulfonamide 유도체, GSI-953 (begacestat) 등 BMS-708163 (avagacestat), γ-secretase14,15의 강력 하 고 선택적인 억제를 전시 발견 되었습니다 되었습니다. 이전 연구는 APP와 노치의 γ-secretase 분열의 차동 저해 조합 vivo에서 유효성 검사 zebrafish16를 사용 하 여 양이 많은 ELISA 기반 분석 결과 사용 하 여 관찰 될 수 있다 설명 했다. 또한, 세포 기반 분석 결과 패러다임 γ-secretase 애플 리 케이 션 및 노치17,18대의 잠재적인 기판 선택도 해결 하기 위해 설립 되었습니다. 여기 설명한 비슷한 프로토콜을 사용 하 여, 우리는 최근에 발견 (D)의 소설 클래스-potently 노치를 살려주는 선택도19APP의 γ-secretase 분열을 조절 하는 leucinamides. 함께,이 연구의 제공의 증거-개념 γ-secretase의 기판 선택/가용성 화학 변조 및 실험 검증 대상이 될 수 있는 개념을 지 원하는 됩니다. 그러나, 이러한 분석 결과 플랫폼 종종 상대적으로 낮은 처리량 판독 및 약물 발견 프로그램에 대 한 산업 표준에 맞지 수 있습니다 노동 집약적인 접근에 의존 합니다.
우리는 최근 셀 기반 luciferase 취재 원 유전자 분석 실험 양적 γ-secretase 두 가지 기판, APP (응용 프로그램-C99)의 99 아미노 산 성 C 터미널 단편과는 세포 외의 촉매 활동을 확인할 수 있는 생성 된 도메인 삭제 노치 펩 티 드 (NΔE)입니다. 애플 리 케이 션-C99 및 NΔE γ-secretase 다양 한 분석 실험에서의 직접 기판으로 널리 사용 되었습니다 있다. 균일 하 고 일관 된 luciferase 리포터 유전자 분석 애플 리 케이 션-C99 또는 NΔE의 γ-secretase 분열에 대 한 생성, 우리 생성 한 HEK 파생 안정적인 셀 라인 (CG) constitutively Gal4 발기인 구동 반딧불 luciferase 기자 (표현 하 Gal4-Luc)와 Gal4/VP16 태그 애플 리 케이 션-C99 융합 단백질 (C99-GV). 또한, constitutively Gal4 루크와 Gal4/VP16 태그 NΔE (NΔE-GV)를 표현 하는 또 다른 HEK 파생 안정적인 셀 라인 (NG)를 생성 했습니다. 이러한 새로운 기판 전용 γ-secretase 분석 실험을 사용 하 여, 우리 이제 계량 하 고 γ-secretase 별개 기판 (애플 리 케이 션-C99 CG 세포에서) 또는 NG 셀에 NΔE로의 촉매 활동을 구별 하는 방법을 제공 합니다. 또한, 기판 전용 γ-secretase 분석 실험이 콘텐츠 심사 플랫폼에 도움이 되도록 설계 되었습니다. 이 새로 생성 된 γ-secretase 분석 도출 다음-세대 치료에 대 한 바람직하지 않은 노치 저해 하지 않고 Aβ 생산을 억제 하 여 인지 기능을 향상 시킬 수 있습니다. 있는 소설 γ-secretase 변조기의 발견에 대 한 길을 닦은 수 있습니다. 광고.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>VictorLight luminescence plate reader</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>2030-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Class II, Type 2 Biological Safety Cabinet</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1300 Series A2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CL-387,785</td>
			<td>EMD Calbiochem</td>
			<td>233100-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPT</td>
			<td>Merck</td>
			<td>565770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12100046</td>
			<td>main compnent of growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>16000044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blasticidin</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A1113903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeocin</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>R25005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygromycin B</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10687010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytomer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>BR717805 Aldrich</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well microplate</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>156545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T7660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steady-Glo luciferase assay reagent</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidified CO2 incubator</td>
			<td>Revco</td>
			<td>Ultima II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-REx293 cell line</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R71007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wallac 1420 software version 3.0</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td>instrument control software of the luminescence microplate reader</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative measurement of &#947;-secretase-mediated amyloid precursor protein and notch cleavage in cell-based luciferase reporter assay platforms

우리는 양적 측정 별개 기판의 γ-secretase 분열 하 셀 기반 리포터 유전자 분석 실험의 한 쌍을 개발 했습니다. 이 원고는 애플 리 케이 션-C99 또는 Gal4 발기인 구동 반딧불 luciferase 기자 시스템을 사용 하 여 노치의 γ-secretase 중재 분열을 모니터링 하는 데 사용할 수 있는 절차를 설명 합니다. 이 분석 실험 안정적으로 공동 Gal4 구동 luciferase 취재 원 유전자와 응용 프로그램 (애플 리 케이 션-C99;의 C-터미널 Gal4/VP16 태그 조각 HEK293 세포 transfecting에 의해 설립 되었다 Cg로 셀), 또는 Gal4/VP16 태그 노치-ΔE (NΔE; NG 셀)입니다. 동시에 이러한 기자 분석 실험을 사용 하 여, 우리는 증명 하고있다 ErbB2 억제제, CL-387,785, 우선적으로 CG 셀에 애플 리 케이 션-C99 하지만 NG 셀에 NΔE 하지의 γ-secretase 분열을 억제 하실 수 있습니다. CL-387,785로 치료 하면 CG과 세포에 의해 전시 하는 차동 응답 γ-secretase 변조기에 대 한 선호 특성 나타내고 이러한 응답 γ-secretase DAPT에 의해 유도 된 팬 억제에 강한 대조에 있다. 우리의 연구는 다른 기판으로 γ-secretase 활동 세포 맥락에서 분화 될 수 있다 직접적인 증거를 제공 합니다. 이러한 새로운 분석 따라서 향상 된 광고 치료를 위한 약물 발견에 유용한 도구를 수 있습니다.

CL 387,785에 의해 ErbB2 저해에 의해 애플 리 케이 션-C99의 처리 홍보 차동 수 있습니다. Γ -secretase 노치 분열에 영향을 주지 않고 양적 특정 γ-secretase 기판의 분해 분열을 측정할 수 있는 세포 기반 분석 결과 설정 하는 항생물질을 유도할 수 있는 C 말기 Gal4/VP16 태그의 안정적인 공동 transfection에 의해 HEK293 파생 CG 셀 라인 생성 응용 프?...

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Quantitative Measurement of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â³-Secretase-mediated Amyloid Precursor Protein and Notch Cleavage in Cell-based Luciferase Reporter Assay Platforms

Γ-Secretase 중재 녹말 체 선구자 단백질 및 세포 기반 Luciferase 기자 시험 플랫폼에 노치 분열의 정량적 측정

우리는 성공적으로 두 기판 전용 γ-secretase 분석 생성 된 있다. 여기에 제시 된 두 세포 기반 분석은 계량 반딧불 luciferase 기자 들의 출력을 통해 γ-secretase 효소 활동 설계 되었습니다.

We have developed a pair of cell-based reporter gene assays to quantitatively measure &#947;-secretase cleavage of distinct substrates. This manuscript ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Quantitative Measurement of &#947;-Secretase-mediated Amyloid Precursor Protein and Notch Cleavage in Cell-based Luciferase Reporter Assay Platforms

Selection of Aptamers for Amyloid &beta;-Protein, the Causative Agent of Alzheimer&#39;s Disease

Selection of Aptamers for Amyloid ÃƒÅ½Ã‚Â²-Protein, the Causative Agent of Alzheimer's Disease

아밀로이드 β 단백질, 알츠하이머 병의 원인이되는 에이전트에 대한 Aptamers의 선택

Alzheimer's disease (AD) is a progressive, age-dependent, neurodegenerative disorder with an insidious course that renders its presymptomatic diagnosis ...

연구

신경과학

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

손상의 감각 오르간 전구체 세포 라이브 셀 이미징 Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

A Galvanotaxis Assay for Analysis of Neural Precursor Cell Migration Kinetics in an Externally Applied Direct Current Electric Field

외부 응용 직류 전기 분야에 신경 전구체 세포 마이그레이션 속도론 분석을위한 Galvanotaxis 분석

The discovery of neural stem and progenitor  cells (collectively termed neural precursor cells) (NPCs) in the adult  mammalian brain has led to a body of ...

High-throughput Analysis of Mammalian Olfactory Receptors: Measurement of Receptor Activation via Luciferase Activity

루시 페라 제 활동을 통해 수용체 활성화의 측정 : 포유류의 후각 수용체의 높은 처리량 분석

Odorants create unique and overlapping patterns of olfactory receptor activation, allowing a family of approximately 1,000 murine and 400 human receptors ...

Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

검출<em&gt; 현장에서</em상기&gt; 단백질 - 단백질 복합체<em&gt; 초파리</em근접 내고 분석을 사용하기&gt; 애벌레 신경 근육 접합부

Discs large (Dlg) is a conserved member of the membrane-associated guanylate kinase family, and serves as a major scaffolding protein at the larval ...

Stereotaxic Infusion of Oligomeric Amyloid-beta into the Mouse Hippocampus

마우스 해마에 올리고머 아밀로이드 - 베타의 정위 주입

Alzheimer&#8217;s disease is a neurodegenerative disease affecting the aging population. A key neuropathological feature of the disease is the ...

Quantitative Measurement of Relative Retinoic Acid Levels in E8.5 Embryos and Neurosphere Cultures Using the F9 RARE-Lacz Cell-based Reporter Assay

F9를 RARE-LacZ를 셀 기반 리포터 분석을 사용하여 E8.5 배아 및 Neurosphere 문화에서 상대 레티노 산 수준의 정량적 측정

Retinoic acid (RA) is an important developmental morphogen that coordinates anteroposterior and dorsoventral axis patterning, somitic differentiation, ...

Modeling Amyloid-&#946;42 Toxicity and Neurodegeneration in Adult Zebrafish Brain

Modeling Amyloid-ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²42 Toxicity and Neurodegeneration in Adult Zebrafish Brain

아 밀 로이드-β42 독성 그리고 Zebrafish 두뇌에서 Neurodegeneration 모델링

Alzheimer's disease (AD) is a debilitating neurodegenerative disease in which accumulation of toxic amyloid-&#946;42 (A&#946;42) peptides leads to ...

Assay Development for High Content Quantification of Sod1 Mutant Protein Aggregate Formation in Living Cells

살아있는 세포에 Sod1 돌연변이 단백질 집계 형성의 높은 콘텐츠 정량화에 대 한 분석 결과 개발

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disease that can be caused by inherited mutations in the gene encoding copper-zinc ...

Quantitative Autoradiographic Method for Determination of Regional Rates of Cerebral Protein Synthesis In Vivo

생체 내 뇌 단백질 합성의 지역 비율 측정을 위한 정량적 자가 방사선 측정 방법

Protein synthesis is required for development and maintenance of neuronal function and is involved in adaptive changes in the nervous system. Moreover, it ...