Name: dna-magnetic particle binding analysis by dynamic and electrophoretic light scattering
Uploaded: 2017-11-09T15:00:00
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Il sostegno finanziario dalla ceca Science Foundation (progetto GA CR 17-12816S) e CEITEC 2020 (LQ1601) notevolmente è riconosciuto.

1. sintesi di nanoparticelle magnetiche <ol><li>sintesi di nanoparticelle magnetiche stabilizzato con citrato (MNPs) <ol><li>aggiungere 20 mmol di FeCl 3 &#8729; 6 H 2 O (5,406 g) e 10 mmol di FeCl 2 &#8729; 4 H 2 O (1,988 g) in 20 mL di acqua distillata doppia deossigenata (ddd acqua). Mescolare ottenuti soluzione vigorosamente in Becher sotto atmosfera di 2 N tramite agitatore meccanico fino ad ottenuta una soluzione trasparente.</li>
		<li>Sott...

<ol>
	<li>Kulinski, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+preparation+module+for+bacterial+lysis+and+isolation+of+DNA+from+human+urine.">Sample preparation module for bacterial lysis and isolation of DNA from human urine.</a> Biomed Microdevices. 11 (3), 671-678 (2009).</li><li>Loonen, A. J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Pathogen+DNA+Isolation+Methods+from+Large+Volumes+of+Whole+Blood+to+Improve+Molecular+Diagnosis+of+Bloodstream+Infections.">Comparison of Pathogen DNA Isolation Methods from Large Volumes of Whole Blood to Improve Molecular Diagnosis of Bloodstream Infections.</a> PloS One. 8 (8), (2013).</li><li>Mahmoudi, N., Slater, G. F., Fulthorpe, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+commercial+DNA+extraction+kits+for+isolation+and+purification+of+bacterial+and+eukaryotic+DNA+from+PAH-contaminated+soils.">Comparison of commercial DNA extraction kits for isolation and purification of bacterial and eukaryotic DNA from PAH-contaminated soils.</a> Can J Microbiol. 57 (8), 623-628 (2011).</li><li>Rachmayanti, Y., Leinemann, L., Gailing, O., Finkeldey, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+from+processed+and+unprocessed+wood:+Factors+influencing+the+isolation+success.">DNA from processed and unprocessed wood: Factors influencing the isolation success.</a> Forensic Sci Int Genet. 3 (3), 185-192 (2009).</li><li>Munir, M. T., Umar, S., Shahzad, K. A., Shah, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+of+Magnetic+Nanoparticles+for+Hepatitis+B+Virus+Detection.">Potential of Magnetic Nanoparticles for Hepatitis B Virus Detection.</a> J Nanosci Nanotechnol. 16 (12), 12112-12123 (2016).</li><li>Ulbrich, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+drug+delivery+with+polymers+and+magnetic+nanoparticles:+covalent+and+noncovalent+approaches,+release+control,+and+clinical+studies.">Targeted drug delivery with polymers and magnetic nanoparticles: covalent and noncovalent approaches, release control, and clinical studies.</a> Chem Rev. 116 (9), 5338-5431 (2016).</li><li>Pershina, A. G., Sazonov, A. E., Filimonov, V. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+nanoparticles-DNA+interactions:+design+and+applications+of+nanobiohybrid+systems.">Magnetic nanoparticles-DNA interactions: design and applications of nanobiohybrid systems.</a> Rus Chem Rev. 83 (4), 299 (2014).</li><li>Xu, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+nanoparticles+characterization:+Sizing+and+zeta+potential+measurement.">Progress in nanoparticles characterization: Sizing and zeta potential measurement.</a> Particuol. 6 (2), 112-115 (2008).</li><li>Krickl, S., Touraud, D., Kunz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+ethanolamine+stabilized+natural+rubber+latex+from+Taraxacum+kok-saghyz+and+from+Hevea+brasiliensis+using+zeta-potential+and+dynamic+light+scattering+measurements.">Investigation of ethanolamine stabilized natural rubber latex from Taraxacum kok-saghyz and from Hevea brasiliensis using zeta-potential and dynamic light scattering measurements.</a> Ind Crops Prod. 103, 169-174 (2017).</li><li>Haddad, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Isolation+of+DNA+by+Polycharged+Magnetic+Particles:+An+Analysis+of+the+Interaction+by+Zeta+Potential+and+Particle+Size.">The Isolation of DNA by Polycharged Magnetic Particles: An Analysis of the Interaction by Zeta Potential and Particle Size.</a> Int J Mol Sci. 17 (4), (2016).</li><li>Tenorio-Neto, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Submicron+magnetic+core+conducting+polypyrrole+polymer+shell:+Preparation+and+characterization.">Submicron magnetic core conducting polypyrrole polymer shell: Preparation and characterization.</a> Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 61, 688-694 (2016).</li><li>Baharvand, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Encapsulation+of+ferromagnetic+iron+oxide+particles+by+polyester+resin.">Encapsulation of ferromagnetic iron oxide particles by polyester resin.</a> e-Polym. 8 (1), 1-9 (2008).</li><li>Ghorbani, Z., Baharvand, H., Nezhati, M. N., Panahi, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+polymer+particles+modified+with+beta-cyclodextrin.">Magnetic polymer particles modified with beta-cyclodextrin.</a> J Polym Res. 20 (7), (2013).</li><li>Heger, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paramagnetic+Nanoparticles+as+a+Platform+for+FRET-Based+Sarcosine+Picomolar+Detection.">Paramagnetic Nanoparticles as a Platform for FRET-Based Sarcosine Picomolar Detection.</a> Sci Rep. 5, (2015).</li><li>Navarro, E., Serrano-Heras, G., Casta&#241;o, M. J., Solera, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+PCR+detection+chemistry.">Real-time PCR detection chemistry.</a> Clin Chim Acta. 439, 231-250 (2015).</li></ol>

In questo protocollo, i principi teorici che spiegano il legame al DNA di particelle magnetiche via potenziale zeta erano sotto la domanda. Il protocollo descrive la sintesi e la modifica di nanoparticelle magnetiche e microparticelle. Metodo per la preparazione della soluzione di controllo e l'associazione del DNA inoltre sono descritti. Due strategie sono mostrate qui per lo screening delle interazioni DNA-particella: PCR quantitativa e liste di distribuzione si avvicina. DLS fornisce tre indicatori di cambiamenti fisi...

Isolamento del DNA è uno dei passi più importanti nella biologia molecolare. Lo sviluppo di metodi di estrazione dell'acido nucleico ha grande impatto sui campi emergenti della genomica, metagenomica, epigenetica e trascrittomica. C'è una vasta gamma di applicazioni biotecnologiche per isolamento del DNA compreso medico (strumenti forensi/diagnostica e biomarcatori prognostici) e applicazioni ambientali (biodiversità metagenomica, la prevalenza del patogeno e sorveglianza). C'è stata la crescente domanda di purificare e isolare il DNA da materiali diversi e in diverse scale come sangue, urina, terra, legno e altri tipi di campioni. 1 , 2 , 3 , 4
Particelle di nano - e micro-imprese sono adatte per isolamento del DNA a causa della loro elevata area superficiale e in particolare quando essi possono essere immobilizzati da un campo magnetico. Proprietà fisico-chimiche delle particelle, ad esempio dimensioni o carica, può notevolmente influenzare la loro capacità di legare biomolecole di destinazione. 5 per migliorare ulteriormente l'associazione di biomolecole e stabilizzare le particelle, diverse modificazioni chimiche (rivestimenti superficiali) possono essere utilizzati. Le diverse strategie per l'associazione sono classificate secondo le interazioni covalenti e non covalenti. 6 la dimensione delle particelle influenza direttamente la loro proprietà di magnetizzazione, considerando che la composizione delle particelle può essere adattato per incorporazione di metallico, lega o altri materiali che possono influire sulla sua densità, porosità e superficie. 7 non c'è alcun modo affidabile per misurare la carica superficiale di piccole particelle. Invece, il potenziale elettrico piano di scivolamento (certa distanza dalla superficie delle nanoparticelle) può essere misurata. 8 questo valore è chiamato potenziale zeta ed è un potente strumento che solitamente utilizzato per la valutazione della stabilità di nano e microparticelle tramite liste di distribuzione. 9 poiché il suo valore dipende non solo il pH e forza ionica dell'ambiente dispersivo, ma anche le caratteristiche della superficie delle particelle, può anche dimostrare i cambiamenti in questa superficie causata dall'interazione tra la particelle e molecola di interesse. 10
D'altra parte, la struttura del DNA in condizioni disidratate (modulo A-DNA) esposizioni compattato conformazioni che facilitano la relativa precipitazione (aggregazione) rispetto a comunemente che si verificano forma B-DNA. Elettrostatica (ionico e H-bond) sono le principali forze che controllano l'associazione del DNA da altri materiali a causa di loro fosfato stericamente accessibile e azoto basi (in particolare guanina). 7 , 10
In questo lavoro, sono analizzate tre modifiche chimiche rappresentative di nanoparticelle magnetiche e microparticelle (Figura 1A). Il metodo di sintesi e modificazione chimica di nanoparticelle e microparticelle è descritto. Una soluzione di associazione, che accordi ai principi teorici di precipitazione del DNA (pH, forza ionica e disidratazione), viene utilizzata per valutare l'eluizione e grippaggio del DNA. PCR quantitativa viene utilizzata per valutare l'efficienza di eluizione del DNA dalla rappresentante nanoparticelle e microparticelle (Figura 1B). Dimensione delle particelle, l'indice di polidispersione e potenziale zeta sono parametri importanti che vengono utilizzati per visualizzare le modifiche fisico-chimiche che si verificano sulla superficie della particella (Figura 1). È importante sottolineare la caratterizzazione chimica della superficie della particella magnetica. Mentre questo passaggio era oltre l'ambito del presente protocollo, diverse moderne tecniche possono essere applicate per studiare l'efficienza delle modificazioni chimiche. 11 , 12 , 13 , 14 spettroscopia infrarossa trasformata di Fourier (FTIR) può essere utilizzata per valutare lo spettro infrarosso della superficie della particella e confrontarlo con lo spettro dei modificatori chimici gratis. Spettroscopia fotoelettronica a raggi x (XPS) è un'altra tecnica che può essere utilizzata per identificare la composizione elementare della superficie del materiale. Altri metodi elettrochimici, microscopiche e spettroscopiche utilizzabile per far luce sulla qualità della sintesi delle particelle. Questo lavoro evidenzia una nuova prospettiva per l'analisi di interazioni DNA-magnetiche di particelle tramite liste di distribuzione.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Iron(III) chloride hexahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>207926</td>
			<td>Magnetic particle synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron(II) chloride tetrahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>380024</td>
			<td>Magnetic particle synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron(II) sulfate heptahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F8263</td>
			<td>Magnetic particle synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Penta</td>
			<td>10060-11000</td>
			<td>Magnetic particle synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W302600</td>
			<td>Magnetic particle synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetraethyl orthosilicate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>131903</td>
			<td>Magnetic particle synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(3-Aminopropyl)triethoxysilane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>440140</td>
			<td>Magnetic particle synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine, branched, average Mw ~25,000</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>408727</td>
			<td>Magnetic particle synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium hydroxide solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>221228-M&#160;</td>
			<td>Magnetic particle synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Penta</td>
			<td>71250-11000</td>
			<td>Magnetic particle synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium nitrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6083</td>
			<td>Magnetic particle synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1.05012</td>
			<td>Magnetic particle synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ow-molecular-weight cut-off membrane (Mw=1 kDa)</td>
			<td>Spectrum labs</td>
			<td>G235063</td>
			<td>Magnetic particle synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Overhead Stirrer</td>
			<td>witeg Labortechnik GmbH</td>
			<td>DH.WOS01035</td>
			<td>Magnetic particle synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waterbath</td>
			<td>Memmert GmbH + Co.</td>
			<td>84198998</td>
			<td>Magnetic particle synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Bandelin</td>
			<td>795</td>
			<td>Magnetic particle synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BRAND UV cuvette micro</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>BR759200-100EA</td>
			<td>Cuvette for size measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BRAND cap for UV-cuvette micro</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>BR759240-100EA</td>
			<td>Cuvette caps for size measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folded Capillary Zeta Cell</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>DTS1070</td>
			<td>Cuvette for zeta potential measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zetasizer Nano ZS</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>ZEN3600</td>
			<td>Device for measurement of size and zeta potential</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infinite 200 PRO 
			NanoQuant instrument</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>396 227 V1.0, 04-2010</td>
			<td>device for measurement of DNA concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Green Quantitative RT-PCR Kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>QR0100</td>
			<td>PCR kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mastercycler pro S instrument</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>6325 000.013</td>
			<td>Thermocycler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MinElute kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28004</td>
			<td>DNA purification kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7670</td>
			<td>DNA binding</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dna-magnetic particle binding analysis by dynamic and electrophoretic light scattering

Isolamento di DNA usando particelle magnetiche è un campo di grande importanza nella ricerca di biologia molecolare e biotecnologia. Questo protocollo descrive la valutazione del DNA-magnetoscopico vincolante tramite diffusione dinamica della luce (DLS) e dispersione della luce elettroforetica (ELS). Analisi di DLS fornisce preziose informazioni sulle proprietà fisico-chimiche delle particelle tra cui la dimensione delle particelle, polidispersità e potenziale zeta. Quest'ultimo descrive la carica superficiale della particella che svolge un ruolo importante nell'associazione elettrostatica di materiali come il DNA. Qui, un'analisi comparativa sfrutta tre modifiche chimiche di nanoparticelle e microparticelle e loro effetti sul legame del DNA e di eluizione. Modificazioni chimiche di ramificata polyethylenimine, tetraetile ortosilicato e (3-amminopropil) trietossisilano sono studiati. Poiché DNA esibisce una carica negativa, si prevede che il potenziale zeta della superficie della particella diminuirà legandosi di DNA. Formando dei cluster dovrebbe essere estesa anche dimensione delle particelle. Al fine di indagare l'efficacia di queste particelle in isolamento ed eluizione del DNA, le particelle sono mescolate con DNA a basso pH (~ 6), alta forza ionica e ambiente di disidratazione. Le particelle vengono lavate il magnete e quindi il DNA è eluito dal tampone Tris-HCl (pH = 8). Numero di copie di DNA è stimato usando reazione a catena quantitativa della polimerasi (PCR). Potenziale Zeta, dimensione delle particelle, polidispersità e dati quantitativi di PCR sono valutati e confrontati. DLS è un perspicace e sostenere il metodo di analisi che aggiunge una nuova prospettiva al processo di proiezione di particelle per isolamento del DNA.

Mediante il protocollo descritto qui per sintesi chimica e la modifica delle particelle magnetiche, sei particelle magnetiche sono state sintetizzate e analizzate per il grippaggio del DNA. Una sintesi dell'analisi è mostrata nella tabella 1. Confrontando le dimensioni delle particelle in acqua e in soluzione di rilegatura, è chiaro che tutte le particelle aggregate in associazione soluzione da pieghe 2-22. Alcune particelle aggregate ulteriormente a più pieghe in pres...

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DNA-magnetic Particle Binding Analysis by Dynamic and Electrophoretic Light Scattering

Questo protocollo descrive la sintesi delle particelle magnetiche e valutazione delle loro proprietà di legame al DNA tramite dispersione della luce dinamica ed elettroforetica. Questo metodo si concentra sul monitoraggio dei cambiamenti nella dimensione delle particelle, loro polidispersità e potenziale zeta della superficie delle particelle che svolgono importanti ruolo nell'associazione di materiali come il DNA.

DNA-magnetoscopico associazione analisi di dispersione della luce dinamica ed elettroforetica

Isolation of DNA using magnetic particles is a field of high importance in biotechnology and molecular biology research. This protocol describes the ...

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