Name: detection and quantification of plasmodium falciparum in aqueous red blood cells by attenuated total reflection infrared spectroscopy and multivariate data analysis
Uploaded: 2018-11-02T13:30:00
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オーストラリアの研究議会によって著者に資金提供された (BRW に将来交わり FT120100926)、国立保健医療研究評議会オーストラリアの (プログラム助成金と国債; する上級研究員奨学金のキャリア初期 JSR;研究のインフラ機関バーネット研究所サポート方式の補助金)、ビクトリア州政府の運用インフラストラクチャ サポートのバーネット研究所に許可と。我々 は手段的扶養氏フィンレー シャンクスを認めます。

適切な製品安全性データ シート (MSDS) に相談し、適切なバイオ セーフティ レベル 2 (BSL-2) 訓練を求めてください。BSL 2 キャビネットの無菌技術を使用して、除染の手順、針棒の傷害、および潜在的な生物学的ばく露と感染から有害な紫外線放射への露出の危険がある場合の意味で養殖のすべての手順を行う必要があります寄生虫文化任意の傷害に入ります。さらに、血液銀行から株式の血が...

<ol>
	<li>Hommel, M., Gilles, H., Collier, L., Balows, A., Sussman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+20.">Chapter 20.</a> Topley &amp; Wilson's Microbiology and Microbial Infections. Vol. 5 Parasitology. , 361 (1998).</li><li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> World Malaria Report 2016. , (2016).</li><li>Rogers, W., Murray, P., Baron, E., Pflaller, M., Tenover, F., Yolken, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+105.">Chapter 105.</a> Manual of Clinical Microbiology. , 1355 (1999).</li><li>White, N. 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K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infrared+spectra+of+methanol,+ethanol,+and+rn-propanol.">Infrared spectra of methanol, ethanol, and rn-propanol.</a> J Res Natl Bur Stand. 48 (4), (1952).</li></ol>

PLS モデルは線形関係、Y チャイルド多変量法 = bX + E、予測変数 X の (ここでは、各波数で吸光度) および連続変数 Y (ここで寄生率レベル)。一言で言えば、モデル x の X が Y と相関の差異をキャプチャ潜在変数 (LVs) の新しいセットを作成する変数を結合し、回帰ベクトル (b) を計算する y 値の推定における新しいスペクトルの結果を乗算します。2 つの値からモデルの強さを取ることができる: ...

マラリアは私達の時間の最も破壊的な病気の中で、します。半分以上の人口の流行地における生活し、貧しい1,2,3,4の過度に負担。問題の大部分は無症候性キャリアと初期段階患者蚊ベクトル5のための貯蔵所として機能するぬれた季節の間に感染症のスパイクを引き起こすとのコミュニティを保持することができます。マラリアは、最も致命的なうちはマラリア病2の最も深刻な形を引き起こす 5 つの原虫が原因です。
現在、マラリアの診断技術は完璧未満です。光学顕微鏡法の現在のゴールド スタンダードのみ 62 88 寄生虫/μ L 使用方法6によってを検出できます。集約と高スキルが必要、多くの地域の顕微鏡検査の誤診のためさらに、> 50% 例, 低 parasitaemia との特にそれらレベル2地域で資源との結果の欠如に直接帰することができます。抗マラリア薬の誤用。主な診断の他の 2 つの方法は、検出、およびポリメラーゼの連鎖反応 (PCR) アッセイの識別し、DNA から寄生虫を定量化するための抗体を利用した迅速診断テスト (RDTs) です。現在、RDTs は放置されている疾患のより稀な形態の結果として血の少なくとも 100 の寄生虫/μ L のp. の vivax マラリアを検出することができるのみ。7,8対照的に、PCR の試金の識別し、定量化 0.0004 5 の感度でマラリア原虫の異なる種の血液の寄生虫/μ L。しかし、それは高価な試薬、機器、技術的なスキルを必要としては現場への適用のために適していなかった。
機密性の高い、信頼性と手頃な価格の技術は診断時間従って患者の転帰の改善と病気の除去を可能を改善するために不可欠です。減衰全反射フーリエ変換 (ATR FTIR) 分光法では、この問題の潜在的なソリューションを提供しています。前作は検出し、メタノールの検出限界を達成する血膜を固定でマラリアを定量化することが可能だったことを示している < 1 寄生虫/μ L の血液 (< 0.0002% 寄生)9PCR 法と対等であります。最近の研究では、検出および水溶液試料中の寄生虫を定量化し、従って固定ステップを排除することが可能であるを示しています。ただし、水蒸気、スペクトルのノイズやデータ処理などの要因は、最適な結果10の考慮する必要があります。
このプロトコルは、ATR FTIR スペクトルを取得および水溶液赤い血球 (RBC) サンプル10からマラリアの検出のための回帰モデルを準備する方法を示しています新しいユーザーを目指しています。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Donor blood</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Must be collected by a trained medical practitioner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stock blood</td>
			<td>Australian Red Cross`</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D7 Plasmodium falciparum</td>
			<td>The Burnet Institute</td>
			<td>-</td>
			<td>Laboratory strain wild type equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 media with L-hepes without Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R6504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumax (Gibco)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>E003000PJ</td>
			<td>Aliquot into 50 mL falcon tubes and store in freezer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Giemsa Stain</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>48900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorbitol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S1876</td>
			<td>Must be filtered before use in culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood collection tubes (Vacutainers)</td>
			<td>Becton, Dickonson and Company</td>
			<td>367671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion Oil</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>M3004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL culture dishes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25mL pipette tips</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>357515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10mL pipette tips</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>357530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S8902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes 50 mL</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T2318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated pipette controller</td>
			<td>Integra-biosciences</td>
			<td>155 015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Legend X1R Centrifuge</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>75004260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forma&#8482; 310 Direct Heat CO2 Incubators</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>310TS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse E-100 Binocular Microscope</td>
			<td>Nikon Instruments</td>
			<td>E100_2CE-MRTK-1</td>
			<td>When purchasing ensure that the 100x lens is an oil immersion lens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bruker Alpha Ft-IR Spectrometer with ATR Quick Snap Attachment</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>9308-3700</td>
			<td>Be sure to request &#34;Eco-ATR&#34; attachment when purchasing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab</td>
			<td>Mathworks Inc</td>
			<td></td>
			<td>Multivariate data analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Unscrambler X</td>
			<td>CAMO</td>
			<td></td>
			<td>Multivariate data analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLS-Toolbox</td>
			<td>Mathworks, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>GUI for Matlab</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection and quantification of plasmodium falciparum in aqueous red blood cells by attenuated total reflection infrared spectroscopy and multivariate data analysis

多変量データ解析 (と共に簡単な卓上型減衰全反射フーリエ変換赤外 (ATR FTIR) 分光計を使用して定量法と水溶液中の赤い血球 (赤血球) の寄生虫の検出を示すMVDA)。3 7マラリア10% 寄生リング ステージ寄生虫に培養、希釈に 0-1 の間にシリーズを作成する分離された新鮮なドナーの赤血球をスパイクに使用 %。10 μ L 各サンプルのスペクトルを取得する ATR ダイヤモンド ウィンドウの中央に置かれました。信号対雑音比を改善するために、水の寄与を削除するサンプル データが扱われ、二次導関数はスペクトルの特徴を解決に適用されます。データは、MVDA の 2 種類を使用して行った: 最初主成分分析 (PCA) とを決定する任意の飛び地、偏最小 2乗回帰 (PLS-R) 計量化モデルを構築します。

部分的な最小二乗 (PLS-R) プロットし、その関連付けられた回帰ベクトル、図 1aと1b , 表示寄生虫からの信号とは異なること十分な線形回帰モデルを使用するフォームを使用することができます赤血球、将来のデータ セットで寄生虫の予測。
R 二乗値 0.87 の堅牢な線形の PLS-R モデルが生成...

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Detection and Quantification of Plasmodium falciparum in Aqueous Red Blood Cells by Attenuated Total Reflection Infrared Spectroscopy and Multivariate Data Analysis

熱帯熱マラリア原虫減衰全反射赤外分光法と多変量データ解析による水溶液赤い血球での検出と定量

ここでは、検出及び減衰全反射赤外分光光度計と多変量解析を使用して感染した水溶液赤い血液細胞で熱帯熱マラリア原虫の定量化のプロトコルを提案する.

We demonstrate a method of quantification and detection of parasites in aqueous red blood cells (RBCs) by using a simple benchtop Attenuated Total ...

この手順の全体的な目標は、多変量データ分析を用いたATR-FTIR分光法を用いたマラリア原虫血症予測の回帰モデルを構築することである。この方法は、将来の患者の転帰を改善するのに役立つポイントオブケア診断を促進するのに役立ちます。この手法の主な利点は、モデルの構築に時間がかかる場合がありますが、ポータブルで、ユーザーフレンドリーで、高感度で低コストである点です。この方法はマラリア原虫の定量を可能にするが、抗菌剤による寄生虫組成の変化などの環境変化に対する表現性応答を観察するためにも使用できる。このアイデアは、マラリアに感染した細胞に関するオーストラリアのシンクロトロンで行った作業から開発されました。これは単一細胞レベルでした。そこから、ATR-FTIR分光法を用いて、実際に診断テストを開発することにしました。同期手順を開始する前に、テキストプロトコルに記載されているように3D7株熱帯熱マラリア原虫の30ミリリットルの培養。自動化されたピペットを使用して、培養を再中断し、50ミリリットルの円錐管に移します。標準的な実験室条件下で300〜400倍gの培養物を5分間遠心する。ペレットを邪魔することなく、自動ピペットで上澄みして上清を取り除く。廃棄物培地を10%漂白剤溶液に廃棄します。4%ソルビトール溶液の12〜15ミリリットルをペレットにゆっくりと加え、培養物が均一になるまでチューブをキャッピングして反転させて培養を混合する。37°Cで15分間培養します。15分後、培養物を5分間遠心分離します。ペレットを邪魔することなく上清を除去するために、自動化されたピペットを使用してください。ペレットに0.9%の生理食塩水の10〜15ミリリットルを加え、培養物が均一になるまでチューブをキャッピングして反転させて溶液を混合します。遠心分離と生理液を2回洗浄してソルビトールの残骸をすべて除去します。この手順を開始するには、ストック赤血球、またはRBCsを遠心分離します。ストックRBCと培養物を300~400倍gで5分間遠心し、各チューブから上清を捨てます。示されているとおりに8本のマイクロ遠心管にラベルを付けます。その後、0.2~20マイクロリットルのピペットを使用して、各チューブに適切な量の培養液を加えます。次に、各チューブに適量のストックRBCを加え、所望の寄生虫希釈液を得る。遠心分離剤は、1,200グラムの抗凝固管で採取された新鮮なドナー血液を10分間標準の検査条件で行う。ピペットでプラズマを引き上げ、10%漂白剤溶液に捨ててプラズマを取り除きます。各マイクロ遠心分離管に900マイクロリットルの単離ドナーRBCを加え、10回反転して十分に混ぜます。シンプルなベンチトップの減衰総反射フーリエ変換赤外線、またはATR-FTIR分光計は、スペクトルを取得するために使用されます。超純水で湿らせた糸くず拭き物を使用してクリスタルを準備し、きれいにして、クリスタルを円の動きにそっとこすります。その後、別の糸くずのないワイプを使用して、クリスタルを完全に乾燥させます。[バックグラウンド測定]をクリックして、空気の背景測定を行います。20分ごとに、結晶をきれいにし、この測定を繰り返します。[プレビュー] をクリックしてライブ ビューを開きます。結晶がきれいであることを示す平らな水平ベースラインを観察します。ピペット10マイクロリットルの脱イオン水を結晶の真ん中に直接入れ、[サンプルを測定]をクリックします。糸くず拭きと穏やかな円運動を使用して結晶を乾燥させます。結晶の中央に10マイクロリットルのサンプルをピペットし、サンプルを測定をクリックします。サンプル間の結晶をきれいにします。このデモでは、MATLABを使用して多変量データ解析を行います。データ処理を開始するには、コマンド ウィンドウに解析を入力して、グラフィック ユーザー インターフェイスを開きます。[X] ボックスを右クリックして、[データのインポート] を見つけます。解析するファイルのタイプを選択します。サンプル、水、ベースラインスペクトルをデータセットとして作業環境にインポートするには、各セットのすべてのスペクトルを個別に選択し、[開く]をクリックして、各セットに短い名前を付けます。コマンド ウィンドウで [新規変数] をクリックし、ベクターに [パラシテミア] という名前を付けます。各サンプルの寄生虫症を入力します。[X]ボックスを右クリックして[印刷データ]を見つけます。[データのプロット]アイコンをクリックして、データをプロットします。ズームをクリックし、1、800〜1、400センチメートルでズームインして水蒸気効果のスペクトルを検査し、最も明確にアミドIとアミドIIバンドの斜面に沿って短く、鋭く、狭いピークとして観察されます。極端な水蒸気の場合は、[前処理データを編集]タブを開き、[スムージング]を選択します。サンプルと水スペクトルを平滑化することで、ノイズや強い水蒸気の寄与を低減します。テキスト プロトコルで説明したデータ処理の後、[データの編集] タブを開き、列変数で、ボックスにのみチェックを入れて 2980 ~ 2800 センチメートル、1750 ~ 850 センチメートルを選択します。これで、データは分析の準備が整いました。主成分分析(PCA)を実行するには、「分析分解」をクリックして「PCA」を選択します。[モデルの構築] をクリックします。PC 1 と PC 2 の間のスコア プロット上の 95% 信頼限界、破線リングを観察します。[スペクトル選択]ツールを使用して、制限外れ値として範囲外に出現するスコアでサンプルスペクトルをマークします。部分最小二乗回帰(PLSR)を実行するには、[分析回帰]をクリックして[PLSR]を選択します。Y ブロックを右クリックし、ベクトル[パラシテミア構築モデル]を選択します。回帰モデルと回帰ベクトルを分析し、生物学的バンドを特定します。0から1%の間でスパイクされたRBCの部分的な最小二乗回帰プロットは、R-2乗値0.87と0.13%パラシデミアの二乗交差検証誤差を生成した。これは、x軸上の既知の寄生虫症とy軸上の予測寄生虫血症を有する各サンプルのパラシテミアを予測するモデルの能力を示す。関連する回帰係数は、モデルの予測能力に対する各バンドの寄与を表します。バンドが強ければ強いほど、より多くのバンドがモデルに寄与し、したがって、寄生虫が血液の化学組成をどのように変化させるか。結果は、寄生虫からのシグナルがRBCと十分に区別され、将来のデータセットにおける寄生虫の予測のための線形回帰モデルを形成するために使用できることを示している。この方法は、一度マスター化すると、適切に実行すれば、サンプルあたり3分未満で済みます。この手順を試みている間、すべての残渣のATR結晶をきれいにすることを忘れないでください。この手順に従って、P vivaxやPマラリアなどの他のマラリア種は、このような質問に答えるためにモデル化することができ、ATR-FTIR分光法は種を区別するのに十分に敏感ですか?その開発後、この技術は、バイオスペクトロスコピーの分野の研究者が他の血液媒介病原体の検出と定量を探求し、さらにはグルコースや尿素などの血液中で分析する道を開いた。このビデオを見た後、回帰モデルを構築するためにATR-FTIR分光法とNVDA分析をよく理解する必要があります。患者の血液やマラリアサンプルを使用することは危険であり、この手順を試みるときには常に適切なバイオセーフティレベルのトレーニングと封じ込めが行われるべきであることを忘れないでください。

Research

JoVE Journal

Chemistry

Detection and Quantification of Plasmodium falciparum in Aqueous Red Blood Cells by Attenuated Total Reflection Infrared Spectroscopy and Multivariate Data Analysis

In Situ SIMS and IR Spectroscopy of Well-defined Surfaces Prepared by Soft Landing of Mass-selected Ions

In Situ SIMS and IR Spectroscopy of Well-defined Surfaces Prepared by Soft Landing of Mass-selected Ions

その場 SIMSおよび質量選択されたイオンのソフトランディングで調製し明確に定義された表面の赤外分光法における

Soft landing of mass-selected ions onto surfaces is a powerful approach for the highly-controlled preparation of materials that are inaccessible using ...

Radiolabeling and Quantification of Cellular Levels of Phosphoinositides by High Performance Liquid Chromatography-coupled Flow Scintillation

高速液体クロマトグラフィー結合フローシンチレーションにより放射性標識およびホスホイノシチドの細胞レベルの定量化

Phosphoinositides (PtdInsPs) are essential signaling lipids responsible for recruiting specific effectors and conferring organelles with molecular ...

Construction of Models for Nondestructive Prediction of Ingredient Contents in Blueberries by Near-infrared Spectroscopy Based on HPLC Measurements

HPLC測定に基づいて近赤外分光法によるブルーベリーにおける成分含量の非破壊予測のためのモデルの構築

Nondestructive prediction of ingredient contents of farm products is useful to ship and sell the products with guaranteed qualities. Here, near-infrared ...

In Situ Detection and Single Cell Quantification of Metal Oxide Nanoparticles Using Nuclear Microprobe Analysis

In Situ Detection and Single Cell Quantification of Metal Oxide Nanoparticles Using Nuclear Microprobe Analysis

その場で検出および核マイクロ プローブ分析法を用いた金属酸化物ナノ粒子の単一細胞定量

Micro-analytical techniques based on chemical element imaging enable the localization and quantification of chemical composition at the cellular level. ...

Electrochemical Impedance Spectroscopy as a Tool for Electrochemical Rate Constant Estimation

電気化学インピー ダンス分光電気化学定数推定法のためのツールとして

Electrochemical impedance spectroscopy (EIS) was used for advanced characterization of organic electroactive compounds along with cyclic voltammetry (CV). ...

DNA-magnetic Particle Binding Analysis by Dynamic and Electrophoretic Light Scattering

バインドの動的・電気泳動光散乱による解析 DNA 磁性粒子

Isolation of DNA using magnetic particles is a field of high importance in biotechnology and molecular biology research. This protocol describes the ...

Total Internal Reflection Absorption Spectroscopy (TIRAS) for the Detection of Solvated Electrons at a Plasma-liquid Interface

Total Internal Reflection Absorption Spectroscopy TIRAS for the Detection of Solvated Electrons at a Plasma-liquid Interface

プラズマ ・液体界面の溶媒和電子を検出するための全内部反射吸収分光法 (TIRAS)

The total internal reflection absorption spectroscopy (TIRAS) method presented in this article uses an inexpensive diode laser to detect solvated ...

Elemental-sensitive Detection of the Chemistry in Batteries through Soft X-ray Absorption Spectroscopy and Resonant Inelastic X-ray Scattering

軟 x 線吸収分光と共鳴非弾性 x 線散乱による電池の化学元素高感度検出

Energy storage has become more and more a limiting factor of today's sustainable energy applications, including electric vehicles and green electric grid ...

Characterizing Lewis Pairs Using Titration Coupled with In Situ Infrared Spectroscopy

In Situ赤外線分光法と組み合わせた滴定を用いたルイスペアの特徴付け

Lewis acid-activation of carbonyl-containing substrates is a fundamental basis for facilitating transformations in organic chemistry. Historically, ...

Covalent Attachment of Single Molecules for AFM-based Force Spectroscopy

AFMベースの力分光法のための単一分子の共有結合

Atomic force microscopy (AFM)-based single molecule force spectroscopy is an ideal tool for investigating the interactions between a single polymer and ...