Name: imaging mycobacterium tuberculosis in mice with reporter enzyme fluorescence
Uploaded: 2018-02-26T14:00:00
Duration: 10 min 6 s
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Estudios en animales se realizaron conforme a los lineamientos y regulaciones establecidas por el cuidado de Animal institucional y Comité de uso de Texas A & M University. Revisión y aprobación de un oficial de seguridad de sustancias biopeligrosas o Comité en su institución pueden ser necesarios.
PRECAUCIÓN: Todos los procedimientos requieren contención BSL3. El personal se requiere usar equipo de protección personal en todo momento. Todas las manipulaciones se realizan dentro del gabinete de seguridad de la biotecnología (BSC) y los sostenidos se desechan en contenedores de objetos punzantes. Las superficies de trabajo y BSC se limpian con etanol tamponado de fenol y el 70% antes de iniciar el trabajo y después del trabajo. Procedimientos normalmente se haría en el nivel de bioseguridad 3 con Mycobacterium tuberculosis, pero para ilustración o filmación, los autores demuestran estos procedimientos en el nivel de bioseguridad 2 con bacterias menos virulentas.
1. las cepas y condiciones de la cultura
Nota: Cepa de M. tuberculosis CDC1551 se utiliza en este estudio, pero cualquier cepa de M. tuberculosis puede utilizarse de la misma manera.
<ol><li>Crecen las bacterias en M-OADC-TW (7H 9 caldo suplementado con 0.5% de glicerol, el ácido oleico 10% dextrosa complejo sin catalasa y 0.05% Tween-80) medio pie a 37 ° C a un OD600 de 0.5 (~ 0,2 x 107 CFU).</li>
	<li>Diluir la cultura en M-OADC-TW (serie de la 1:10 diluciones de las bacterias). Las diluciones de las bacterias de la placa (105106107108) por triplicado en placas de selectivo 7 H 11 para permitir la determinación de UFC.</li>
	<li>Incubar las placas durante cuatro semanas a 37 ° C o hasta que las colonias pueden ser contadas con precisión.</li>
	<li>Centrifugue el inóculo bacteriano a 8.534 x g durante 5 min obtener un pellet. Lavar el precipitado una vez con 10 mL de solución salina (0,9% NaCl) y resuspender la pastilla en 15 mL de solución salina (0,9% NaCl).</li>
</ol>2. infección aerosol de ratones usando un compartimiento de Madison
<ol><li>Permiten ratones se adapte a los nuevos alrededores durante una semana.</li>
	<li>Peso de los ratones antes de cargar en la cámara.</li>
	<li>Conectar tres cables a la regleta: el poder de la cámara principal, la bomba de vacío y compresor de aire, en ese orden.</li>
	<li>Desenrosque con cuidado el tarro de cristal. Al gabinete de seguridad de la biotecnología la jarra y añadir el inóculo de desafío suspendido en 15 mL de solución salina (0,9% NaCl) para lograr ~ 104 - 106 UFC de bacterias en los pulmones.</li>
	<li>Cierre la tapa de la jarra en el gabinete de seguridad de la biotecnología. Coloque la jarra en la unidad nebulizadora y ajustar el tubo vertical de acero inoxidable para que el extremo inferior (aspiración) es alrededor de un cuarto de pulgada por debajo del nivel del líquido en la jarra.</li>
	<li>Todos los animales necesarios para el experimento (la cámara puede contener hasta 90 ratones) en la cámara de carga y cierre todos los pestillos de la puerta.</li>
	<li>Compruebe el principal (sala) medidor de flujo de aire. Asegúrese de que el centro del flotador (pelota) corre unos 50 L/min medido en la escala de la izquierda.</li>
	<li>Presione el botón Start en el panel de control de la cámara. Establecer la tasa de flujo de aire a través del medidor de flujo de aire de compresor (el medidor más pequeño en la izquierda) 4 L/min en la escala. Verifique visualmente que el inóculo de desafío es ser nebulizado.</li>
	<li>Después de 15 minutos, cuando aparece la luz roja en la parte frontal del panel de control y una señal acústica indica el final de la carrera, pulsa el botón de Reset en la esquina inferior derecha del panel de control para restablecer los temporizadores.</li>
	<li>Mantenga pulsado el botón rojo pequeño en la puerta de la cámara para liberar el vacío.</li>
	<li>Abrir la puerta y retirar los animales. Coloque el ratón en sus jaulas.</li>
	<li>Retire el frasco nebulizador de vidrio y coloque en un contenedor de transporte sellados, a prueba de fugas. Colocar el recipiente dentro del gabinete de seguridad biológica y desechar la suspensión del desafío en un contenedor de residuos designado.</li>
	<li>Coloca el frasco nebulizador usado dentro de una bolsa de biohazard y selle el bolso para el transporte a la autoclave.</li>
	<li>Al final del procedimiento la infección, rocíe el interior de la cámara con tampón fenol y 70% etanol y permitir a la cámara por 10 minutos.</li>
	<li>Luego, limpie todas las superficies internas accesibles muy a fondo. Dispone de todas las toallas de papel contaminadas, etcetera. en la basura de biohazard. Autoclave de la basura, recipiente para residuos y utiliza frascos de nebulizador.</li>
	<li>Vuelva a colocar los animales en la sala de contención hasta el punto de tiempo de proyección de imagen.</li>
	<li>En el día de la proyección de imagen, transferencia de los animales en un contenedor secundario a la sala de proyección de imagen.</li>
</ol>3. animal anestesia
<ol><li>Anestesiar los ratones con isoflurano utilizando un sistema de anestesia de gas modificado para requisitos particulares.</li>
	<li>Pesar cada uno de los dos cartucho de filtro de carbón situado encima de la unidad de anestesia.</li>
	<li>Reemplace con un nuevo envase si el peso es de 50 g por encima del peso inicial.</li>
	<li>Revise la unidad vaporizador para asegurar suficiente isoflurano para el procedimiento.</li>
	<li>Coloque el soporte del cono de nariz dentro de la cámara de proyección de imagen. Coloque el número de vástagos requeridos para el procedimiento y las aberturas restantes con los bloqueadores del cono de nariz.</li>
	<li>Encienda el suministro de oxígeno de la botella de alta presión y ajuste de 55 psi.</li>
	<li>Encienda la bomba de evacuación situada en frente de la unidad de anestesia y establezca en 8 L/min.</li>
	<li>Gire la palanca de oxígeno situada en frente de la unidad de anestesia.</li>
	<li>Encender el flujo de gas a la cámara de inducción de la anestesia para activar el flujo de gas a 1,5 L/min a su vez el flujo de gas.</li>
	<li>Encender el flujo de gas a la cámara de proyección de imagen para activar el flujo de gas en 0.25 L/min a su vez el flujo de gas.</li>
	<li>Encienda el vaporizador de isoflurano y ajuste de 2-2.5%. Ajustar el nivel de isoflurano según el número y peso de los animales siendo utilizados para el experimento girando el dial en el vaporizador de isoflurano (2-2.5% para un ratón de 20 g de peso; 4% para un conejillo de Indias con 300 g de peso).</li>
	<li>Colocar el ratón en la cámara de anestesia y cierre la tapa. Encender el flujo de gas a la cámara de inducción de la anestesia.</li>
	<li>Deja los ratones en la cámara de inducción de anestesia para 5-10 min hasta que totalmente anestesiados.</li>
	<li>Una vez que los ratones son anestesiados, aplique un ungüento óptico a los ojos para protegerlos durante la proyección de imagen.</li>
	<li>Colocar los ratones en recumbency ventral o esternal que sus narices se colocan en el cono de nariz para facilitar la anestesia de los ratones durante el procedimiento de proyección de imagen.</li>
</ol>4. reportero enzima fluorescencia (REF) la proyección de imagen
<ol><li>Inyectar el sustrato (20 μm, 2.5 μl/g de peso) por inyección intraperitoneal en el infectado, así como los ratones de control. Los ratones son bajo anestesia dentro de la cámara de proyección de imagen de menos de 1 minuto.</li>
	<li>Iniciar el sistema de proyección de imagen.</li>
	<li>Inicializar el sistema haciendo clic en inicializar. Espere hasta que la barra de temperatura se convierte en verde. Nota: La sala de proyección de imagen consiste en una plataforma calentada para mantener la temperatura corporal del animal mientras que la proyección de imagen.</li>
	<li>Valor de adquisición de imágenes, seleccione fluorescente | Trans-iluminación para el animal entero o Epi-iluminación para los tejidos del pulmón, estructura y recubrimiento en Panel de Control de adquisición.</li>
	<li>Establecer campo de vista B ratón y lámpara a alta.</li>
	<li>Establecer tiempo de exposición en auto, medio binning, 2-3 f/stop y filtro de la excitación a los filtros de 745 nm y de emisión de 780 nm a 840 nm.</li>
	<li>Para la configuración de la secuencia, haga clic en configuración de la secuencia, seleccione puntos de Trans-iluminación de 9-12 en el área pulmonar.</li>
	<li>Haga clic en adquirir para la adquisición de la imagen.</li>
	<li>Coloque el ratón en la imagen de la jaula.</li>
	<li>Controlar los ratones hasta que se recuperó completamente o sacrificio para la cuantificación de UFC si la proyección de imagen en un momento del experimento. Realizar una cuenta de Karnofsky modificada para supervisar el bienestar de la proyección de imagen de ratones.</li>
</ol>5. Análisis de la proyección de imagen de REF
<ol><li>Abra el software de imágenes.</li>
	<li>Cargar archivos de imagen haciendo clic en el icono de navegación.</li>
	<li>Para unmixing espectral, haga clic en Unmixing espectral en la paleta de herramientas y haga clic en los espectros necesarios para separar. Haga clic en Inicio idear.</li>
	<li>Reconstrucción óptica de la superficie, haga clic en la topografía de la superficie.</li>
	<li>Seleccione orientación a dorsal, a ratón de pelaje y, haga clic en generar superficie.</li>
	<li>Draw recortar imagen e imagen de umbral para una región de interés. Haga clic en terminado.</li>
	<li>Para el registro del órgano, ir a la ficha de inscripción en menú herramientas ópticas 3D.</li>
	<li>Registro de órganos de interés en un atlas de órgano.</li>
	<li>Ajuste el tamaño del órgano o lugar a la topografía de la superficie generada utilizando la herramienta de transformación de encendido/apagado situada en las herramientas del panel de registro.</li>
	<li>Ir a fluorescente tomografía de reconstrucción 3D (FLIT), y seleccione analiza tabla seleccionar las imágenes a ser incluidos para el análisis, tipo a la eficacia de la fluorescencia de transmisión normalizado (NTF) de imagen, haga clic en Inicio.</li>
	<li>Verifica en seleccionar todos y reconstruir en la pestaña vista previa de datos.</li>
	<li>Para la cuantificación de la fluorescencia, ir a herramientas de la región de interés (ROI), añadir cubo ROI en el órgano de interés y ajustar el tamaño del cubo: para cubrir el órgano de interés. Haga clic en medir ROIs 3D.</li>
	<li>En la ventana de mediciones del ROI, ir a mediciones de ROI 3D, seleccione el tipo de datos a la unidad de voxels y mediciones de fuente a pmolM-1cm-1.</li>
	<li>Guardar o exportar el resultado del análisis de reconstrucción 3D de revoloteo en un archivo de datos o figura.</li>
</ol>6. cuantificación de bacterias por UFC
<ol><li>Eutanasia por inyección intraperitoneal de 0,1 mL pentobarbital sódico (390 mg/mL) a los ratones.</li>
	<li>Busque el reflejo pedal apretando las almohadillas de las patas de los ratones para asegurar que no es ninguna reacción refleja.</li>
	<li>Explante el tejido del pulmón de los ratones usando tijeras y pinzas estériles. Homogeneizar el tejido pulmonar en 1 mL de 1 x de tampón fosfato salino (PBS).</li>
	<li>Hacen diluciones seriadas 10 veces del homogeneizado de pulmón estéril de 1 x PBS.</li>
	<li>Para planchado, punto tres alícuotas de 20 μl de la dilución correspondiente en la placa de agar.</li>
	<li>Incubar las placas en una incubadora a 37 ° C y monitor para crecimiento bacteriano.</li>
	<li>Contar las colonias en cada punto después del tiempo de incubación y expresan como UFC / mL mediante la corrección para el volumen y dilución utilizando la siguiente ecuación: UFC / mL = (V/C) x M Donde C = recuentos de colonias por punto, V = volumen de muestra inoculado en cada placa (mL) y M = factor de multiplicación (recíproco de la dilución utilizada). Nota: Si se cuentan las 11 colonias en un punto determinado para un volumen de muestra de 0,002 mL en una dilución de la muestra de 10-4, utilizando la ecuación, el recuento de colonias se calculará como (11/0.02) x 104 = 5.5 x 106 UFC / mL</li>
</ol>

<ol>
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Al usar técnicas de imagen, como referencia, hay estrategias claves que permitan la generación de datos robustos y consistente. La proyección de imagen óptica produce luz dispersada en tejidos que puede afectar la profundidad de penetración, ya que es difícil de capturar la luz emitida en todas direcciones. Uso de un fluoróforo de infrarrojo cercano (NIR) sustrato para referencia la proyección de imagen con una longitud de onda de excitación y emisión en el Querange de 700-900 nm facilita absorción mínima de la señal fluorescente por los tejidos mamíferos. El sustrato personalizado diseñado fue construido uniendo un fluoróforo NIR, IRDye 800Cw a un extintor, IRDye QC-1, por un anillo de lactama permitiendo que energía de fluorescencia resonancia basada en transferencia apagando. IRDye tiene penetración excelente del tejido y las características de dispersión de luz y no tiene ningún efecto perjudicial evidente en mamíferos36, se despejó de la sangre y órganos por 24 h. fluorescencia señal significativamente aumenta comenzando 4 horas después de Administración de sustrato, alcanzando máximos niveles 6 h después de la administración.
La dosis infecciosa bacteriana, modo de administración de la dosis infectiva y el sustrato, así como momentos de post infección de imagen mediante la realización de estudios piloto deben estandarizarse antes de embarcarse en experimentos grandes y complejos. Estudios piloto pueden reducir tiempo y costo cuando proyección de imagen un gran número de animales porque un procedimiento estándar puede optimizarse antes de hacer el experimento clave. Cargas bacterianas deben determinarse en los órganos/tejidos de interés tras la proyección de imagen de cuerpo entero con trans-iluminación y ex vivo lung proyección de imagen usando epi-iluminación para validar la fuente de la señal y determinar la calidad de la correlación con números bacteriana presente8. Estudios piloto proporcionan la penetración en el umbral de detección, rango dinámico de la técnica, así como determinación de las condiciones experimentales óptimas para la proyección de imagen.
Las principales ventajas de la utilización de imágenes como referencia en comparación con otras estrategias fluorescentes y bioluminiscentes son su alta sensibilidad y capacidad para obtener imágenes naturales de M. tuberculosis cepas. REFERENCIA la proyección de imagen utiliza la robusta catalítico enzima BlaC que se conserva en todos los aislamientos clínicos de M. tuberculosis y cepas del complejo tuberculosis. La gran sensibilidad de la proyección de imagen de referencia es debido a la rápida tasa catalítica de BlaC en combinación con la retención del producto fluorescente hendido por la célula huésped. Señal aumenta continuamente siempre y cuando el sustrato está disponible dando por resultado la acumulación casi ilimitada de la señal dentro de las células infectadas y los tejidos. Este aumento de la sensibilidad de referencia la proyección de imagen en comparación con alternativas de proyección de imagen permite detección específica de M. tuberculosis tanto en vitro y en vivo8,23,24, 29.
REFERENCIA la proyección de imagen puede utilizarse para la detección de bacteria sin modificaciones genéticas, lo que permite su aplicación directa a cualquier modelo de infección, ya sea laboratorio animales8,37 o materiales clínicos humanos29,38 . REF puede utilizarse para detectar y una amplia gama de patógenos39,40, de la imagen desde sustratos fluorógenos pueden ser convertidos para numerosos objetivos enzimáticos distintos BlaC como proteasas, quinasas, ureases y β-galactosidases. Sin embargo, cuidadosa se debe reflexionar en el destino con el fin de asegurar muestra características óptimas para la proyección de imagen. BlaC representa una enzima buen modelo de características que aseguren la aplicación exitosa de esta estrategia. REF la proyección de imagen proporciona una lectura inmediata en la carga bacteriana presente en los pulmones durante las infecciones, que acelera mucho progreso en el estudio de la patogenia de la tuberculosis, ya que la determinación del número de bacteria normalmente requiere tres a seis semanas, pero incluso en más organismos de crecimiento rápido este enfoque permitirá ahorrar mucho tiempo. REF también podría ser utilizado para diferenciar carcinomas de tuberculosis, un problema clave en el diagnóstico de lesiones nodulares en pacientes41,42. REF sirve como una novedosa herramienta para acelerar la proyección de imagen de tuberculosis traslacional y se puede aplicar incluso a los seres humanos, potencialmente permitiendo rápida predicción de resultados terapéuticos.

El lento crecimiento de M. tuberculosis es un importante obstáculo en el diagnóstico rápido de tuberculosis1,2,3. Mientras que cultura base diagnóstico toma semanas para producir resultados, citología ácido-rápida tiene limitaciones diagnóstico4 en niños5 y en pacientes coinfectados con virus de inmunodeficiencia humana6,7. Tecnologías ópticas de proyección de imagen han sido reconocidos recientemente como una alternativa a los tradicionales métodos de diagnóstico para tuberculosis8,9. Bioluminiscencia y fluorescencia permite imagen ópticamente de M. tuberculosis en animales vivos en tiempo real10,11,12,13,14, 15,16,17,18,19. Imágenes ópticas tiene el beneficio de una evaluación rápida y específica de una infección con M. tuberculosis20,21,22.
Describiremos los datos de proyección de imagen óptica de M. tuberculosis en ratones vivos usando a REF. Este método es muy específico y sensible23,24 y, similar a otros métodos ópticos, es menos costoso que otros métodos de la tuberculosis (TB)25, incluyendo la tomografía computada (CT)26, magnética de la proyección de imagen resonancia por imágenes (MRI)27y F-fluorodeoxyglucose tomografía por emisión de positrones/TC (F-FDG PET/CT)28. REF utiliza sustratos fluorescentes o bioluminiscentes personalizados que al escote de una enzima bacteriana, producen un producto fluorescente8,29. Por lo tanto, tiene la ventaja de no requerir un reportero micobacterias recombinante cepa30,31. El sustrato de traste que se describe está compuesto por un fluorocromo y un extintor conectado por un anillo β-lactámico que es hidrolizado por BlaC (β-lactamasa), naturalmente expresada constitutivamente complejo tuberculosis Mycobacterium8, 32. las bacterias directamente generan señal debido a la actividad catalítica de referencia que permite la amplificación por muchos órdenes de magnitud y sensibilidad detección de M. tuberculosis.
El sustrato de referencia utilizado en este estudio tiene penetración excelente del tejido en los animales vivos y reducido de fondo debido a su longitud de onda larga. Con este sustrato de larga longitud de onda es posible alcanzar un umbral de detección de M. tuberculosis de cerca de 100 colonias formando unidades (UFC) en vitro y < 1000 UFC en los pulmones de ratones in vivo la (todo animal)8, 33. REF puede ser utilizado como una herramienta de diagnóstico para Esputo, materiales clínicos y aún directamente en pacientes con micro sistemas endoscópicos16,32,33,34 debido a su alta sensibilidad y especificidad. REF puede aplicarse a cualquier cepa clínica de tuberculosis, ya que utiliza una enzima bacteriana naturalmente producido, BlaC, para la detección en todas las cepas. Estas características hacen REF imagen una herramienta valiosa en la investigación preclínica de la tuberculosis en general para facilitar la terapéutica y evaluación de la vacuna así como análisis de patogénesis, pero pueden aplicarse también en última instancia a la diagnosis de la tuberculosis pacientes.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:664px;" width="664">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:163px;">VETONE</td>
			<td align="right" style="width:119px;">501027</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:216px;">CNIR800</td>
			<td style="width:163px;">Custom synthesized</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:216px;">Fatal Plus solution</td>
			<td style="width:163px;">Vortech Pharmaceutical Ls, Ltd</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">7H9 Middlebrook broth</td>
			<td style="width:163px;">BD</td>
			<td align="right" style="width:119px;">271310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">OADC Middlebrook enrichment</td>
			<td style="width:163px;">BD</td>
			<td align="right" style="width:119px;">212351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sporcidin</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:119px;">RE-1284F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">7H11 Middlebrook Agar</td>
			<td style="width:163px;">BD</td>
			<td align="right" style="width:119px;">212203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Madison Chamber</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">IVIS Spectrum</td>
			<td style="width:163px;">Perkin Elmer</td>
			<td align="right">124262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">XGI-8-gas Anesthesia System</td>
			<td style="width:163px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Living Imaging software</td>
			<td style="width:163px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Transparent nose cones</td>
			<td style="width:163px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">M. tuberculosis strain CDC1551</td>
			<td style="width:163px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Female BALB/C mice, 5-7 weeks</td>
			<td style="width:163px;">Jackson Laboratory</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging mycobacterium tuberculosis in mice with reporter enzyme fluorescence

Fluorescencia de enzima Reporter (REF) utiliza sustratos específicos para enzimas presentes en los organismos blanco de interés para la proyección de imagen o la detección por fluorescencia o bioluminiscencia. Utilizamos BlaC, una enzima expresada constitutivamente por todas las cepas de M. tuberculosis . REF permite la cuantificación rápida de bacterias en los pulmones de ratones infectados. El mismo grupo de ratones puede ser reflejado en muchos momentos, grandemente reducir costos, la enumeración de las bacterias más rápidamente, permitiendo observaciones novela en interacciones huésped-patógeno y aumentar el poder estadístico, puesto que fácilmente se mantienen más animales por grupo . REF es extremadamente sensible debido a la naturaleza catalítica de la reportera enzimática BlaC y específicos debido a la transferencia de energía de resonancia medida de fluorescencia (FRET) o sustratos fluorógenos utilizados. REF no requiere cepas recombinantes, asegurando la normal relación huésped-patógeno. Describimos la proyección de imagen de M. tuberculosis infección usando un substrato de traste con emisión máxima a 800 nm. La longitud de onda del sustrato permite proyección de imagen sensible tejido profundo en mamíferos. Se esbozarán infección por aerosol de ratones con M. tuberculosis, anestesia de los ratones, la administración del substrato REF y la proyección de imagen óptica. Este método se ha aplicado con éxito para evaluar interacciones huésped-patógeno y eficacia de los antibióticos contra M. tuberculosis.

REFERENCIA la proyección de imagen de ratones infectados con M. tuberculosis junto con ratón de control no infectados se muestran en la figura 1A. Los ratones infectados producen un significativamente (P = 0.0057) señal de fluorescencia más alta de los pulmones en la infección después de 6 semanas en comparación con el control sobre la administración del substrato. Un curso de tiempo típico para el estudio de la eficacia terapéutica contra M. tuberculosis usando REF podría ser la proyección de imagen en semana 1, 2, 4, 6, 15, 24 post-infección. Intensidad de la fluorescencia se cuantifica usando epi-iluminación para tejidos pulmonares (figura 1B). La señal constantemente cada vez mayor de la semana 2 a semana 6 en pulmones de ratones infectados sugiere que REF con éxito capaces de detectar M. tuberculosis in vivo. Una caída en la señal de fondo de los ratones de control en un momento de tiempo posterior (figura 1B) podría atribuirse al aumento de cuerpo masa y volumen de los ratones durante un período de 6 semanas, reduciendo la penetración de la longitud de onda de excitación. Reconstrucción 3D del REVOLOTEO de las fuentes de fluorescencia en ratones infectados con M. tuberculosis está representada en la figura 2A. Las secuencias de imágenes se adquieren en varios puntos de trans-iluminación en ratón usando la misma excitación y serie de filtros de emisión. Estas secuencias de imágenes se utilizan entonces para reconstrucción 3D de revoloteo para distribución de código fuente fluorescente dentro del tema animal. Figura 2 A-D muestra las diversas direcciones (coronal, sagital y transaxial) de tomografía de ratón con registro de órgano pulmón. Eficiencia NTF mapas para comprobar la calidad de la reconstrucción están representados en la figura 2E. NTF permite restar la salida de luz de fondo de imágenes trans-iluminación a través de una imagen adicional capturada con filtro de densidad neutra. La imagen tomada con el filtro de la excitación específica (figura 2E-medido) está normalizada a la imagen de transmisión medida con el mismo filtro de emisión y un filtro de excitación abierto (figura 2E simulado) para dar la señal producida por el sustrato solo. El similar medido y simulado NTF Perfil de eficacia en tanto la horizontal (figura 2F) y perfiles (figura 2G) con casi 0% porcentaje error (figura 2E % error) proporciona evidencia de una reconstrucción 3D de buena calidad con reducción de artefactos y localización de señal mejorada y sensibilidad.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56801/56801fig1.jpg"> Figura 1 . Proyección de imagen de M. tuberculosis con Ref (A) en vivo la proyección de imagen de ratones no infectados e infectados con M. tuberculosis en 2, 4 y la infección después de 6 semanas. La barra de color representa la intensidad de la señal fluorescente en fotones por segundo por cm2 de baja (amarillo) a alta (rojo). (B) cuantificación de la intensidad de la fluorescencia de ratones infectados con M. tuberculosis. Valores de fluorescencia para el control de ambos (negro) e infectado (rojo) se representa junto con el error estándar para cada punto del tiempo. La importancia de los resultados se determinó por los estudiantes t-test, valores de p de < 0,05 se consideraron significativos. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56801/56801fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56801/56801fig2.jpg"> Figura 2 . Reconstrucción 3D del REVOLOTEO de las fuentes de fluorescencia en ratones infectados con M. tuberculosis. Tomografía de ratón en distintas direcciones; A) coronal, B) sagital y C) transaxial con registro de órgano D) pulmonar. La región 3D de interés (ROI) se representa como un cubo rojo en el pulmón para las mediciones de la fuente. (E) eficiencia NTF mapas de medido y simulado para comprobar la calidad de la reconstrucción. Se comparó el perfil de eficacia NTF medido y simulado, proporcionando buena calidad de la reconstrucción 3D (similar medida y simulada NTF eficiencia). Señal vertical Horizontal F) y G) perfiles representando a medida (azul) y simula la curva de eficiencia NTF (roja). Las barras rojas horizontales y verticales indican la posición de la fuente. La barra de color representa la intensidad de la señal fluorescente en fotones por segundo por cm2 de baja (azul) a alta (rojo). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56801/56801fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

Describimos la proyección de imagen óptica de ratones infectados con Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) mediante fluorescencia de enzima reporter (REF). Este protocolo facilita la detección sensible y específica de M. tuberculosis en modelos animales preclínicos para la investigación de la patogenia, terapéutica y vacunas.

Proyección de imagen de tuberculosis del Mycobacterium en ratones con reportero enzima fluorescencia

Reporter enzyme fluorescence (REF) utilizes substrates that are specific for enzymes present in target organisms of interest for imaging or detection by ...

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Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

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