Name: quantitative measurement of &#947;-secretase-mediated amyloid precursor protein and notch cleavage in cell-based luciferase reporter assay platforms
Uploaded: 2018-01-25T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Measurement of ÃŽÂ³-Secretase-mediated Amyloid Precursor Protein and Notch Cleavage in Cell-based Luciferase Reporter Assay Platforms at JoVE.com

Författarna vill tacka den Core Facility av institutet av cellulär och organismnivå biologi, Academia Sinica, för teknisk support. Denna studie stöddes av ministeriet för vetenskap och teknik, Taiwan (mest 103-2320-B-001-016-MY3 till Y.-F. L.), programmet för translationell Innovation av biofarmaceutiska utveckling – teknik stödja plattformen Axis system (NP7 till Y.-F.L.), och Academia Sinica (till Y.-F.L.).

1. mätning av luciferas Reporter signaler, som motsvarar till γ-sekretas klyvning av APP-C99 eller NΔE
Obs: Hänvisas till de tidigare publikationerna för detaljerade beskrivningar av generation av CG och NG celler20,21.
<ol><li>
Utsäde NG eller CG celler (20, 000 celler per brunn) på 96 brunnar mikroplattor på en slutlig volym av 200 μL/brunn i odlingsmedium som består av Dulbeccos modifierade Eagle Medium (DMEM) pl...

<ol>
	<li>Selkoe, D. J., Hardy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+amyloid+hypothesis+of+Alzheimer's+disease+at+25+years.">The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease at 25 years.</a> EMBO Mol Med. 8 (6), 595-608 (2016).</li><li>Wolfe, M. S., Guenette, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=APP+at+a+glance.">APP at a glance.</a> J Cell Sci. 120 (Pt 18), 3157-3161 (2007).</li><li>Karran, E., Mercken, M., De Strooper, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+amyloid+cascade+hypothesis+for+Alzheimer's+disease:+an+appraisal+for+the+development+of+therapeutics.">The amyloid cascade hypothesis for Alzheimer's disease: an appraisal for the development of therapeutics.</a> Nat Rev Drug Discov. 10 (9), 698-712 (2011).</li><li>Citron, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alzheimer's+disease:+strategies+for+disease+modification.">Alzheimer's disease: strategies for disease modification.</a> Nat Rev Drug Discov. 9 (5), 387-398 (2010).</li><li>Vassar, R., Kovacs, D. M., Yan, R., Wong, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+beta-secretase+enzyme+BACE+in+health+and+Alzheimer's+disease:+regulation,+cell+biology,+function,+and+therapeutic+potential.">The beta-secretase enzyme BACE in health and Alzheimer's disease: regulation, cell biology, function, and therapeutic potential.</a> J Neurosci. 29 (41), 12787-12794 (2009).</li><li>Parks, A. L., Curtis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presenilin+diversifies+its+portfolio.">Presenilin diversifies its portfolio.</a> Trends Genet. 23 (3), 140-150 (2007).</li><li>Kukar, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate-targeting+gamma-secretase+modulators.">Substrate-targeting gamma-secretase modulators.</a> Nature. 453 (7197), 925-929 (2008).</li><li>Kounnas, M. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+gamma-secretase+reduces+beta-amyloid+deposition+in+a+transgenic+mouse+model+of+Alzheimer's+disease.">Modulation of gamma-secretase reduces beta-amyloid deposition in a transgenic mouse model of Alzheimer's disease.</a> Neuron. 67 (5), 769-780 (2010).</li><li>Thathiah, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+orphan+G+protein-coupled+receptor+3+modulates+amyloid-beta+peptide+generation+in+neurons.">The orphan G protein-coupled receptor 3 modulates amyloid-beta peptide generation in neurons.</a> Science. 323 (5916), 946-951 (2009).</li><li>Flajolet, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Alzheimer's+disease+amyloid-beta+formation+by+casein+kinase+I.">Regulation of Alzheimer's disease amyloid-beta formation by casein kinase I.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (10), 4159-4164 (2007).</li><li>Eisele, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gleevec+increases+levels+of+the+amyloid+precursor+protein+intracellular+domain+and+of+the+amyloid-beta+degrading+enzyme+neprilysin.">Gleevec increases levels of the amyloid precursor protein intracellular domain and of the amyloid-beta degrading enzyme neprilysin.</a> Mol Biol Cell. 18 (9), 3591-3600 (2007).</li><li>He, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gamma-secretase+activating+protein+is+a+therapeutic+target+for+Alzheimer's+disease.">Gamma-secretase activating protein is a therapeutic target for Alzheimer's disease.</a> Nature. 467 (7311), 95-98 (2010).</li><li>Haapasalo, A., Kovacs, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+many+substrates+of+presenilin/gamma-secretase.">The many substrates of presenilin/gamma-secretase.</a> J Alzheimers Dis. 25 (1), 3-28 (2011).</li><li>Gillman, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+and+Evaluation+of+BMS-708163,+a+Potent,+Selective+and+Orally+Bioavailable+gamma-Secretase+Inhibitor.">Discovery and Evaluation of BMS-708163, a Potent, Selective and Orally Bioavailable gamma-Secretase Inhibitor.</a> ACS Med Chem Lett. 1 (3), 120-124 (2010).</li><li>Hopkins, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ACS+chemical+neuroscience+molecule+spotlight+on+Begacestat+(GSI-953).">ACS chemical neuroscience molecule spotlight on Begacestat (GSI-953).</a> ACS Chem Neurosci. 3 (1), 3-4 (2012).</li><li>Yang, T., Arslanova, D., Gu, Y., Augelli-Szafran, C., Xia, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+gamma-secretase+modulation+differentiates+inhibitor+compound+selectivity+between+two+substrates+Notch+and+amyloid+precursor+protein.">Quantification of gamma-secretase modulation differentiates inhibitor compound selectivity between two substrates Notch and amyloid precursor protein.</a> Mol Brain. 1, 15 (2008).</li><li>McKee, T. D., Loureiro, R. M., Dumin, J. A., Zarayskiy, V., Tate, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+cell-based+method+for+determining+the+gamma-secretase+enzyme+activity+against+both+Notch+and+APP+substrates.">An improved cell-based method for determining the gamma-secretase enzyme activity against both Notch and APP substrates.</a> J Neurosci Methods. 213 (1), 14-21 (2013).</li><li>Basi, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+precursor+protein+selective+gamma-secretase+inhibitors+for+treatment+of+Alzheimer's+disease.">Amyloid precursor protein selective gamma-secretase inhibitors for treatment of Alzheimer's disease.</a> Alzheimers Res Ther. 2 (6), 36 (2010).</li><li>Liao, Y. F., Tang, Y. C., Chang, M. Y., Wang, B. J., Hu, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+small+molecular+(D)-leucinamides+as+potent,+Notch-sparing+gamma-secretase+modulators.">Discovery of small molecular (D)-leucinamides as potent, Notch-sparing gamma-secretase modulators.</a> Eur J Med Chem. 79, 143-151 (2014).</li><li>Liao, Y. F., Wang, B. J., Cheng, H. T., Kuo, L. H., Wolfe, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+necrosis+factor-alpha,+interleukin-1beta,+and+interferon-gamma+stimulate+gamma-secretase-mediated+cleavage+of+amyloid+precursor+protein+through+a+JNK-dependent+MAPK+pathway.">Tumor necrosis factor-alpha, interleukin-1beta, and interferon-gamma stimulate gamma-secretase-mediated cleavage of amyloid precursor protein through a JNK-dependent MAPK pathway.</a> J Biol Chem. 279 (47), 49523-49532 (2004).</li><li>Wang, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ErbB2+regulates+autophagic+flux+to+modulate+the+proteostasis+of+APP-CTFs+in+Alzheimer's+disease.">ErbB2 regulates autophagic flux to modulate the proteostasis of APP-CTFs in Alzheimer's disease.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (15), E3129-E3138 (2017).</li><li>Sevigny, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+antibody+aducanumab+reduces+Abeta+plaques+in+Alzheimer's+disease.">The antibody aducanumab reduces Abeta plaques in Alzheimer's disease.</a> Nature. 537 (7618), 50-56 (2016).</li><li>Golde, T. E., Koo, E. H., Felsenstein, K. M., Osborne, B. A., Miele, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=gamma-Secretase+inhibitors+and+modulators.">gamma-Secretase inhibitors and modulators.</a> Biochim Biophys Acta. 1828 (12), 2898-2907 (2013).</li><li>Coric, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Prodromal+Alzheimer+Disease+With+Avagacestat:+A+Randomized+Clinical+Trial.">Targeting Prodromal Alzheimer Disease With Avagacestat: A Randomized Clinical Trial.</a> JAMA Neurol. 72 (11), 1324-1333 (2015).</li><li>Mitani, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+between+gamma-secretase+inhibitors+and+modulators+on+cognitive+function+in+amyloid+precursor+protein-transgenic+and+nontransgenic+mice.">Differential effects between gamma-secretase inhibitors and modulators on cognitive function in amyloid precursor protein-transgenic and nontransgenic mice.</a> J Neurosci. 32 (6), 2037-2050 (2012).</li><li>Penninkilampi, R., Brothers, H. M., Eslick, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+Agents+Targeting+gamma-Secretase+Increase+Risk+of+Cancer+and+Cognitive+Decline+in+Alzheimer's+Disease+Patients:+A+Systematic+Review+and+Meta-Analysis.">Pharmacological Agents Targeting gamma-Secretase Increase Risk of Cancer and Cognitive Decline in Alzheimer's Disease Patients: A Systematic Review and Meta-Analysis.</a> J Alzheimers Dis. 53 (4), 1395-1404 (2016).</li></ol>

De lovande resultaten från en fas 1b-studie av aducanumab immunterapi för AD har etablerat Aβ kritiska roll i patogenesen av AD22 och tyder på att anti-Aβ metoder är fortfarande en livskraftig strategi för utveckling av anti-annonsen droger. Här beskriver vi cellbaserade analyser för att kvantifiera γ-sekretas-katalyseras proteolys av APP-C99 och NΔE använder firefly luciferas reporter system. APP-C99 och NΔE är de två mest väl studerat γ-sekretassubstrat och representerar tillsam...

Oligomera former av β-amyloid (Aβ) tros vara den primära orsaken till nervcellsdöd i hjärnan hos patienter som lider av Alzheimers sjukdom (AD)1. Aβ peptider produceras av stegvis klyvning av amyloid prekursor protein (APP), först av β-sekretas och sedan av γ-sekretas2. Under det senaste decenniet, har behandlingsmetoder mot behandling av AD fokuserat på förebyggande av Aβ produktion3. Majoriteten av studierna har fokuserat på antingen augmentation av α-sekretas aktivitet, som kan hindra γ-sekretas klyvning av APP och därmed minska produktionen av Aβ eller hämning av β-och/eller γ-sekretas verksamhet4. Tyvärr, icke-selektiv hämning av β - eller γ-secretases leder till oundvikliga biverkningar som är på grund av störning av andra fysiologiska substrat av β - och γ-sekretas5,6. Med avseende på γ-sekretas-hämmare, har senare studier rapporterade upptäckten av ett antal kemiska och genetiska modulatorer som kan reglera Aβ produktionen under lätt försumbara effekter på den väsentliga γ-sekretas-medierad bearbetningen av Notch7 ,8,9,10,11,12, dock framgångsrika therapeutics har ännu inte utvecklats. Alltså är ytterligare systematiska skärmar motiverade för att upptäcka nya genetiska och kemiska modifierare som selektivt kan modulera γ-sekretas-medierad APP bearbetning.
Γ-sekretas är känt för att klyva mer än 90 olika membran-förankrade proteiner. Bland dessa substrat är Notch, vars verksamhet är kritisk för cell öde beslutsamhet och differentiering under utveckling13. Selektivt modulera γ-sekretas-katalyseras APP bearbetning i avsaknad påverka Notch bearbetning kommer att vara avgörande för minimera Notch-relaterade biverkningar av γ-sekretas-hämmare, och denna selektivitet är tänkt att vara en primär faktor som kommer att diktera biologiska effekten av potentiella γ-sekretas modulatorer för kronisk behandling av AD. Det har varit ett antal arylsulfonamide derivat, såsom GSI-953 (begacestat) och BMS-708163 (avagacestat), som har befunnits uppvisa potent och selektiv hämning av γ-sekretas14,15. En tidigare studie visat att differential hämning av γ-sekretas klyvning av appen och Notch kan observeras med en kvantitativ ELISA-baserad analys i kombination med i vivo validering med zebrafiskar16. Cell-baserad analys paradigm har dessutom fastställts att ta itu med potentiella substrat selektivitet γ-sekretas mot APP och Notch17,18. Med protokoll liknar de som beskrivs häri, vi har nyligen upptäckt en ny klass av (D)-leucinamides som potent modulera γ-sekretas klyvning av APP med Notch-sparing selektivitet19. Denna samling av studier ger tillsammans ett proof-of-concept stödja uppfattningen att substrat selektivitet/tillgängligheten av γ-sekretas kan vara föremål för kemiska modulering och experimentell verifiering. Dock åberopa dessa assay plattformar ofta relativt låg genomströmning utläsningar och arbetsintensiva metoder som inte kanske uppfyller industristandarder för drug discovery program.
Vi har nyligen genererade cellbaserade luciferas reporter gen analyser som kvantitativt kan avgöra den katalytiska aktiviteten av γ-sekretas mot två distinkta substrat, 99-amino acid C-terminal fragmentet av APP (APP-C99) och den extracellulära domän-raderade Notch peptid (NΔE). Både APP-C99 och NΔE har använts som direkt substrat för γ-sekretas i olika analyser. För att skapa homogena och konsekvent luciferas reporter gen analyser för γ-sekretas klyvning av antingen APP-C99 eller NΔE, genererade vi en HEK-derived stabil cellinje (CG) som konstitutivt uttrycker en Gal4 arrangören-driven firefly luciferas reporter ( Gal4-Luc) och Gal4/VP16-taggade APP-C99 fusionsprotein (C99-GV). Dessutom genererade vi en annan HEK-derived stabil cellinje (NG) som konstitutivt uttrycker Gal4-Luc och Gal4/VP16-taggade NΔE (NΔE-GV). Använda dessa nya substrat-specifika γ-sekretas testmetoder, tillhandahålla vi nu en metod för att kvantifiera och skilja den katalytiska aktiviteten av γ-sekretas mot olika substrat (APP-C99 i CG celler), eller NΔE i NG celler. Dessutom utformades substrat-specifika γ-sekretas analyser bidra till hög-innehåll screening plattformar. Dessa nyligen genererade γ-sekretas testmetoder kunde bana väg för upptäckten av romanen γ-sekretas modulatorer som skulle kunna förbättra kognitiv funktion genom att undertrycka Aβ produktion utan framkalla oönskade Notch hämning för nästa generations behandling av AD.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>VictorLight luminescence plate reader</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>2030-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Class II, Type 2 Biological Safety Cabinet</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1300 Series A2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CL-387,785</td>
			<td>EMD Calbiochem</td>
			<td>233100-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPT</td>
			<td>Merck</td>
			<td>565770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12100046</td>
			<td>main compnent of growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>16000044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blasticidin</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A1113903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeocin</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>R25005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygromycin B</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10687010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytomer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>BR717805 Aldrich</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well microplate</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>156545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T7660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steady-Glo luciferase assay reagent</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidified CO2 incubator</td>
			<td>Revco</td>
			<td>Ultima II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-REx293 cell line</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R71007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wallac 1420 software version 3.0</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td>instrument control software of the luminescence microplate reader</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative measurement of &#947;-secretase-mediated amyloid precursor protein and notch cleavage in cell-based luciferase reporter assay platforms

Vi har utvecklat ett par cellbaserade reporter gen analyser att kvantitativt mäta γ-sekretas klyvning av olika substrat. Detta manuskript beskriver procedurer som kan användas för att övervaka γ-sekretas-medierad klyvning av antingen APP-C99 eller Notch, använder en Gal4 arrangören-driven firefly luciferas reporter systemet. Dessa analyser fastställdes genom stabilt samarbete transfecting HEK293 celler med Gal4-driven luciferas reporter gen och antingen Gal4/VP16-märkta C-terminal fragmentet av APP (APP-C99; CG celler), eller den Gal4/VP16-taggade Notch-ΔE (NΔE; NG celler). Använda dessa reporter analyser parallellt, vi har visat att en ErbB2-hämmare, CL-387,785, företrädesvis kan undertrycka γ-sekretas klyvning av APP-C99 i CG celler, men inte NΔE i NG celler. Differentiell Svaren utställda av CG och NG-cellerna, när de behandlas med CL-387,785, föreställer en rekommenderad kännetecken för γ-sekretas modulatorer, och dessa svar är i skarp kontrast till pan-hämning av γ-sekretas induceras av du. Våra studier ger direkta bevis att γ-sekretas aktiviteter mot olika substrat kan göras åtskillnad mellan i cellulära sammanhang. Dessa nya testmetoder kan därför vara användbara verktyg i läkemedelsutveckling för förbättrad AD terapier.

Hämning av ErbB2 av CL-387,785 kan differentially främja behandlingen av APP-C99 av Γ -sekretas utan att påverka Notch klyvning För att upprätta en cell-baserad analys som kan kvantitativt mäta proteolytisk klyvning av en viss γ-sekretas substrat, genererade vi HEK293-derived CG cell raden av stabil CO transfection av en tetracyklin-inducerbara C-obotligt Gal4/VP16-märkta APP-C99 och en Gal4 arrangören-driven firefly lucifera...

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Measurement of ÃŽÂ³-Secretase-mediated Amyloid Precursor Protein and Notch Cleavage in Cell-based Luciferase Reporter Assay Platforms at JoVE.com

Quantitative Measurement of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â³-Secretase-mediated Amyloid Precursor Protein and Notch Cleavage in Cell-based Luciferase Reporter Assay Platforms

Kvantitativ mätning av γ-sekretas-medierad Amyloid Precursor Protein och Notch klyvning i cellbaserade luciferas Reporter Assay plattformar

Vi har framgångsrikt genererade två substrat-specifika γ-sekretas analyser. Både cellbaserade analyser som presenteras här är utformade för att kvantifiera γ-sekretas enzymatiska aktiviteter via produktionen av firefly luciferas reportrar.

We have developed a pair of cell-based reporter gene assays to quantitatively measure &#947;-secretase cleavage of distinct substrates. This manuscript ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Quantitative Measurement of &#947;-Secretase-mediated Amyloid Precursor Protein and Notch Cleavage in Cell-based Luciferase Reporter Assay Platforms

Selection of Aptamers for Amyloid &beta;-Protein, the Causative Agent of Alzheimer&#39;s Disease

Selection of Aptamers for Amyloid ÃƒÅ½Ã‚Â²-Protein, the Causative Agent of Alzheimer's Disease

Val av aptamers för Amyloid β-protein, vilka smittämnen av Alzheimers sjukdom

Alzheimer's disease (AD) is a progressive, age-dependent, neurodegenerative disorder with an insidious course that renders its presymptomatic diagnosis ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell imaging av sensoriska celler orgel Precursor i intakt Drosophila Puppor

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

A Galvanotaxis Assay for Analysis of Neural Precursor Cell Migration Kinetics in an Externally Applied Direct Current Electric Field

En Galvanotaxis analys för analys av neurala Migration prekursorcell Kinetik i en extern Applied likström Electric Field

The discovery of neural stem and progenitor  cells (collectively termed neural precursor cells) (NPCs) in the adult  mammalian brain has led to a body of ...

High-throughput Analysis of Mammalian Olfactory Receptors: Measurement of Receptor Activation via Luciferase Activity

Hög kapacitet Analys av däggdjur luktreceptorer: Mätning av receptoraktivering via luciferasaktivitet

Odorants create unique and overlapping patterns of olfactory receptor activation, allowing a family of approximately 1,000 murine and 400 human receptors ...

Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

Detektion av<em&gt; In situ</em&gt; Protein-proteinkomplex på<em&gt; Drosophila</em&gt; Larv Neuromuskulära förbindelsen Använda Proximity Ligation Assay

Discs large (Dlg) is a conserved member of the membrane-associated guanylate kinase family, and serves as a major scaffolding protein at the larval ...

Stereotaxic Infusion of Oligomeric Amyloid-beta into the Mouse Hippocampus

Stereotaxic Infusion av oligomera amyloid-beta i musen Hippocampus

Alzheimer&#8217;s disease is a neurodegenerative disease affecting the aging population. A key neuropathological feature of the disease is the ...

Quantitative Measurement of Relative Retinoic Acid Levels in E8.5 Embryos and Neurosphere Cultures Using the F9 RARE-Lacz Cell-based Reporter Assay

Kvantitativ mätning av relativ retinsyra nivåer i E8.5 embryon och neurosfärkulturer med hjälp av F9 sällsynta LacZ Cell-baserad Reporter analys

Retinoic acid (RA) is an important developmental morphogen that coordinates anteroposterior and dorsoventral axis patterning, somitic differentiation, ...

Modeling Amyloid-&#946;42 Toxicity and Neurodegeneration in Adult Zebrafish Brain

Modeling Amyloid-ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²42 Toxicity and Neurodegeneration in Adult Zebrafish Brain

Modellering Amyloid-β42 toxicitet och Neurodegeneration i vuxna zebrafiskar hjärnan

Alzheimer's disease (AD) is a debilitating neurodegenerative disease in which accumulation of toxic amyloid-&#946;42 (A&#946;42) peptides leads to ...

Assay Development for High Content Quantification of Sod1 Mutant Protein Aggregate Formation in Living Cells

Assay utveckling för hög innehåll kvantifiering av Sod1 Mutant Protein sammanlagda bildandet i levande celler

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disease that can be caused by inherited mutations in the gene encoding copper-zinc ...

Quantitative Autoradiographic Method for Determination of Regional Rates of Cerebral Protein Synthesis In Vivo

Kvantitativ autoradiografisk metod för bestämning av regionala frekvenser av cerebral protein syntes in vivo

Protein synthesis is required for development and maintenance of neuronal function and is involved in adaptive changes in the nervous system. Moreover, it ...