Name: detection and quantification of plasmodium falciparum in aqueous red blood cells by attenuated total reflection infrared spectroscopy and multivariate data analysis
Uploaded: 2018-11-02T13:30:00
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Les auteurs a été financé par l’Australian Research Council (Future bourse FT120100926 à BRW), National Health and Medical Research Council of Australia, (programme de subventions et de bourse de recherche Senior à JGB ; Bourses de carrière précoce JSR ; Infrastructure de recherche des instituts de subvention de régime de soutien à l’Institut Burnet), et le soutien de l’Infrastructure opérationnelle du gouvernement Victorien État subvention à l’Institut Burnet. Nous remercions M. Finlay Shanks pour soutien instrumental.

Veuillez consulter approprié matériel fiches signalétiques (FS) et le solliciter une formation de niveau de biosécurité 2 (BSL-2). Toutes les étapes de culture doivent se faire dans un cabinet de BSL-2 à l’aide d’une technique aseptique, indiquant qu’il existe un risque d’exposition aux rayonnements UV nocifs de mesures de décontamination, blessures par piqûre d’aiguille et biologiques potentiels d’exposition et l’infection si la culture du parasite pénètre dans les blessures. En outre, le sang s...

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	<li>Hommel, M., Gilles, H., Collier, L., Balows, A., Sussman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+20.">Chapter 20.</a> Topley &amp; Wilson's Microbiology and Microbial Infections. Vol. 5 Parasitology. , 361 (1998).</li><li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> World Malaria Report 2016. , (2016).</li><li>Rogers, W., Murray, P., Baron, E., Pflaller, M., Tenover, F., Yolken, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+105.">Chapter 105.</a> Manual of Clinical Microbiology. , 1355 (1999).</li><li>White, N. 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Modèle PLS-R est une méthode multivariée encadrée qui trouve une relation linéaire, Y = bX + E, entre les variables prédictives X (ici, l’absorbance à chaque nombre d’onde) et une variable continue Y (ici, le niveau de la parasitémie). En bref, le modèle combine les variables x pour créer un nouvel ensemble de variables latentes (LVs) qui captent la variance sur X en corrélation avec Y et calcule un vecteur de régression (b) qui a multiplié par un nouveau résultats de spectre dans l’estimation de la v...

Le paludisme est parmi les maladies les plus dévastatrices de notre époque ; plus de la moitié de la population vit en péril dans les régions d’endémie et il pèse disproportionnellement faible1,2,3,4. Une grande partie de la question est les porteurs asymptomatiques et tôt les patients de stade qui agissent comme des réservoirs de moustiques vecteurs5, causant des pointes d’infection au cours de la saison humide et ce qui lui permet de persister dans les collectivités. Le paludisme est causé par des parasites Plasmodium cinq, la plus meurtrière dont est à P. falciparum , qui provoque la forme la plus sévère de la maladie2.
Actuellement, les techniques pour le diagnostic du paludisme sont loin d’être parfaites. La microscopie optique, la norme actuelle de l’or, peut seulement détecter 62-88 parasites/µL selon la méthode utilisée6. En outre, en raison de la forte intensité et hautes compétences requises, dans nombreuses régions microscopie échogrammes > 50 % des cas, en particulier ceux avec faible parasitémie niveaux2, qui sont directement attribuables au manque de ressources dans le domaine et les résultats en l’utilisation abusive de médicaments antipaludiques. Les 2 autres méthodes diagnostiques principales sont des Tests de Diagnostic rapide (TDR), qui utilisent des anticorps pour la détection et des essais de réaction en chaîne de la polymérase (PCR), qui discriminent et quantifier les parasites de l’ADN. Actuellement, les TDR sont seulement capables de détecter P. falciparum et P. vivax d’au moins 100 parasites/µL de sang résultant en des formes plus rares de la maladie étant non traitée. 7 , 8 en revanche, tests de PCR discriminer et quantifier les différentes espèces de Plasmodium à une sensibilité de 0,0004-5 parasites/µL de sang. Toutefois, elle nécessite des réactifs coûteux, des équipements et des compétences techniques et n’est donc pas approprié pour l’application sur le terrain.
Une technique très sensible, fiable et abordable est essentielle pour améliorer les temps de diagnostic et ainsi améliorer les résultats pour les patients et permettant l’élimination de la maladie. Atténué totale réflexion spectroscopie transformée de Fourier (IRTF) offre une solution à ce problème. Travaux antérieurs ont montré qu’il était possible de détecter et de quantifier à P. falciparum dans le méthanol fixé des frottis sanguins, atteindre les limites de détection de < 1 parasite/µL de sang (< 0,0002 % parasitémie)9, qui est comparable aux méthodes PCR. Des études récentes ont montré qu’il est possible de détecter et quantifier des parasites dans des échantillons aqueux et ainsi éliminer l’étape de fixation. Cependant, des facteurs tels que la vapeur d’eau, le bruit spectrale et traitement des données doivent être prises en considération pour des résultats optimaux,10.
Ce protocole vise à montrer aux nouveaux utilisateurs comment acquérir des spectres IRTF- et préparer un modèle de régression pour la détection de P. falciparum d’aqueux d’échantillons de globules rouges (RBC)10.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Donor blood</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Must be collected by a trained medical practitioner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stock blood</td>
			<td>Australian Red Cross`</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D7 Plasmodium falciparum</td>
			<td>The Burnet Institute</td>
			<td>-</td>
			<td>Laboratory strain wild type equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 media with L-hepes without Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R6504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumax (Gibco)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>E003000PJ</td>
			<td>Aliquot into 50 mL falcon tubes and store in freezer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Giemsa Stain</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>48900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorbitol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S1876</td>
			<td>Must be filtered before use in culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood collection tubes (Vacutainers)</td>
			<td>Becton, Dickonson and Company</td>
			<td>367671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion Oil</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>M3004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL culture dishes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25mL pipette tips</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>357515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10mL pipette tips</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>357530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S8902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes 50 mL</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T2318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated pipette controller</td>
			<td>Integra-biosciences</td>
			<td>155 015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Legend X1R Centrifuge</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>75004260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forma&#8482; 310 Direct Heat CO2 Incubators</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>310TS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse E-100 Binocular Microscope</td>
			<td>Nikon Instruments</td>
			<td>E100_2CE-MRTK-1</td>
			<td>When purchasing ensure that the 100x lens is an oil immersion lens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bruker Alpha Ft-IR Spectrometer with ATR Quick Snap Attachment</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>9308-3700</td>
			<td>Be sure to request &#34;Eco-ATR&#34; attachment when purchasing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab</td>
			<td>Mathworks Inc</td>
			<td></td>
			<td>Multivariate data analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Unscrambler X</td>
			<td>CAMO</td>
			<td></td>
			<td>Multivariate data analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLS-Toolbox</td>
			<td>Mathworks, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>GUI for Matlab</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection and quantification of plasmodium falciparum in aqueous red blood cells by attenuated total reflection infrared spectroscopy and multivariate data analysis

Nous démontrons une méthode de dosage et détection des parasites en solution aqueuse des globules rouges (hématies) en utilisant une simple paillasse atténuée totale réflexion Fourier Transform (IRTF) spectromètre infrarouge conjointement avec (analyse de données LCVA). 3 7 P. falciparum ont été cultivés à 10 % parasitémie anneau stade des parasites et utilisé pour doper les globules rouges fraîches donateur isolé afin de créer une dilution série entre 0 – 1 %. 10 µL de chaque échantillon ont été placés au centre de la fenêtre de diamant de RTA pour acquérir le spectre. Les exemples de données a été traitées afin d’améliorer le rapport signal sur bruit et à supprimer la contribution de l’eau, et alors la dérivée seconde a été appliquée pour résoudre des caractéristiques spectrales. Les données ont été ensuite analysées à l’aide de deux types de LCVA : première analyse de composantes principales (ACP) pour déterminer les valeurs aberrantes puis régression des moindres carrés partiels (PLS-R) pour construire le modèle de quantification.

Tracer des moindres carrés partiels (PLS-R) et son vecteur de régression associés, Figure 1 a et 1 b respectivement, montrent que le signal de parasites sont assez distincte de la SCFR qu’ils peuvent être utilisés pour former une régression linéaire modèle à utiliser pour la prédiction des parasites dans les ensembles de données futures.
Un modèle linéaire robuste PLS...

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Detection and Quantification of Plasmodium falciparum in Aqueous Red Blood Cells by Attenuated Total Reflection Infrared Spectroscopy and Multivariate Data Analysis

Détection et Quantification de Plasmodium falciparum dans aqueux globules rouges par atténuée totale réflexion spectroscopie infrarouge et analyse de données

Nous présentons ici un protocole pour la détection et la quantification de Plasmodium falciparum infectés aqueuse globules rouges à l’aide d’un spectromètre infrarouge de la réflexion totale atténuée et analyse de données multivariées.

We demonstrate a method of quantification and detection of parasites in aqueous red blood cells (RBCs) by using a simple benchtop Attenuated Total ...

L’objectif global de cette procédure est de construire un modèle de régression pour la prédiction de la parasitémie du paludisme à l’aide de la spectroscopie ATR-FTIR avec analyse multivariée des données. Cette méthode peut aider à accélérer les diagnostics au point de service qui peuvent aider à améliorer les résultats pour les patients à l’avenir. Le principal avantage de cette technique est que si le modèle peut prendre un certain temps à construire, il est très portable, convivial, très sensible et peu coûteux.Bien que cette méthode permette la quantification des parasites du paludisme, elle peut également être utilisée pour observer la réponse phénotypique aux changements environnementaux tels que les changements dans la composition des parasites dus aux agents antimicrobiens. L’idée est né des travaux que nous avons fait au Synchrotron australien sur les cellules infectées par le paludisme. C’était au niveau d’une seule cellule.À partir de là, nous avons décidé d’utiliser la spectroscopie ATR-FTIR pour développer le test diagnostique. Avant de commencer la procédure de synchronisation, la culture 30 millilitres de 3D7 souche Plasmodium falciparum parasites tels que décrits dans le protocole de texte. À l’aide d’une pipette automatisée, resuspendez la culture et transférez-la dans un tube conique de 50 millilitres.Centrifuger la culture à 300 à 400 fois g dans des conditions de laboratoire standard pendant cinq minutes. Retirez le surnatant en le dessinant avec une pipette automatisée sans déranger la pastille. Jetez les déchets dans une solution de 10% d’eau de Javel.Ajouter lentement 12 à 15 millilitres d’une solution sorbitol de 4% à la pastille et mélanger la culture en plafonnant et en inversant le tube jusqu’à ce que la culture soit homogène. Incuber la culture à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes. Après 15 minutes, centrifuger la culture pendant cinq minutes.Utilisez une pipette automatisée pour enlever le supernatant sans déranger la pastille. Ajouter 10 à 15 millilitres de 0,9% salin à la pastille et mélanger la solution en plafonnant et en inversant le tube jusqu’à ce que la culture soit homogène. Répétez la centrifugation et la solution saline laver deux fois de plus pour enlever tous les restes de sorbitol.Pour commencer cette procédure, centrifugez les globules rouges de stock, ou RBCs. Retirez le supernatant et lavez avec 0,9% salin un total de trois fois. Centrifuger les RBCs stock et la culture à 300 à 400 fois g pendant cinq minutes et jeter le supernatant de chaque tube.Étiquetez huit tubes de microcentrifugeuse comme indiqué. Ensuite, utilisez une pipette de 0,2 à 20 microlitres pour ajouter la quantité appropriée de culture à chaque tube. Ensuite, ajoutez la quantité appropriée de RBCs de stock à chaque tube pour obtenir la dilution souhaitée de parasitemia.Centrifugeuse le sang frais du donneur recueilli dans des tubes anticoagulants à 1200 fois g et les conditions de laboratoire standard pendant 10 minutes. Retirez le plasma en le dessinant avec une pipette et en le jetant dans une solution de 10% d’eau de Javel. Ajouter 900 microlitres de rbcs donneurs isolés dans chaque tube de microcentrifugeuse et bien mélanger en inversant 10 fois.Un simple spectromètre Attenuated Total Reflection Fourier Transform Infrared, ou ATR-FTIR spectromètre sera utilisé pour acquérir le spectre. Préparer et nettoyer le cristal à l’aide de lingettes sans peluche amorties avec de l’eau ultra-pure pour frotter doucement le cristal dans un mouvement circulaire. Ensuite, utilisez un autre lingette sans peluche pour bien sécher le cristal.Prenez une mesure d’arrière-plan de l’air en cliquant sur Mesure d’arrière-plan. Toutes les 20 minutes, nettoyez le cristal et répétez cette mesure. Ouvrez la vue en direct en cliquant sur Aperçu.Observez une ligne de base horizontale plate qui indique que le cristal est propre. Pipette 10 microlitres d’eau déionisée directement sur le milieu du cristal et cliquez sur Mesurer l’échantillon. Séchez le cristal à l’aide d’un lingette sans peluche et d’un léger mouvement circulaire.Pipette 10 microlitres d’échantillon sur le milieu du cristal et cliquez sur Mesurer l’échantillon. Nettoyez le cristal entre les échantillons. Dans cette démonstration, une analyse multivariable des données sera effectuée à l’aide de MATLAB.Pour commencer le traitement des données, entrez l’analyse dans la fenêtre de commande pour ouvrir l’interface utilisateur graphique. Cliquez à droite sur la boîte X pour trouver des données d’importation. Sélectionnez le type de fichier à analyser.Importez l’échantillon, l’eau et les spectres de base comme ensembles de données dans le lieu de travail en sélectionnant tous les spectres de chaque ensemble séparément, en cliquant sur Open et en donnant à chaque ensemble un nom court. Cliquez sur Nouvelle Variable dans la fenêtre de commande et donnez au vecteur le nom Parasitemia. Entrez la Parasitemia de chaque échantillon.Cliquez à droite sur la boîte X pour trouver des données de parcelle. Cliquez sur l’icône Plot Data pour tracer les données. Inspectez les spectres pour les effets de vapeur d’eau en cliquant sur Zoom et en zoomant sur 1 800 à 1 400 par centimètre, les plus clairement observés comme des sommets courts, tranchants et étroits le long des pentes des bandes Amide I et Amide II.En cas de vapeur d’eau extrême, ouvrez l’onglet Modifier les données de prétraitement et sélectionnez Lissage. Réduisez le bruit et/ou les fortes contributions de vapeur d’eau en lissant l’échantillon et les spectres d’eau. Après un traitement supplémentaire des données tel que décrit dans le protocole texte, ouvrez l’onglet Modifier les données et, dans les variables de colonne, sélectionnez 2980 à 2800 par centimètre et 1750 à 850 par centimètre en vous assurant que seules leurs cases sont cochées.Les données sont maintenant prêtes à être analyses. Pour effectuer l’analyse des composants principaux, ou PCA, cliquez sur Décomposition de l’analyse et sélectionnez PCA. Cliquez sur Construire le modèle.Observez la limite de confiance de 95%, l’anneau pointillé, sur l’intrigue des scores entre PC 1 et PC 2. Utilisez l’outil Sélectionnez Spectra pour marquer les spectres de l’échantillon avec des scores qui se produisent en dehors de la limite comme valeurs aberrantes potentielles. Pour effectuer la régression partielle des moins carrés, ou PLSR, cliquez sur Régression d’analyse et sélectionnez PLSR.Cliquez à droite sur le bloc Y et sélectionnez le modèle de génération parasitemia vectoriel. Analyser le modèle de régression et le vecteur de régression et identifier les bandes biologiques. Une parcelle partielle de régression des moins carrés de RBCs a grimpé entre zéro et un pour cent Parasitemia généré une valeur R-carré de 0,87 et une racine moyenne carrée erreur de validation croisée de 0,13%Parasitemia.Cela démontre la capacité du modèle à prédire la parasitémie dans chaque échantillon avec la parasitemia connue sur l’axe x et la parasitemia prévue sur l’axe Y. Le coefficient de régression associé décrit la contribution de chaque bande à la capacité prédictive du modèle. Plus la bande est intense, plus elle contribue au modèle et, par conséquent, à la façon dont le parasite modifie la composition chimique du sang.Les résultats montrent que le signal des parasites est suffisamment distinct des RBC pour qu’ils puissent être utilisés pour former un modèle de régression linéaire pour la prédiction des parasites dans les ensembles de données futurs. Une fois maîtrisée, cette technique peut prendre moins de trois minutes par échantillon si elle est effectuée correctement. Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler de nettoyer les cristaux ATR de tous les résidus.À la suite de cette procédure, d’autres espèces de paludisme telles que P vivax et P malariae peuvent être modélisées afin de répondre à de telles questions, comme la spectroscopie ATR-FTIR est-elle suffisamment sensible pour faire la distinction entre les espèces? Après son développement, cette technique a ouvert la voie à des chercheurs dans le domaine de la biospectroscopie pour explorer la détection et la quantification d’autres agents pathogènes transmissibles par le sang et même analyser dans le sang comme le glucose et l’urée. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la spectroscopie ATR-FTIR et l’analyse NVDA pour construire un modèle de régression.N’oubliez pas que le travail avec le sang des patients et les échantillons de paludisme peut être dangereux, et une formation et un confinement appropriés au niveau de biosécurité doivent toujours être effectués lorsque vous essayez cette procédure.

Research

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Chemistry

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