Name: detection and quantification of plasmodium falciparum in aqueous red blood cells by attenuated total reflection infrared spectroscopy and multivariate data analysis
Uploaded: 2018-11-02T13:30:00
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Financiación para los autores fue proporcionada por el Consejo de investigación australiano (futuro beca FT120100926 a BRW), nacional de salud y Consejo de investigación médica de Australia (programa beca y beca de investigación Senior a JGB; Temprana carrera becas JSR; Infraestructura para la investigación institutos de apoyo plan beca para el Instituto de Burnet), y la infraestructura operacional del gobierno victoriano estado beca para el Instituto de Burnet. Reconocemos el Sr. Finlay Shanks para apoyo instrumental.

Por favor consulte apropiado Material hojas de datos de seguridad (MSDS) y buscan una formación de nivel de bioseguridad 2 (BSL-2). Todos los pasos de cultivo deben realizarse en un gabinete BSL-2 utilizando una técnica aséptica, es decir hay un riesgo de exposición a la radiación UV perjudicial de descontaminación, produzcan lesiones accidentales con agujas y posible exposición biológica y la infección si la cultura del parásito entra en cualquier lesión. Además, sangre stock de bancos de sangre sólo defend...

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	<li>Hommel, M., Gilles, H., Collier, L., Balows, A., Sussman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+20.">Chapter 20.</a> Topley &amp; Wilson's Microbiology and Microbial Infections. Vol. 5 Parasitology. , 361 (1998).</li><li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> World Malaria Report 2016. , (2016).</li><li>Rogers, W., Murray, P., Baron, E., Pflaller, M., Tenover, F., Yolken, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+105.">Chapter 105.</a> Manual of Clinical Microbiology. , 1355 (1999).</li><li>White, N. 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J., Engleitner, T., Lell, B., Mordm&#252;ller, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limit+of+blank+and+limit+of+detection+of+Plasmodium+falciparum+thick+blood+smear+microscopy+in+a+routine+setting+in+Central+Africa.">Limit of blank and limit of detection of Plasmodium falciparum thick blood smear microscopy in a routine setting in Central Africa.</a> Malar J. 13 (1), 234-241 (2014).</li><li>World Health Organisation. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Malaria Rapid Diagnostic Test Performance: results of WHO product testing of malaria RDTs: round 6 (2014-2015). , (2014).</li><li>Khoshmanesh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+quantification+of+early-stage+malaria+parasites+in+laboratory+infected+erythrocytes+by+attenuated+total+reflectance+infrared+spectroscopy+and+multivariate+analysis.">Detection and quantification of early-stage malaria parasites in laboratory infected erythrocytes by attenuated total reflectance infrared spectroscopy and multivariate analysis.</a> Anal Chem. 86, 4379-4386 (2014).</li><li>Martin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+common+anticoagulants+in+detection+and+quantification+of+malaria+parasitemia+in+human+red+blood+cells+by+ATR-FTIR+spectroscopy.">The effect of common anticoagulants in detection and quantification of malaria parasitemia in human red blood cells by ATR-FTIR spectroscopy.</a> Anal. 142 (8), 1192-1199 (2017).</li><li>Fabian, H., M&#228;ntele, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of Vibrational Spectroscopy. , (2006).</li><li>Whelan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+the+reversible+B+to+A-like+transition+of+DNA+in+eukaryotic+cells+using+Fourier+transform+infrared+spectroscoptMonitoring+the+reversible+B+to+A-like+transition+of+DNA+in+eukaryotic+cells+using+Fourier+transform+infrared+spectroscopy.">Monitoring the reversible B to A-like transition of DNA in eukaryotic cells using Fourier transform infrared spectroscoptMonitoring the reversible B to A-like transition of DNA in eukaryotic cells using Fourier transform infrared spectroscopy.</a> Nucleic Acid Res. 39 (13), 5439-5448 (2011).</li><li>Wood, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+hydration+and+DNA+conformation+in+interpreting+infrared+spectra+of+cells+and+tissues.">The importance of hydration and DNA conformation in interpreting infrared spectra of cells and tissues.</a> Chem Soc Rev. 45, 1980-1998 (1980).</li><li>Plyler, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infrared+spectra+of+methanol,+ethanol,+and+rn-propanol.">Infrared spectra of methanol, ethanol, and rn-propanol.</a> J Res Natl Bur Stand. 48 (4), (1952).</li></ol>

Modelo PLS-R es un método multivariante supervisado que encuentra una relación lineal, Y = bX + E, entre las variables predictoras X (aquí, la absorbancia en cada número) y una variable continua Y (aquí, el nivel de parasitemia). En Resumen, el modelo combina las variables en X para crear un nuevo conjunto de variables latentes (LVs) que capturan la varianza en X correlacionada con Y y calcula un vector de regresión (b) que multiplicados por los resultados de un nuevo espectro en la estimación del valor y. La fuer...

La malaria está entre las enfermedades más devastadoras de nuestro tiempo; más de la mitad de la población vive en situación de riesgo en regiones endémicas y afecta desproporcionadamente los pobres1,2,3,4. Una gran parte del problema es la portadores asintomáticos y pacientes etapa temprana que actúan como reservorios de mosquitos vectores5, provocando picos de infección durante las temporadas húmedas y permitiendo que persisten en las comunidades. La malaria es causada por cinco parásitos Plasmodium , el más mortal de la que es p. falciparum , que causa la forma más severa de la enfermedad2.
Actualmente, las técnicas para el diagnóstico de la malaria son menos que perfecto. Microscopio óptico, el estándar de oro actual, sólo puede detectar 62-88 parásitos/μl dependiendo del método utilizado6. Además, debido a la intensidad y alta habilidad requerida, en muchas regiones la microscopia diagnostica > 50% de los casos, especialmente aquellos con baja parasitemia2, que puede ser directamente atribuido a la falta de recursos en el área y los resultados en los niveles el mal uso de medicamentos contra la malaria. Los 2 principales métodos de diagnóstico son pruebas de diagnóstico rápido (PDR), que utilizan anticuerpos para la detección y análisis de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), que discriminan y cuantificación de parásitos de ADN. En la actualidad, PDR sólo es capaces de detectar por p. falciparum y p. vivax de al menos 100 parásitos/μl de sangre dando como resultado formas más raras de la enfermedad que sin tratamiento. 7 , 8 por el contrario, ensayos PCR discriminan y cuantificar diferentes especies de Plasmodium en una sensibilidad de 5 0.0004 parásitos/μl de sangre. Sin embargo, se requiere de costosos reactivos, equipos y habilidad técnica y así no es conveniente para el uso del campo.
Una técnica altamente sensible, fiable y asequible es esencial para mejorar el diagnóstico y así mejorar los resultados del paciente y posibilitando la eliminación de la enfermedad. Espectroscopia de transformación (ATR-FTIR) de Fourier reflexión Total atenuada ofrece una posible solución a este problema. Trabajo previo ha demostrado que es posible detectar y cuantificar por p. falciparum en metanol fijada películas de sangre alcanzar los límites de detección de < 1 parásito/μl de sangre (< 0.0002% de parasitemia)9, que es comparable a los métodos de PCR. Estudios recientes han demostrado que es posible detectar y cuantificar parásitos en las muestras acuosas y así eliminar el paso de fijación. Sin embargo, factores tales como el vapor de agua, de ruido espectral y tratamiento de los datos deben tomarse en cuenta para un resultado óptimo10.
Este protocolo tiene como objetivo mostrar a los nuevos usuarios cómo adquirir espectros ATR-FTIR y preparar un modelo de regresión para la detección de p. falciparum de acuoso de las muestras de células de sangre rojas (RBC)10.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Donor blood</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Must be collected by a trained medical practitioner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stock blood</td>
			<td>Australian Red Cross`</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D7 Plasmodium falciparum</td>
			<td>The Burnet Institute</td>
			<td>-</td>
			<td>Laboratory strain wild type equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 media with L-hepes without Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R6504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumax (Gibco)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>E003000PJ</td>
			<td>Aliquot into 50 mL falcon tubes and store in freezer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Giemsa Stain</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>48900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorbitol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S1876</td>
			<td>Must be filtered before use in culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood collection tubes (Vacutainers)</td>
			<td>Becton, Dickonson and Company</td>
			<td>367671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion Oil</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>M3004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL culture dishes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25mL pipette tips</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>357515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10mL pipette tips</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>357530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S8902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes 50 mL</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T2318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated pipette controller</td>
			<td>Integra-biosciences</td>
			<td>155 015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Legend X1R Centrifuge</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>75004260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forma&#8482; 310 Direct Heat CO2 Incubators</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>310TS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse E-100 Binocular Microscope</td>
			<td>Nikon Instruments</td>
			<td>E100_2CE-MRTK-1</td>
			<td>When purchasing ensure that the 100x lens is an oil immersion lens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bruker Alpha Ft-IR Spectrometer with ATR Quick Snap Attachment</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>9308-3700</td>
			<td>Be sure to request &#34;Eco-ATR&#34; attachment when purchasing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab</td>
			<td>Mathworks Inc</td>
			<td></td>
			<td>Multivariate data analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Unscrambler X</td>
			<td>CAMO</td>
			<td></td>
			<td>Multivariate data analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLS-Toolbox</td>
			<td>Mathworks, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>GUI for Matlab</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection and quantification of plasmodium falciparum in aqueous red blood cells by attenuated total reflection infrared spectroscopy and multivariate data analysis

Demostrar un método de cuantificación y detección de parásitos en acuoso de glóbulos rojos (gr) mediante un simple Banco atenuada Total reflexión Fourier transforman (ATR-FTIR) Espectrómetro de infrarrojos junto con análisis de datos multivariantes ( MVDA). 3 7 p. falciparum fueron cultivados a los parásitos de etapa 10% parasitemia anillo y utilizado para glóbulos rojos del donante fresco aislado para crear una dilución en serie entre 0 – 1%. 10 μl de cada muestra se colocaron en el centro de la ventana de diamante ATR para adquirir el espectro. Los datos de la muestra fue tratados para mejorar la relación señal a ruido y eliminar el aporte de agua, y luego se aplicó la segunda derivada para resolver características espectrales. Luego se analizaron los datos utilizando dos tipos de MVDA: Análisis de componentes principales el primer (ACP) para determinar cualquier afloramiento y entonces regresión de mínimos cuadrados parciales (PLS-R) para construir el modelo de cuantificación.

Trama de cuadrados mínimos parciales (PLS-R) y su vector de regresión asociado, Figura 1a y 1b respectivamente, muestran que la señal de los parásitos son bastante diferentes de los hematíes que pueden ser utilizados para formar una regresión lineal del modelo a utilizar para la predicción de parásitos en futuros conjuntos de datos.
Se generó un modelo de PLS-R robusto, lin...

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Detection and Quantification of Plasmodium falciparum in Aqueous Red Blood Cells by Attenuated Total Reflection Infrared Spectroscopy and Multivariate Data Analysis

Detección y cuantificación de Plasmodium falciparum en acuosa glóbulos rojos por espectroscopia infrarroja de atenuada Total reflexión y análisis de datos multivariantes

Aquí, presentamos un protocolo para la detección y cuantificación de Plasmodium falciparum en acuosas rojo sangre células infectadas usando un espectrómetro de infrarrojos reflexión total atenuada y análisis de datos multivariantes.

We demonstrate a method of quantification and detection of parasites in aqueous red blood cells (RBCs) by using a simple benchtop Attenuated Total ...

El objetivo general de este procedimiento es construir un modelo de regresión para la predicción de la parasitemia de malaria utilizando espectroscopia ATR-FTIR con análisis de datos multivariados. Este método puede ayudar a acelerar los diagnósticos en el punto de atención que pueden ayudar a mejorar los resultados de los pacientes en el futuro. La principal ventaja de esta técnica es que, aunque el modelo puede tardar algún tiempo en construirse, es altamente portátil, fácil de usar, altamente sensible y de bajo costo.Aunque este método permite la cuantificación de parásitos de la malaria, también se puede utilizar para observar la respuesta fenotípica a los cambios ambientales, como los cambios en la composición del parásito debido a los agentes antimicrobianos. La idea se desarrolló a partir del trabajo que hicimos en el Sincrotrón Australiano sobre las células infectadas por el paludismo. Esto fue a nivel de una sola célula.A partir de ahí, decidimos utilizar la espectroscopia ATR-FTIR para desarrollar realmente la prueba de diagnóstico. Antes de iniciar el procedimiento de sincronización, cultivo 30 mililitros de parásitos Plasmodium falciparum de tensión 3D7 como se describe en el protocolo de texto. Usando una pipeta automatizada, resuspender el cultivo y transferirlo a un tubo cónico de 50 mililitros.Centrifugar el cultivo a 300 a 400 veces g en condiciones de laboratorio estándar durante cinco minutos. Retire el sobrenadante dibujándolo con una pipeta automatizada sin alterar el pellet. Deseche el medio de desecho en una solución de lejía al 10%.Añadir lentamente de 12 a 15 mililitros de una solución de 4% de sorbitol al pellet y mezclar el cultivo tapando e invirtiendo el tubo hasta que el cultivo sea homogéneo. Incubar el cultivo a 37 grados centígrados durante 15 minutos. Después de 15 minutos, centrifugar la cultura durante cinco minutos.Utilice una pipeta automatizada para quitar el sobrenadante sin alterar el pellet. Añadir de 10 a 15 mililitros de 0,9% de solución salina al pellet y mezclar la solución tapando e invirtiendo el tubo hasta que el cultivo sea homogéneo. Repita la centrifugación y la solución salina lave dos veces más para eliminar todos los restos de sorbitol.Para comenzar este procedimiento, centrifugar los glóbulos rojos de stock, o RBCs. Retire el sobrenadante y lave con 0.9%saline un total de tres veces. Centrifugar los glóbulos rojos y el cultivo a 300 a 400 veces g durante cinco minutos y desechar el sobrenadante de cada tubo.Etiquetar ocho tubos de microcentrífuga como se indica. A continuación, utilice una pipeta de 0,2 a 20 microlitrotro para agregar la cantidad adecuada de cultivo a cada tubo. A continuación, añada la cantidad adecuada de glóbulos rojos a cada tubo para obtener la dilución de parasitemia deseada.Centrifugar la sangre fresca del donante recogida en tubos anticoagulantes a 1.200 veces g y condiciones de laboratorio estándar durante 10 minutos. Retire el plasma dibujándolo con una pipeta y desechándolo en una solución de lejía al 10%. Agregue 900 microlitros de glóbulos rojos aislados del donante en cada tubo de microcentrífuga y mezcle bien invirtiendo 10 veces.Se utilizará un simple espectrómetro de transformación total de reflexión total de cuatro transformación de sobremesa Fourier o espectrómetro ATR-FTIR para adquirir el espectro. Preparar y limpiar el cristal mediante el uso de toallitas sin pelusas humedecidas con agua ultrapura para frotar suavemente el cristal en un movimiento circular. Luego, usa otra toallita sin pelusas para secar bien el cristal.Tome una medida de fondo del aire haciendo clic en Medición de fondo. Cada 20 minutos, limpie el cristal y repita esta medición. Abra la vista en vivo haciendo clic en Vista previa.Observe una línea base plana y horizontal que indique que el cristal está limpio. Pipetear 10 microlitros de agua desionizada directamente sobre el centro del cristal y haga clic en Medir muestra. Seque el cristal con una toallita sin pelusas y un suave movimiento circular.Pipetear 10 microlitros de muestra en el centro del cristal y haga clic en Medir muestra. Limpie el cristal entre las muestras. En esta demostración, el análisis de datos multivariante se realizará utilizando MATLAB.Para iniciar el tratamiento de datos, introduzca el análisis en la ventana de comandos para abrir la interfaz gráfica de usuario. Haga clic con el botón derecho en el cuadro X para buscar Importar datos. Seleccione el tipo de archivo para el análisis.Importe los espectros de muestra, agua y línea base como conjuntos de datos en el lugar de trabajo seleccionando todos los espectros de cada conjunto por separado, haciendo clic en Abrir y dando a cada conjunto un nombre corto. Haga clic en Nueva variable en la ventana de comandos y asigne al vector el nombre Parasitemia. Introduzca la Parasitemia de cada muestra.Haga clic con el botón derecho en el cuadro X para buscar Datos de trazado. Haga clic en el icono Datos de trazado para trazar los datos. Inspeccione los espectros en busca de efectos de vapor de agua haciendo clic en Zoom y haciendo zoom en 1, 800 a 1, 400 por centímetro, más claramente observado como picos cortos, agudos y estrechos a lo largo de las laderas de las bandas Amide I y Amide II.En casos de vapor de agua extremo, abra la pestaña Editar datos de preproceso y seleccione Suavizado. Reduzca el ruido y/o las fuertes contribuciones de vapor de agua al suavizar la muestra y los espectros de agua. Después de un tratamiento de datos adicional como se describe en el protocolo de texto, abra la pestaña Editar datos y, en las variables de columna, seleccione 2980 a 2800 por centímetro y de 1750 a 850 por centímetro asegurándose de que solo sus casillas estén marcadas.Los datos ya están listos para su análisis. Para realizar el análisis de componentes principales o PCA, haga clic en Descomposición de análisis y seleccione PCA. Haga clic en Generar modelo.Observe el límite de confianza del 95%, el anillo discontinuo, en la gráfica de puntuaciones entre PC 1 y PC 2. Utilice la herramienta Seleccionar espectro para marcar los espectros de muestra con puntuaciones que se producen fuera del límite como valores atípicos potenciales. Para realizar la regresión de mínimos cuadrados parciales o PLSR, haga clic en Regresión de análisis y seleccione PLSR.Haga clic con el botón derecho en el bloque Y y seleccione el modelo de compilación Parasitemia vectorial. Analice el modelo de regresión y el vector de regresión e identifique las bandas biológicas. Una gráfica de regresión de mínimos cuadrados parciales de RBC aumentada entre el cero y el uno por ciento de Parasitemia generó un valor R cuadrado de 0,87 y un error de validación cruzada al cuadrado medio de raíz de 0,13%Parasitemia.Esto demuestra la capacidad del modelo para predecir la Parasitemia en cada muestra con el Parasitemia conocido en el eje X y el Parasitemia predicho en el eje Y. El coeficiente de regresión asociado describe la contribución de cada banda a la capacidad predictiva del modelo. Cuanto más intensa es la banda, más contribuye al modelo, y por lo tanto, cómo el parásito altera la composición química de la sangre.Los resultados muestran que la señal de los parásitos es lo suficientemente distinta de los RBC que se pueden utilizar para formar un modelo de regresión lineal para la predicción de parásitos en conjuntos de datos futuros. Una vez masterada, esta técnica puede tardar menos de tres minutos por muestra si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar limpiar los cristales ATR de todos los residuos.Después de este procedimiento, otras especies de malaria como P vivax y P malariae pueden ser modeladas con el fin de responder a preguntas como, ¿Es la espectroscopia ATR-FTIR lo suficientemente sensible como para distinguir entre especies? Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la bioespectroscopia exploraran la detección y cuantificación de otros patógenos transmitidos por la sangre e incluso analizaran en la sangre como la glucosa y la urea. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de la espectroscopia ATR-FTIR y el análisis NVDA para construir un modelo de regresión.No olvide que trabajar con muestras de sangre y malaria del paciente puede ser peligroso, y siempre se debe realizar un entrenamiento y contención adecuados a nivel de bioseguridad al intentar este procedimiento.

Research

JoVE Journal

Chemistry

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Química

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