Name: dna-magnetic particle binding analysis by dynamic and electrophoretic light scattering
Uploaded: 2017-11-09T15:00:00
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Die finanzielle Unterstützung von tschechischen Wissenschaftsstiftung (GA CR 17-12816S-Projekt) und CEITEC 2020 (LQ1601) ist sehr anerkannt.

1. magnetische Nanopartikel-Synthese <ol><li><ol><li>fügen Sie 20 Mmol FeCl 3 Synthese von magnetischen Nanopartikeln mit Citrat (MNPs) stabilisiert &#8729; 6 H 2 O (5,406 g) und 10 Mmol FeCl 2 &#8729; 4 H 2 O-(1,988 g) in 20 mL sauerstoffarmes doppelt destilliertes Wasser (Ddd). Rühren, die Lösung kräftig im Becherglas unter N 2 Atmosphäre mit einem mechanischen Rührwerk bis eine transparente Lösung erzielt wird.</li>
		<li>Unter schnelle ...

<ol>
	<li>Kulinski, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+preparation+module+for+bacterial+lysis+and+isolation+of+DNA+from+human+urine.">Sample preparation module for bacterial lysis and isolation of DNA from human urine.</a> Biomed Microdevices. 11 (3), 671-678 (2009).</li><li>Loonen, A. J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Pathogen+DNA+Isolation+Methods+from+Large+Volumes+of+Whole+Blood+to+Improve+Molecular+Diagnosis+of+Bloodstream+Infections.">Comparison of Pathogen DNA Isolation Methods from Large Volumes of Whole Blood to Improve Molecular Diagnosis of Bloodstream Infections.</a> PloS One. 8 (8), (2013).</li><li>Mahmoudi, N., Slater, G. F., Fulthorpe, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+commercial+DNA+extraction+kits+for+isolation+and+purification+of+bacterial+and+eukaryotic+DNA+from+PAH-contaminated+soils.">Comparison of commercial DNA extraction kits for isolation and purification of bacterial and eukaryotic DNA from PAH-contaminated soils.</a> Can J Microbiol. 57 (8), 623-628 (2011).</li><li>Rachmayanti, Y., Leinemann, L., Gailing, O., Finkeldey, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+from+processed+and+unprocessed+wood:+Factors+influencing+the+isolation+success.">DNA from processed and unprocessed wood: Factors influencing the isolation success.</a> Forensic Sci Int Genet. 3 (3), 185-192 (2009).</li><li>Munir, M. T., Umar, S., Shahzad, K. A., Shah, M. 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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+nanoparticles-DNA+interactions:+design+and+applications+of+nanobiohybrid+systems.">Magnetic nanoparticles-DNA interactions: design and applications of nanobiohybrid systems.</a> Rus Chem Rev. 83 (4), 299 (2014).</li><li>Xu, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+nanoparticles+characterization:+Sizing+and+zeta+potential+measurement.">Progress in nanoparticles characterization: Sizing and zeta potential measurement.</a> Particuol. 6 (2), 112-115 (2008).</li><li>Krickl, S., Touraud, D., Kunz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+ethanolamine+stabilized+natural+rubber+latex+from+Taraxacum+kok-saghyz+and+from+Hevea+brasiliensis+using+zeta-potential+and+dynamic+light+scattering+measurements.">Investigation of ethanolamine stabilized natural rubber latex from Taraxacum kok-saghyz and from Hevea brasiliensis using zeta-potential and dynamic light scattering measurements.</a> Ind Crops Prod. 103, 169-174 (2017).</li><li>Haddad, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Isolation+of+DNA+by+Polycharged+Magnetic+Particles:+An+Analysis+of+the+Interaction+by+Zeta+Potential+and+Particle+Size.">The Isolation of DNA by Polycharged Magnetic Particles: An Analysis of the Interaction by Zeta Potential and Particle Size.</a> Int J Mol Sci. 17 (4), (2016).</li><li>Tenorio-Neto, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Submicron+magnetic+core+conducting+polypyrrole+polymer+shell:+Preparation+and+characterization.">Submicron magnetic core conducting polypyrrole polymer shell: Preparation and characterization.</a> Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 61, 688-694 (2016).</li><li>Baharvand, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Encapsulation+of+ferromagnetic+iron+oxide+particles+by+polyester+resin.">Encapsulation of ferromagnetic iron oxide particles by polyester resin.</a> e-Polym. 8 (1), 1-9 (2008).</li><li>Ghorbani, Z., Baharvand, H., Nezhati, M. N., Panahi, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+polymer+particles+modified+with+beta-cyclodextrin.">Magnetic polymer particles modified with beta-cyclodextrin.</a> J Polym Res. 20 (7), (2013).</li><li>Heger, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paramagnetic+Nanoparticles+as+a+Platform+for+FRET-Based+Sarcosine+Picomolar+Detection.">Paramagnetic Nanoparticles as a Platform for FRET-Based Sarcosine Picomolar Detection.</a> Sci Rep. 5, (2015).</li><li>Navarro, E., Serrano-Heras, G., Casta&#241;o, M. J., Solera, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+PCR+detection+chemistry.">Real-time PCR detection chemistry.</a> Clin Chim Acta. 439, 231-250 (2015).</li></ol>

In diesem Protokoll wurden die theoretischen Grundlagen, die DNA-Bindung an Magnetpartikel über das Zetapotenzial erklären in Frage gestellt. Das Protokoll beschreibt die Synthese und Modifizierung von magnetischen Nanopartikeln und Mikropartikel. Methode für die Erstellung von DNA-Kontrolle und verbindliche Lösung werden ebenfalls beschrieben. Zwei Strategien sind hier für das Screening der DNA-Partikel-Wechselwirkungen gezeigt: quantitative PCR und DLS nähert. DLS bietet drei Indikatoren für die physikalisch-che...

DNA-Isolierung ist einer der wichtigsten Schritte in der molekularen Biologie. Die Entwicklung von Nukleinsäure-Extraktionsmethoden hat großen Einfluss auf den aufstrebenden Bereichen Genomik, Metagenomik, Epigenetik und Transkriptom. Es gibt eine Vielzahl von biotechnologischen Anwendungen für die DNA-Isolierung einschließlich medizinische (forensische/Diagnose-Tools und prognostische Biomarker) und Umweltanwendungen (metagenomische Biodiversität, Erreger Prävalenz und Überwachung). Steigende Nachfrage, zu reinigen und DNA zu isolieren, aus verschiedenen Materialien und in unterschiedlichen Maßstäben wie Blut, Urin, Boden, Holz und andere Arten von Proben stattgefunden hat. 1 , 2 , 3 , 4
Und Mikro-Nanopartikel eignen sich für DNA-Isolierung aufgrund ihrer großen Oberfläche und vor allem, wenn sie durch ein Magnetfeld immobilisiert werden können. Physikalisch-chemischen Eigenschaften der Partikel, z. B. Größe oder Ladung, können großen Einfluss auf ihre Fähigkeit, Ziel Biomoleküle zu binden. 5 zur weiteren Verbesserung Bindung von Biomolekülen und Partikel zu stabilisieren, können verschiedene chemische Modifikationen (Oberflächenbeschichtung) genutzt werden. Viele verschiedenen Strategien für die Bindung sind nach kovalente und nicht-kovalente Wechselwirkungen klassifiziert. 6 die Größe der Partikel wirkt sich direkt auf ihre Magnetisierung Eigenschaften, während Partikelzusammensetzung zugeschnitten werden kann, durch Einbau von Metall, Legierung oder andere Materialien, die Dichte, Porosität und Oberfläche beeinflussen können. 7 gibt es keine zuverlässige Möglichkeit, Oberflächenladung kleiner Teilchen zu messen. Stattdessen kann elektrische Potential an das Verrutschen Flugzeug (einiger Entfernung von Nanopartikel-Oberfläche) gemessen werden. 8 dieser Wert heißt Zeta potential und es ist ein starkes Werkzeug, die in der Regel für die Bewertung von Nano- und Mikropartikel Stabilität über DLS verwendet wird. 9 da sein Wert hängt nicht nur der pH-Wert und die Ionenstärke der dispersive Umwelt, sondern auch auf die Oberflächenbeschaffenheit der Partikel ist, es kann auch zu beweisen die Änderungen in dieser Oberfläche, verursacht durch die Wechselwirkung zwischen den Partikel und Molekül des Interesses. 10
Auf der anderen Seite vorkommenden DNA-Struktur in trockene Bedingungen (A-DNA Form) Exponate verdichteten Konformationen, die seinen Niederschlag (Aggregation) ermöglichen im Vergleich zu häufig B-DNA-Form. Elektrostatische (Ionische und H-Bindung) sind die wichtigsten Kräfte kontrollieren die Bindung von DNA an anderen Materialien aufgrund ihrer sterisch zugänglich Phosphat und Stickstoff Basen (besonders Guanin). 7 , 10
In dieser Arbeit werden drei repräsentative chemische Modifikationen von magnetischen Nanopartikeln und Mikropartikel analysiert (Abbildung 1A). Die Methode der Synthese und chemische Modifikation von Nanopartikeln und Mikropartikel werden beschrieben. Eine verbindliche Lösung, dieses Abkommen zu theoretischen Grundlagen der DNA Niederschlag (pH-Wert, Ionenstärke und Dehydrierung), wird verwendet, um DNA-Bindung und Elution zu bewerten. Quantitative PCR wird verwendet, um die Effizienz der Elution der DNA aus dem repräsentativen Nanopartikel und Mikropartikel (Abbildung 1 b) bewerten. Partikelgröße, Polydispersität Index und Zetapotenzial sind wichtige Parameter, die verwendet werden, um die physikalisch-chemischen Veränderungen zu visualisieren, die auf der Partikeloberfläche (Abbildung 1) auftreten. Es ist wichtig zu betonen, auf die chemische Charakterisierung der Magnetpartikel Oberfläche. Während dieser Schritt würde den Rahmen dieses Protokolls war, können mehrere moderne Techniken angewendet werden, um die Effizienz der chemischen Veränderungen zu untersuchen. 11 , 12 , 13 , 14 Fourier Transform Infrarotspektroskopie (FTIR) lässt sich das Infrarotspektrum der Partikeloberfläche zu bewerten und vergleichen Sie es mit dem Spektrum der freien chemische Modifikatoren. Röntgen-Photoelektronen-Spektroskopie (XPS) ist eine weitere Technik, die verwendet werden kann, um die elementare Zusammensetzung der Materialoberfläche zu identifizieren. Anderen elektrochemischen, mikroskopische und spektroskopischen Methoden können verwendet werden, die Aufschluss über die Qualität der Partikelsynthese. Diese Arbeit zeigt eine neue Perspektive für die Analyse von DNA-magnetische Partikel Interaktionen über DLS.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Iron(III) chloride hexahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>207926</td>
			<td>Magnetic particle synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron(II) chloride tetrahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>380024</td>
			<td>Magnetic particle synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron(II) sulfate heptahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F8263</td>
			<td>Magnetic particle synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Penta</td>
			<td>10060-11000</td>
			<td>Magnetic particle synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W302600</td>
			<td>Magnetic particle synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetraethyl orthosilicate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>131903</td>
			<td>Magnetic particle synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(3-Aminopropyl)triethoxysilane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>440140</td>
			<td>Magnetic particle synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine, branched, average Mw ~25,000</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>408727</td>
			<td>Magnetic particle synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium hydroxide solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>221228-M&#160;</td>
			<td>Magnetic particle synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Penta</td>
			<td>71250-11000</td>
			<td>Magnetic particle synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium nitrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6083</td>
			<td>Magnetic particle synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1.05012</td>
			<td>Magnetic particle synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ow-molecular-weight cut-off membrane (Mw=1 kDa)</td>
			<td>Spectrum labs</td>
			<td>G235063</td>
			<td>Magnetic particle synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Overhead Stirrer</td>
			<td>witeg Labortechnik GmbH</td>
			<td>DH.WOS01035</td>
			<td>Magnetic particle synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waterbath</td>
			<td>Memmert GmbH + Co.</td>
			<td>84198998</td>
			<td>Magnetic particle synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Bandelin</td>
			<td>795</td>
			<td>Magnetic particle synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BRAND UV cuvette micro</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>BR759200-100EA</td>
			<td>Cuvette for size measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BRAND cap for UV-cuvette micro</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>BR759240-100EA</td>
			<td>Cuvette caps for size measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folded Capillary Zeta Cell</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>DTS1070</td>
			<td>Cuvette for zeta potential measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zetasizer Nano ZS</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>ZEN3600</td>
			<td>Device for measurement of size and zeta potential</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infinite 200 PRO 
			NanoQuant instrument</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>396 227 V1.0, 04-2010</td>
			<td>device for measurement of DNA concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Green Quantitative RT-PCR Kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>QR0100</td>
			<td>PCR kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mastercycler pro S instrument</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>6325 000.013</td>
			<td>Thermocycler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MinElute kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28004</td>
			<td>DNA purification kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7670</td>
			<td>DNA binding</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dna-magnetic particle binding analysis by dynamic and electrophoretic light scattering

Isolierung der DNA mit Hilfe magnetischer Partikel ist ein Feld von hoher Bedeutung in der Biotechnologie und Molekularbiologie. Dieses Protokoll beschreibt die Auswertung der DNA-Magnetteilchen über dynamische Lichtstreuung (DLS) und elektrophoretische Lichtstreuung (ELS) verbindlich. Analyse von DLS liefert wertvolle Informationen über die physikalisch-chemischen Eigenschaften der Partikel wie Partikelgröße, Polydispersität und Zetapotenzial. Letzterer beschreibt die Oberflächenladung des Teilchens die Hauptrolle in elektrostatische Bindung von Materialien wie DNA spielt. Eine vergleichende Analyse nutzt hier drei chemische Modifikationen von Nanopartikeln und Mikropartikel und ihre Auswirkungen auf die DNA-Bindung und Elution. Chemische Veränderungen durch verzweigte Polyethylenimine, Tetraethylblei Orthosilicate und (3-Aminopropyl) Triethoxysilane untersucht werden. Da DNA eine negative Ladung aufweist, ist zu erwarten, dass Zeta-Potential der Partikeloberfläche bei der Bindung von DNA sinkt. Bildung von Clustern sollte auch Auswirkungen auf die Partikelgröße. Um die Effizienz dieser Partikel isoliert und Elution der DNA zu untersuchen, werden die Partikel mit DNA in niedrigen pH-Wert (~ 6), hohe Ionenstärke und Dehydrierung Umwelt gemischt. Partikel werden auf Magneten gewaschen und dann ist die DNA von Tris-HCl-Puffer eluiert (pH = 8). DNA-Kopienzahl ist anhand quantitativer Polymerase-Kettenreaktion (PCR) geschätzt. Zeta-Potential, Partikelgröße, Polydispersität und quantitative PCR-Daten werden ausgewertet und verglichen. DLS ist eine aufschlussreiche und die Unterstützung der Analysemethode, die eine neue Perspektive auf den Prozess der Überprüfung der Partikel für die DNA-Isolierung hinzufügt.

Über das Protokoll beschriebenen chemischen Synthese und Modifizierung der Magnetpartikel, wurden sechs magnetische Partikel synthetisiert und analysiert für DNA-Bindung. Eine Zusammenfassung der Analyse ist in Tabelle 1dargestellt. Durch den Vergleich der Partikelgröße im Wasser und in verbindliche Lösung, ist es klar, dass alle Partikel in verbindlichen Lösung durch 2-22 Falten aggregiert. Einige Partikel weiter zu mehr Falten im Beisein von DNA aggregiert; jedoch...

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DNA-magnetic Particle Binding Analysis by Dynamic and Electrophoretic Light Scattering

Dieses Protokoll beschreibt die Synthese von magnetischen Partikeln und Bewertung ihrer DNA-bindende Eigenschaften über dynamische und elektrophoretische Lichtstreuung. Diese Methode konzentriert sich auf die Überwachung von Änderungen der Partikelgröße, ihre Polydispersität und Zeta-Potential der Partikeloberfläche die spielen wichtige Rolle bei der Bindung von Materialien wie DNA.

DNA-Magnetpartikel verbindlich Analyse durch dynamische und elektrophoretische Lichtstreuung

Isolation of DNA using magnetic particles is a field of high importance in biotechnology and molecular biology research. This protocol describes the ...

Research

JoVE Journal

Chemistry

Determining the Ice-binding Planes of Antifreeze Proteins by Fluorescence-based Ice Plane Affinity

Bestimmung der eisbindenden Ebenen von Frostschutzproteinen durch Fluoreszenzbasierte Eisebene Affinität

Antifreeze proteins (AFPs) are expressed in a variety of cold-hardy organisms to prevent or slow internal ice growth. AFPs bind to specific planes of ice ...

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Light-driven Enzymatic Decarboxylation

Lichtgetriebene enzymatische Decarboxylierung

Oxidoreductases belong to the most-applied industrial enzymes. Nevertheless, they need external electrons whose supply is often costly and challenging. ...

Dissolution Dynamic Nuclear Polarization Instrumentation for Real-time Enzymatic Reaction Rate Measurements by NMR

Die Auflösung dynamische Kernpolarisation Besetzung für Echtzeit-enzymatische Reaktionsgeschwindigkeit Messungen von NMR

The main limitation of NMR-based investigations is low sensitivity. This prompts for long acquisition times, thus preventing real-time NMR measurements of ...

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Microfluidic Chips for In Situ Crystal X-ray Diffraction and In Situ Dynamic Light Scattering for Serial Crystallography

Microfluidic Chips for In Situ Crystal X-ray Diffraction and In Situ Dynamic Light Scattering for Serial Crystallography

Mikrofluidische Chips für In Situ Crystal-Röntgenbeugung und In Situ dynamische Lichtstreuung für serielle Kristallographie

This protocol describes fabricating microfluidic devices with low X-ray background optimized for goniometer based fixed target serial crystallography. The ...

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Energy storage has become more and more a limiting factor of today's sustainable energy applications, including electric vehicles and green electric grid ...

Luminophore Formation in Various Conformations of Bovine Serum Albumin by Binding of Gold(III)

Luminophore Formation in Various Conformations of Bovine Serum Albumin by Binding of GoldIII

Luminophor Bildung in verschiedenen Konformationen von Rinderserumalbumin durch Bindung von Gold(III)

The purpose of the presented protocols is to study the process of Au(III) binding to BSA, yielding conformation change-induced red fluorescence (&#955;em ...