Name: dna-magnetic particle binding analysis by dynamic and electrophoretic light scattering
Uploaded: 2017-11-09T15:00:00
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Le soutien financier de la Fondation tchèque pour la Science (projet GA CR 17-12816S) et CEITEC 2020 (LQ1601) est largement reconnu.

1. synthèse de nanoparticules magnétiques <ol><li>synthèse de nanoparticules magnétiques stabilisé avec du citrate (MNPs) <ol><li>Ajouter 20 mmol de FeCl 3 &#8729; 6 H 2 O (5,406 g) et 10 mmol de FeCl 2 &#8729; 4 H 2 O (1,988 g) dans 20 mL d’eau bidistillée désoxygéné (ddd eau). Remuez obtenu solution vigoureusement dans le bécher sous atmosphère de 2 N à l’aide d’un agitateur mécanique jusqu'à l’obtention d’une solution tr...

<ol>
	<li>Kulinski, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+preparation+module+for+bacterial+lysis+and+isolation+of+DNA+from+human+urine.">Sample preparation module for bacterial lysis and isolation of DNA from human urine.</a> Biomed Microdevices. 11 (3), 671-678 (2009).</li><li>Loonen, A. J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Pathogen+DNA+Isolation+Methods+from+Large+Volumes+of+Whole+Blood+to+Improve+Molecular+Diagnosis+of+Bloodstream+Infections.">Comparison of Pathogen DNA Isolation Methods from Large Volumes of Whole Blood to Improve Molecular Diagnosis of Bloodstream Infections.</a> PloS One. 8 (8), (2013).</li><li>Mahmoudi, N., Slater, G. F., Fulthorpe, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+commercial+DNA+extraction+kits+for+isolation+and+purification+of+bacterial+and+eukaryotic+DNA+from+PAH-contaminated+soils.">Comparison of commercial DNA extraction kits for isolation and purification of bacterial and eukaryotic DNA from PAH-contaminated soils.</a> Can J Microbiol. 57 (8), 623-628 (2011).</li><li>Rachmayanti, Y., Leinemann, L., Gailing, O., Finkeldey, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+from+processed+and+unprocessed+wood:+Factors+influencing+the+isolation+success.">DNA from processed and unprocessed wood: Factors influencing the isolation success.</a> Forensic Sci Int Genet. 3 (3), 185-192 (2009).</li><li>Munir, M. T., Umar, S., Shahzad, K. A., Shah, M. 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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+nanoparticles-DNA+interactions:+design+and+applications+of+nanobiohybrid+systems.">Magnetic nanoparticles-DNA interactions: design and applications of nanobiohybrid systems.</a> Rus Chem Rev. 83 (4), 299 (2014).</li><li>Xu, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+nanoparticles+characterization:+Sizing+and+zeta+potential+measurement.">Progress in nanoparticles characterization: Sizing and zeta potential measurement.</a> Particuol. 6 (2), 112-115 (2008).</li><li>Krickl, S., Touraud, D., Kunz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+ethanolamine+stabilized+natural+rubber+latex+from+Taraxacum+kok-saghyz+and+from+Hevea+brasiliensis+using+zeta-potential+and+dynamic+light+scattering+measurements.">Investigation of ethanolamine stabilized natural rubber latex from Taraxacum kok-saghyz and from Hevea brasiliensis using zeta-potential and dynamic light scattering measurements.</a> Ind Crops Prod. 103, 169-174 (2017).</li><li>Haddad, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Isolation+of+DNA+by+Polycharged+Magnetic+Particles:+An+Analysis+of+the+Interaction+by+Zeta+Potential+and+Particle+Size.">The Isolation of DNA by Polycharged Magnetic Particles: An Analysis of the Interaction by Zeta Potential and Particle Size.</a> Int J Mol Sci. 17 (4), (2016).</li><li>Tenorio-Neto, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Submicron+magnetic+core+conducting+polypyrrole+polymer+shell:+Preparation+and+characterization.">Submicron magnetic core conducting polypyrrole polymer shell: Preparation and characterization.</a> Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 61, 688-694 (2016).</li><li>Baharvand, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Encapsulation+of+ferromagnetic+iron+oxide+particles+by+polyester+resin.">Encapsulation of ferromagnetic iron oxide particles by polyester resin.</a> e-Polym. 8 (1), 1-9 (2008).</li><li>Ghorbani, Z., Baharvand, H., Nezhati, M. N., Panahi, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+polymer+particles+modified+with+beta-cyclodextrin.">Magnetic polymer particles modified with beta-cyclodextrin.</a> J Polym Res. 20 (7), (2013).</li><li>Heger, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paramagnetic+Nanoparticles+as+a+Platform+for+FRET-Based+Sarcosine+Picomolar+Detection.">Paramagnetic Nanoparticles as a Platform for FRET-Based Sarcosine Picomolar Detection.</a> Sci Rep. 5, (2015).</li><li>Navarro, E., Serrano-Heras, G., Casta&#241;o, M. J., Solera, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+PCR+detection+chemistry.">Real-time PCR detection chemistry.</a> Clin Chim Acta. 439, 231-250 (2015).</li></ol>

Dans le présent protocole, les principes théoriques qui expliquent la liaison de l’ADN aux particules magnétiques par l’intermédiaire de potentiel zêta étaient sous la question. Le protocole décrit la synthèse et la modification de nanoparticules magnétiques et de microparticules. Procédé de préparation de la solution de contrôle et de la liaison ADN sont également décrites. Deux stratégies sont indiqués ici pour le dépistage des interactions ADN-particules : approches PCR quantitative et listes de...

Isolement d’ADN est une des étapes plus essentiels en biologie moléculaire. Le développement de méthodes d’extraction des acides nucléiques a grand impact sur les domaines émergents de la génomique métagénomique, épigénétique et transcriptomique. Il y a un large éventail d’applications biotechnologiques pour l’isolement de l’ADN y compris médicale (médecine légale/diagnostic tools et biomarqueurs pronostiques) et applications pour l’environnement (biodiversité métagénomique, prévalence de l’agent pathogène et surveillance). Il y a eu une demande croissante de purifier et d’isoler l’ADN de différents matériaux et à des échelles différentes telles que sang, urine, sol, bois et autres types d’échantillons. 1 , 2 , 3 , 4
Nano et micro-particules sont aptes au sectionnement de l’ADN en raison de leur grande surface et en particulier lorsqu’ils peuvent être immobilisés par un champ magnétique. Propriétés physico-chimiques des particules, comme la taille ou la charge, peuvent grandement influencer leur capacité à fixer des cibles de biomolécules. 5 afin de renforcer la liaison des biomolécules et de stabiliser les particules, différentes modifications chimiques (revêtements de surface) peuvent être utilisées. Les nombreuses stratégies différentes pour la liaison sont classés selon les interactions covalentes et non covalents. 6 la taille des particules affecte directement leurs propriétés d’aimantation, considérant que la composition des particules peut être adaptée par l’incorporation de matériaux métalliques, alliage ou autres susceptibles d’influencer sa densité, la porosité et la surface. 7 il n’y aucun moyen fiable pour mesurer la charge de surface des petites particules. Au lieu de cela, le potentiel électrique sur le plan de glissement (certaine distance de la surface des nanoparticules) peut être mesuré. 8 cette valeur s’appelle zeta potentiels et c’est un outil puissant qui est habituellement utilisé pour l’évaluation de la stabilité au moyen de microparticules et de nano - par l’intermédiaire de listes de distribution. 9 étant donné que sa valeur dépend non seulement du pH et de la force ionique du milieu dispersif, mais également sur les caractéristiques de surface des particules, il peut s’avérer les changements dans cette surface causée par l’interaction entre les les particules et la molécule d’intérêt. 10
En revanche, structure de l’ADN sous conditions déshydratés (ADN-ADN A formule) expositions conformations compactée qui facilitent sa précipitation (agrégation) comparativement à couramment survenant forme B-ADN. Électrostatique (ionique et liaison hydrogène) sont les principales forces qui contrôle la liaison d’ADN à d’autres matériaux en raison de leur encombrement stérique accessible phosphate et azote bases (surtout guanine). 7 , 10
Dans cet ouvrage, trois modifications chimiques représentante des nanoparticules magnétiques et les microparticules sont analysées (Figure 1 a). La méthode de synthèse et de la modification chimique des nanoparticules et de microparticules sont décrite. Une solution de liaison, qui accorde aux principes théoriques de la précipitation de l’ADN (pH, force ionique et la déshydratation), sert à évaluer l’élution et la fixation à l’ADN. PCR quantitative est utilisée pour évaluer l’efficacité d’élution de l’ADN des nanoparticules représentatifs et microparticules (Figure 1 b). La taille des particules, l’indice de polydispersité et potentiel zêta sont des paramètres importants qui sont utilisées pour visualiser les modifications physico-chimiques qui se produisent sur la surface des particules (Figure 1). Il est important de mettre l’accent sur la caractérisation chimique de la surface de particules magnétiques. Alors que cette étape était au-delà de la portée du présent protocole, plusieurs techniques modernes peuvent être appliquées pour étudier l’efficacité de modifications chimiques. 11 , 12 , 13 , 14 spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier (FTIR) peut être utilisée pour évaluer le spectre infrarouge de la surface de la particule et la comparer au spectre de modificateurs chimiques libres. Spectrométrie de photoélectrons (XPS) est une autre technique qui peut être utilisée pour identifier la composition élémentaire de la surface du matériau. Autres méthodes spectroscopiques et microscopiques et électrochimiques peuvent servir à faire la lumière sur la qualité de la synthèse de la particule. Ce travail met en évidence une nouvelle perspective à l’analyse des interactions ADN-magnétiques de particules par l’intermédiaire de listes de distribution.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Iron(III) chloride hexahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>207926</td>
			<td>Magnetic particle synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron(II) chloride tetrahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>380024</td>
			<td>Magnetic particle synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron(II) sulfate heptahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F8263</td>
			<td>Magnetic particle synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Penta</td>
			<td>10060-11000</td>
			<td>Magnetic particle synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W302600</td>
			<td>Magnetic particle synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetraethyl orthosilicate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>131903</td>
			<td>Magnetic particle synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(3-Aminopropyl)triethoxysilane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>440140</td>
			<td>Magnetic particle synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine, branched, average Mw ~25,000</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>408727</td>
			<td>Magnetic particle synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium hydroxide solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>221228-M&#160;</td>
			<td>Magnetic particle synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Penta</td>
			<td>71250-11000</td>
			<td>Magnetic particle synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium nitrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6083</td>
			<td>Magnetic particle synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1.05012</td>
			<td>Magnetic particle synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ow-molecular-weight cut-off membrane (Mw=1 kDa)</td>
			<td>Spectrum labs</td>
			<td>G235063</td>
			<td>Magnetic particle synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Overhead Stirrer</td>
			<td>witeg Labortechnik GmbH</td>
			<td>DH.WOS01035</td>
			<td>Magnetic particle synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waterbath</td>
			<td>Memmert GmbH + Co.</td>
			<td>84198998</td>
			<td>Magnetic particle synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Bandelin</td>
			<td>795</td>
			<td>Magnetic particle synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BRAND UV cuvette micro</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>BR759200-100EA</td>
			<td>Cuvette for size measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BRAND cap for UV-cuvette micro</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>BR759240-100EA</td>
			<td>Cuvette caps for size measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folded Capillary Zeta Cell</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>DTS1070</td>
			<td>Cuvette for zeta potential measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zetasizer Nano ZS</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>ZEN3600</td>
			<td>Device for measurement of size and zeta potential</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infinite 200 PRO 
			NanoQuant instrument</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>396 227 V1.0, 04-2010</td>
			<td>device for measurement of DNA concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Green Quantitative RT-PCR Kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>QR0100</td>
			<td>PCR kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mastercycler pro S instrument</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>6325 000.013</td>
			<td>Thermocycler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MinElute kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28004</td>
			<td>DNA purification kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7670</td>
			<td>DNA binding</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dna-magnetic particle binding analysis by dynamic and electrophoretic light scattering

Isolement de l’ADN à l’aide de particules magnétiques est un domaine de grande importance dans la recherche de biotechnologie et biologie moléculaire. Ce protocole décrit l’évaluation de particules magnétiques ADN liaison via la diffusion de la lumière dynamique (DLS) et diffusion de la lumière électrophorétique (ELS). Analyse par DLS fournit des renseignements précieux sur les propriétés physico-chimiques des particules dont la taille des particules et polydispersité potentiel zêta. Ce dernier décrit la charge de surface de la particule qui joue le rôle majeur dans la liaison électrostatique de matériaux tels que de l’ADN. Ici, une analyse comparative exploite trois modifications chimiques des nanoparticules et de microparticules et de leurs effets sur l’attache d’ADN et d’élution. Modifications chimiques de ramifié polyéthylènimine, triéthoxysilane (3-aminopropyl) et de l’orthosilicate de tétraéthyle sont l’objet d’une enquête. Puisque l’ADN montre une charge négative, il est prévu que potentiel zêta de surface de la particule diminue lors de la liaison de l’ADN. Formant des grappes devrait également affecter la taille des particules. Afin d’étudier l’efficacité de ces particules dans l’isolement et l’élution de l’ADN, les particules sont mélangés avec de l’ADN dans pH faible (~ 6), force ionique élevée et environnement de la déshydratation. Les particules sont lavés sur aimant et ensuite l’ADN est éluée par tampon Tris-HCl (pH = 8). Nombre de copies d’ADN est estimée à l’aide de la PCR quantitative (PCR). Potentiel zêta, granulométrie, polydispersité et données quantitatives de PCR sont évaluées et comparées. DLS est un perspicace et méthode d’analyse qui ajoute une nouvelle perspective au processus de projection de particules pour l’isolement de l’ADN.

En utilisant le protocole décrit ici pour synthèse chimique et la modification des particules magnétiques, six des particules magnétiques ont été synthétisés et analysés pour fixation à l’ADN. Un résumé de l’analyse est indiqué dans le tableau 1. En comparant la taille des particules dans l’eau et en solution de liaison, il est clair que toutes les particules agrégées dans solution de liaison par des plis de 2-22. Certaines particules plus regroupées...

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DNA-magnetic Particle Binding Analysis by Dynamic and Electrophoretic Light Scattering

Ce protocole décrit la synthèse de particules magnétiques et évaluation de leurs propriétés de liaison à l’ADN par l’intermédiaire de diffusion de la lumière dynamique et électrophorétique. Cette méthode met l’accent sur la surveillance des changements dans la taille des particules, leur polydispersité et major de potentiel zêta de surface de particules qui jouent rôle dans la fixation des matières telles que l’ADN.

ADN-magnétoscopie liaison analyse par diffusion de la lumière dynamique et électrophorèse

Isolation of DNA using magnetic particles is a field of high importance in biotechnology and molecular biology research. This protocol describes the ...

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