Name: using fluorescence in situ hybridization (fish) to monitor the state of arm cohesion in prometaphase and metaphase i drosophila oocytes
Uploaded: 2017-12-06T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Fluorescence In Situ Hybridization FISH to Monitor the State of Arm Cohesion in Prometaphase and Metaphase I Drosophila Oocytes at JoVE.com

이 작품은 샤론 E. 강사에 게 수 여 하는 NIH 그랜트 GM59354에 의해 지원 되었다. Confocal 현미경 검사 법에 대 한 앤 Lavanway와 기술 지원에 대 한 제이 에밀리 리드 형광 팔 프로브를 생성 하기 위한 프로토콜을 개발에 도움에 감사 위이 Q. 응웬 하 고. 우리는 또한 유용한 토론 및 조언을 위한 초파리 커뮤니티에서 수많은 동료를 감사합니다.

1입니다. 준비
<ol><li>
형광 제자리에서 교 잡 (물고기)에 대 한 솔루션을 준비 합니다. 초순 수를 사용 하 여 모든 솔루션을 준비 합니다.
	<ol>
<li>5 수정 Robb의 버퍼 배 준비: 275 mM 칼륨 아세테이트, 아세트산 나트륨 200 m m, 500mm 자당, 50 m m 포도 당, 염화 마그네슘 6 m m, 5 m m 염화 칼슘, 500 mM HEPES pH 7.4 =. PH 7.4 10 N NaOH를 사용 하 여가지고. 필터를 소독 하 고-20 ° c.에 저장 해 동 하 고 ...

<ol>
	<li>Peters, J. M., Nishiyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sister+chromatid+cohesion.">Sister chromatid cohesion.</a> CSH Perspect Biol. 4 (11), (2012).</li><li>McNicoll, F., Stevense, M., Jessberger, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cohesin+in+gametogenesis.">Cohesin in gametogenesis.</a> Curr Top Dev Biol. 102, 1-34 (2013).</li><li>Buonomo, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disjunction+of+homologous+chromosomes+in+meiosis+I+depends+on+proteolytic+cleavage+of+the+meiotic+cohesin+Rec8+by+separin.">Disjunction of homologous chromosomes in meiosis I depends on proteolytic cleavage of the meiotic cohesin Rec8 by separin.</a> Cell. 103 (3), 387-398 (2000).</li><li>Bickel, S. E., Orr-Weaver, T., Balicky, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sister-chromatid+cohesion+protein+ORD+is+required+for+chiasma+maintenance+in+Drosophila+oocytes.">The sister-chromatid cohesion protein ORD is required for chiasma maintenance in Drosophila oocytes.</a> Curr. Biol. 12 (11), 925-929 (2002).</li><li>Hodges, C. A., Revenkova, E., Jessberger, R., Hassold, T. J., Hunt, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SMC1beta-deficient+female+mice+provide+evidence+that+cohesins+are+a+missing+link+in+age-related+nondisjunction.">SMC1beta-deficient female mice provide evidence that cohesins are a missing link in age-related nondisjunction.</a> Nat Genet. 37 (12), 1351-1355 (2005).</li><li>Freeman, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+National+Down+Syndrome+Project:+design+and+implementation.">The National Down Syndrome Project: design and implementation.</a> Public Health Rep. 122 (1), 62-72 (2007).</li><li>Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+aneuploidy:+mechanisms+and+new+insights+into+an+age-old+problem.">Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem.</a> Nat Rev Genet. 13 (7), 493-504 (2012).</li><li>Angell, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First-meiotic-division+nondisjunction+in+human+oocytes.">First-meiotic-division nondisjunction in human oocytes.</a> Am. J. Hum. Genet. 61, 23-32 (1997).</li><li>Tsutsumi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+decrease+of+meiotic+cohesins+in+human+oocytes.">Age-related decrease of meiotic cohesins in human oocytes.</a> PLoS One. 9 (5), e96710 (2014).</li><li>Liu, L., Keefe, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+cohesin+is+associated+with+age-dependent+misaligned+chromosomes+in+oocytes.">Defective cohesin is associated with age-dependent misaligned chromosomes in oocytes.</a> Reprod Biomed Online. 16 (1), 103-112 (2008).</li><li>Subramanian, V. V., Bickel, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+predisposes+oocytes+to+meiotic+nondisjunction+when+the+cohesin+subunit+SMC1+is+reduced.">Aging predisposes oocytes to meiotic nondisjunction when the cohesin subunit SMC1 is reduced.</a> PLoS Genet. 4 (11), e1000263 (2008).</li><li>Chiang, T., Duncan, F. E., Schindler, K., Schultz, R. M., Lampson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+that+weakened+centromere+cohesion+is+a+leading+cause+of+age-related+aneuploidy+in+oocytes.">Evidence that weakened centromere cohesion is a leading cause of age-related aneuploidy in oocytes.</a> Curr. Biol. 20 (17), 1522-1528 (2010).</li><li>Lister, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+meiotic+segregation+errors+in+mammalian+oocytes+are+preceded+by+depletion+of+cohesin+and+Sgo2.">Age-related meiotic segregation errors in mammalian oocytes are preceded by depletion of cohesin and Sgo2.</a> Curr. Biol. 20 (17), 1511-1521 (2010).</li><li>Duncan, F. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+cohesion+decreases+in+human+eggs+with+advanced+maternal+age.">Chromosome cohesion decreases in human eggs with advanced maternal age.</a> Aging Cell. 11 (6), 1121-1124 (2012).</li><li>Yun, Y., Lane, S. I., Jones, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Premature+dyad+separation+in+meiosis+II+is+the+major+segregation+error+with+maternal+age+in+mouse+oocytes.">Premature dyad separation in meiosis II is the major segregation error with maternal age in mouse oocytes.</a> Development. 141 (1), 199-208 (2014).</li><li>Subramanian, V. V., Bickel, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterochromatin-mediated+association+of+achiasmate+homologues+declines+with+age+when+cohesion+is+compromised.">Heterochromatin-mediated association of achiasmate homologues declines with age when cohesion is compromised.</a> Genetics. 181, 1207-1218 (2009).</li><li>Jeffreys, C. A., Burrage, P. S., Bickel, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+system+for+increased+meiotic+nondisjunction+in+older+oocytes.">A model system for increased meiotic nondisjunction in older oocytes.</a> Curr. Biol. 13 (6), 498-503 (2003).</li><li>Weng, K. A., Jeffreys, C. A., Bickel, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rejuvenation+of+Meiotic+Cohesion+in+Oocytes+during+Prophase+I+Is+Required+for+Chiasma+Maintenance+and+Accurate+Chromosome+Segregation.">Rejuvenation of Meiotic Cohesion in Oocytes during Prophase I Is Required for Chiasma Maintenance and Accurate Chromosome Segregation.</a> PLoS Genetics. 10 (9), e1004607 (2014).</li><li>Perkins, A. T., Das, T. M., Panzera, L. C., Bickel, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+in+oocytes+during+midprophase+induces+premature+loss+of+cohesion+and+chromosome+segregation+errors.">Oxidative stress in oocytes during midprophase induces premature loss of cohesion and chromosome segregation errors.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (44), E6823-E6830 (2016).</li><li>Dernburg, A. F., Sedat, J. W., Hawley, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+evidence+of+a+role+for+heterochromatin+in+meiotic+chromosome+segregation.">Direct evidence of a role for heterochromatin in meiotic chromosome segregation.</a> Cell. 86, 135-146 (1996).</li><li>Dernburg, A. F., Sedat, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Method Cell Biol. 53, 187-233 (1998).</li><li>Guo, Z., Batiha, O., Bourouh, M., Fifield, E., Swan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Securin,+Separase+and+Cohesins+in+female+meiosis+and+polar+body+formation+in+Drosophila.">Role of Securin, Separase and Cohesins in female meiosis and polar body formation in Drosophila.</a> J Cell Sci. 129 (3), 531-542 (2016).</li><li>Giauque, C. C., Bickel, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterochromatin-Associated+Proteins+HP1a+and+Piwi+Collaborate+to+Maintain+the+Association+of+Achiasmate+Homologs+in+Drosophila+Oocytes.">Heterochromatin-Associated Proteins HP1a and Piwi Collaborate to Maintain the Association of Achiasmate Homologs in Drosophila Oocytes.</a> Genetics. 203 (1), 173-189 (2016).</li><li>Joyce, E. F., Apostolopoulos, N., Beliveau, B. J., Wu, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+progenitors+escape+the+widespread+phenomenon+of+homolog+pairing+during+Drosophila+development.">Germline progenitors escape the widespread phenomenon of homolog pairing during Drosophila development.</a> PLoS Genet. 9 (12), e1004013 (2013).</li><li>Gilliland, W. D., Hughes, S. F., Vietti, D. R., Hawley, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Congression+of+achiasmate+chromosomes+to+the+metaphase+plate+in+Drosophila+melanogaster+oocytes.">Congression of achiasmate chromosomes to the metaphase plate in Drosophila melanogaster oocytes.</a> Dev Biol. 325 (1), 122-128 (2009).</li><li>Gyuricza, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+and+Stable+Cohesins+Regulate+Synaptonemal+Complex+Assembly+and+Chromosome+Segregation.">Dynamic and Stable Cohesins Regulate Synaptonemal Complex Assembly and Chromosome Segregation.</a> Curr Biol. 26 (13), 1688-1698 (2016).</li><li>Radford, S. J., McKim, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+for+Imaging+Prometaphase+and+Metaphase+of+Meiosis+I+in+Fixed+Drosophila+Oocytes.">Techniques for Imaging Prometaphase and Metaphase of Meiosis I in Fixed Drosophila Oocytes.</a> J Vis Exp. (116), (2016).</li></ol>

물고기를 사용 하 여 나 고 분열 prometaphase 팔 응집력의 상태를 평가 하기 위해 프로브 나 초파리 oocytes 초파리 감수 분열의 분야에서 중요 한 발전 이다. 역사적으로, 초파리 연구 성숙 oocytes11,,1819팔 응집력의 조 손실 유추를 유전자 검사로 제한 되었습니다. 자, 여기에 제시 된 방법으로 팔 단결력의 상태 ?...

유사 분열, 감수 분열 동안 염색체의 적절 한 분리 필요 그 자매 chromatid 단결력, 유지, 설립 될와 조정된 패션1,2에 발표. 단결력 S 단계 설정 되 고 복잡 한, 자매는 실제 관계를 형성 하는 cohesin에 의해 중재 chromatids 함께. 감수 분열에서 결합 한 크로스 오버를 원심 또한 함께 재조합 homologs를 기능과이 실제 협회를 통해 올바른 방향이는 분열에의 나는 (그림 1)3,4, 스핀 들 5. 팔의 릴리스 anaphase에 응집력 나 반대 스핀 들 극을 분리 하는 homologs 수 있습니다. 그러나, 팔 단결력은 경우 중간, 손실 재조합 homologs 그들의 물리적 연결을 잃게 되며 임의로, 분리는 aneuploid gametes (그림 1)에서 발생할 수 있습니다.
인간의 oocytes에서 염색체 분리에 오류 유산 및 기형 아 출산, 다운 증후군6, 등의 주요 원인이 되며 그들의 발생 산 모 나이7기 하 급수적으로 증가. 자매 chromatid 단결력 태아 oocytes에서 설정 되 고 meiotic 재결합 출생 하기 전에 완료 됩니다. Oocytes 다음 체포 중간 의향에 나 배 란까지 고이 체포 하는 동안, 재조합 homologs의 지속적인된 물리적 협회 의존 자매 chromatid 단결력. 따라서, 감수 분열과 정상 임신 결과 정확한 분리 결합 최대 5 년간 그대로 유지 해야 합니다.
인간의 oocytes의 장기간된 meiotic 체포 중 응집 조 손실 모성 연령 효과에 기여할 제안 되었습니다와 증거의 여러 줄이 가설8,9를 지원 합니다. 그러나,이 현상의 우리의 이해의 대부분 모델 생물5,10,,1112, 를 사용 하 여 의존 인간의 oocytes meiotic 응집력의 과제를 감안할 때, 13,,1415.
초파리 melanogaster oocytes meiotic 응집과 염색체 분리의 연구에 대 한 수많은 이점을 제공합니다. 간단한 유전자 분석 결과 수 aneuploid gametes에서 자손을 복구 하 고 X의 충실도 측정-대규모11,,1617에 염색체 분리. 또한, 하나 또한 나 팔 단결력11,18, 의 조 손실에 일치 하는 표현 형 감수 분열 시 재조합 homologs missegregate 때문에 염색체 분리 오류 발생 여부를 결정할 수 있습니다 19. 초파리 oocytes meiotic 응집력의 상태 관찰은 또한 형광 제자리에서 교 잡 (물고기)를 사용 하 여 직접. 비록 반복적인 위성 시퀀스에 교배 하는 형광 oligonucleotides 사용 되었습니다 10 년 이상 모니터링 성숙 초파리 oocytes4,20, 팔의 분석에서에서 pericentromeric 결합 하 단결력은 더욱 어려운 되었습니다. 팔 단결력의 상태 시각화 단일 복사본의 큰 영역에 걸쳐 프로브 시퀀스 이며 충분히 밝은 결과 개별 여동생에 대 한 표시 신호 chromatids 팔 단결력은 결 석 하는 경우 필요 합니다. 또한, oocyte 고정 조건 및 레이블이 지정 된 DNAs의 크기 큰 성숙한 초파리 oocyte (200 µ m 넓은 500 µ m 길이 의해)에 침투21 를 촉진 해야 합니다. 최근, 한 팔 조사는 성공적으로 활용, 하지만 저자 anaphase 동안 초파리 oocyte chromatids를 시각화 하기 위해 명시 된 그들은 prometaphase에 신호를 감지 하지 못했습니다 또는 분열 oocytes22를 체포. 여기 우리는 X의 생성에 대 한 자세한 프로토콜 제공-염색체 팔 물고기 조사 조건과 oocyte 준비 나 하 고 분열 chromatid 응집력 prometaphase 언 니의 조기 상실에 대 한 분석 결과 허용 난 oocytes. Meiotic 단결력의 유지 보수에 필요한 유전자 제품을 사용, 이러한 기술을 동생에 대 한 분석 결과를 다른 수 chromatid 단결력 다른 genotypes의 성숙한 초파리 oocytes에 결함.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Kits</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Midi Prep kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12143</td>
			<td>Prep BAC clone DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenomePlex Complete Whole Genome Amplification (WGA) Kit</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>WGA2</td>
			<td>Amplify BAC clone DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARES Alexa Fluor 647 DNA labeling kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21676</td>
			<td>Label BAC clone DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR purification kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td>Remove non-conjugated dye following labeling of BAC clone DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals &#38; Solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Note: All solutions are prepared using sterile ultrapure water and should be sterilized either by autoclave or filter sterilization.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1600-100</td>
			<td>Prepare 10% stock 
			Freeze aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C75-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#8217;, 6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td>Toxic: wear appropriate protection. Prepare 100&#181;g/ml stock in 100% ethanol, store in aliquots at -20 &#176;C. Prepare 1 &#181;g/ml solution in 2X SSCT before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran sulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D-8906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drierite</td>
			<td>Drierite Company</td>
			<td>23001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15508-013</td>
			<td>Prepare 10 mM stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dTTP (10 &#181;mol, 100 &#181;l)</td>
			<td>Boehringer Mannheim</td>
			<td>1277049</td>
			<td>Prepare 1 mM stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA (Disodium ethylenediamine tetraacetic acid)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S311-500</td>
			<td>Prepare 250 mM stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% ethanol (molecular grade, 200 proof)</td>
			<td>Decon Laboratories</td>
			<td>2716</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris (Ultra Pure)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15504-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA (Ethylenebis(oxyethylenenitrilo)tetraacetic acid)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E-3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% formaldehyde</td>
			<td>Ted Pella, Inc.</td>
			<td>18505</td>
			<td>Toxic: wear appropriate protection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9342</td>
			<td>Toxic: wear appropriate protection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D16-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen</td>
			<td>Roche</td>
			<td>901393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Boehringer Mannheim</td>
			<td>737-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heptane</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>H350-4</td>
			<td>Toxic: wear appropriate protection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>HX0603-4</td>
			<td>Toxic: wear appropriate protection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydroxylamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>438227</td>
			<td>Prepare 3 M stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4.9 M Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>104-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4 &#376; 7H2O</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S373-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4 &#376; 2H2O</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S369-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine (0.1mg/ml)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8920-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium acetate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP364-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S209-500</td>
			<td>Prepare 3M stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium cacodylate</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>1131</td>
			<td>Toxic: wear appropriate protection. Prepare 400mM stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP327-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-3</td>
			<td>Sodium chloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S5-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Tween 20</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>28320</td>
			<td>Surfact-Amps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Triton X-100</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>28314</td>
			<td>Surfact-Amps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Note: All solutions are prepared using sterile ultrapure water and should be sterilized either by autoclave or filter sterilization.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH = 8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20X SSC (Saline Sodium Citrate)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>3 M NaCl, 300 mM sodium citrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2X cacodylate fix solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Toxic: wear appropriate protection. 200 mM sodium cacodylate, 200 mM sucrose, 80 mM sodium acetate, 20 mM EGTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.1X Hybridization buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>3.3X SSC, 55% formamide, 11% dextran sulfate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fix solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Toxic: wear appropriate protection. 4% formaldehyde, 1X cacodylate fix solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBSBTx</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1X PBS, 0.5% BSA, 0.1% Trition X-100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBSTx</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1X PBS, 1% Trition X-100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extraction buffer (PBSTx + Rnase)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1X PBS, 1% Trition X-100, 100 &#181;g/mL RNase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2X SSCT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2X SSC, 0.1% Tween 20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2X SSCT + 20% formamide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Toxic: wear appropriate protection. 2X SSC, 0.1% Tween 20, 20% formamide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2X SSCT + 40% formamide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Toxic: wear appropriate protection. 2X SSC, 0.1% Tween 20, 40% formamide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2X SSCT + 50% formamide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Toxic: wear appropriate protection. 2X SSC, 0.1% Tween 20, 50% formamide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enzymes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AluI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0137S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HaeIII</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0108S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MseI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0525S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MspI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0106S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RsaI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0167S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BfuCI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0636S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100X BSA</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td></td>
			<td>Comes with NEB enzymes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X NEB buffer #2</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td></td>
			<td>Restriction enzyme digestion buffer. Comes with NEB enzymes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) 400 U/&#181;l</td>
			<td>Roche/Sigma</td>
			<td>3333566001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TdT buffer</td>
			<td>Roche/Sigma</td>
			<td></td>
			<td>Comes with TdT enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cobalt chloride</td>
			<td>Roche/Sigma</td>
			<td></td>
			<td>Toxic: wear appropriate protection. Comes with TdT enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A (10 mg/mL)</td>
			<td>Thermo-Scientific</td>
			<td>EN0531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytology Tools etc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Dumont</td>
			<td></td>
			<td>#5 INOX, Biologie</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9&#8221; Disposable glass Pasteur pipettes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-678-20C</td>
			<td>Autoclave to sterilize</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shallow glass dissecting dish</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Custom made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deep well dish (3 wells)</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>7223-34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherfinest Premium microscope slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-038-104</td>
			<td>Used to cover deep well dishes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frosted glass slides, 25 x 75 mm</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>48312-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides, 3 x 1 in, 1 mm thick</td>
			<td>Thermo-Scientific</td>
			<td>3051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips, 10 x 10 mm, No. 1.5</td>
			<td>Thermo-Scientific</td>
			<td>3405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tungsten needle</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>homemade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong GOLD mounting media</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>P36930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compressed-air in can</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR machine</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop 2000, spectrophotometer</td>
			<td>Thermo-Scientific</td>
			<td></td>
			<td>microvolume spectrophotometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortexer</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Table top microfuge at room temperature</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Table top microfuge at 4 &#176;C</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat block</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization oven or incubator with rotator</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutator</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A1RSi laser scanning confoal</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>40X oil Plan Fluor DIC (NA 1.3)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Consumables etc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tubes</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tubes</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microfuge tubes</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 &#181;l microfuge tubes</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;l PCR tubes</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic container with tight fitting lid</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td>To hold Drierite</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td>disposable wipes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td>paraffin film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC purified 5&#39;-labeled oligonucleotides</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td></td>
			<td>Cy3-labeled probes that recognize the 359 bp satellite repeat of the X chromosome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volocity 3D Image Analysis Software</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td>Version 6.3</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using fluorescence in situ hybridization (fish) to monitor the state of arm cohesion in prometaphase and metaphase i drosophila oocytes

인간에서는, oocytes에서 염색체 분리 오류 유산 및 기형 아 출산의 대부분에 대 한 책임이 있습니다. 또한, 여자 나이, 그들 마음속에 aneuploid 태아는 극적으로 증가 하 고이 현상의 위험 모성 연령 효과로 알려져 있다. Meiotic 분열 동안 정확한 염색체 분리에 대 한 요구 사항 중 하나는 자매의 유지 보수 oocytes 경험 확장된 의향 기간 chromatid 단결력. 인간 및 모형 유기 체에서 cytological 증거 meiotic 단결력 노화 과정 동안 악화 나왔다. 또한, 인간의 oocytes에서 분리 오류는 감수 분열 중 가장 널리 퍼진 나 팔 단결력의 조 손실와 일치. 모델 생물의 사용은 기초가 단결력의 연령에 따라 손실 메커니즘을 탈피 중요 합니다. 초파리 melanogaster oocytes meiotic 응집력의 규칙을 공부에 대 한 몇 가지 장점이 있습니다. 그러나, 최근까지, 유전 시험만 팔 응집력 oocytes 다른 genotypes 또는 다른 실험 조건에서의 손실에 대 한 분석 결과를 사용할 수 없었습니다. 여기, 상세한 프로토콜 형광에서 제자리에서 사용 하기 위한 교 잡 (물고기)을 직접 시각화 결함 prometaphase 팔 응집력에 나 고 분열 초파리 oocytes를 체포 하는 제공 됩니다. X 염색체의 원심 팔 hybridizes를 물고기 프로브를 생성 하 여 수집 하는 confocal Z 스택 연구원 수 3 차원에서 개별 물고기 신호의 수를 시각화 하 고 자매 여부 결정 chromatid 무기 분리. 설명한 팔 단결력 결함 초파리 oocytes의 수백에 계량을 가능 하 게. 따라서,이 방법은 단결력 유지 보수 뿐만 아니라 노화 과정의 죽음으로 이어질 요인에 기여 하는 메커니즘을 조사는 중요 한 도구를 제공 합니다.

그림 5 는 X 염색체에 cytological 지역 6E-7B에 hybridizes는 팔 조사로 얻은 이미지를 선물 한다. 공동의 DAPI, localizes 신호에서이 조사 결과 배경에서 쉽게 구별할 수 이며 팔 단결력 결함 다른 genotypes19에 척도를 성공적으로 사용 되었습니다. 단결력 결함의 부 량 제한 되었다 prometaphase에 어 분열 I 단계; 핵 붕괴 이전 oocytes 분석<sup cl...

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Using Fluorescence In Situ Hybridization FISH to Monitor the State of Arm Cohesion in Prometaphase and Metaphase I Drosophila Oocytes

Prometaphase 팔 응집력과 분열의 상태를 모니터링 하려면 형광 제자리에서 교 잡 (물고기)를 사용 하 여 나 초파리 Oocytes

이 원고 X를 생성 하는 자세한 방법을 제공-염색체 팔 프로브 및 수행 형광 제자리에서 교 잡 (물고기) 자매의 상태를 검사 하 chromatid 응집력 prometaphase 및 를 체포 하는 분열 초파리 oocytes. 이 프로토콜은 meiotic 팔 단결력은 그대로 또는 다른 genotypes에 방해 여부 결정 하는 데 적합 합니다.

In humans, chromosome segregation errors in oocytes are responsible for the majority of miscarriages and birth defects. Moreover, as women age, their risk ...

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To analyze gene regulatory networks active during embryonic development and organogenesis it is essential to precisely define how the different genes are ...

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