Name: dna-magnetic particle binding analysis by dynamic and electrophoretic light scattering
Uploaded: 2017-11-09T15:00:00
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O apoio financeiro pela Fundação de ciência Checa (projeto GA CR 17-12816S) e o CEITEC 2020 (LQ1601) é muito reconhecido.

1. síntese de nanopartículas magnéticas <ol><li>síntese de nanopartículas magnéticas estabilizado com citrato (MNPs) <ol><li>Adicionar 20 mmol de FeCl 3 &#8729; 6 H 2 O (g 5,406) e 10 mmol de FeCl 2 &#8729; 4 H 2 O (g 1,988) em 20 mL de água bidestilada venoso (água de ddd). Celeuma obtida solução vigorosamente no béquer sob atmosfera 2 N, utilizando um agitador mecânico, até à obtenção de uma solução transparente.</li>
		<li>Sob...

<ol>
	<li>Kulinski, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+preparation+module+for+bacterial+lysis+and+isolation+of+DNA+from+human+urine.">Sample preparation module for bacterial lysis and isolation of DNA from human urine.</a> Biomed Microdevices. 11 (3), 671-678 (2009).</li><li>Loonen, A. J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Pathogen+DNA+Isolation+Methods+from+Large+Volumes+of+Whole+Blood+to+Improve+Molecular+Diagnosis+of+Bloodstream+Infections.">Comparison of Pathogen DNA Isolation Methods from Large Volumes of Whole Blood to Improve Molecular Diagnosis of Bloodstream Infections.</a> PloS One. 8 (8), (2013).</li><li>Mahmoudi, N., Slater, G. F., Fulthorpe, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+commercial+DNA+extraction+kits+for+isolation+and+purification+of+bacterial+and+eukaryotic+DNA+from+PAH-contaminated+soils.">Comparison of commercial DNA extraction kits for isolation and purification of bacterial and eukaryotic DNA from PAH-contaminated soils.</a> Can J Microbiol. 57 (8), 623-628 (2011).</li><li>Rachmayanti, Y., Leinemann, L., Gailing, O., Finkeldey, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+from+processed+and+unprocessed+wood:+Factors+influencing+the+isolation+success.">DNA from processed and unprocessed wood: Factors influencing the isolation success.</a> Forensic Sci Int Genet. 3 (3), 185-192 (2009).</li><li>Munir, M. T., Umar, S., Shahzad, K. A., Shah, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+of+Magnetic+Nanoparticles+for+Hepatitis+B+Virus+Detection.">Potential of Magnetic Nanoparticles for Hepatitis B Virus Detection.</a> J Nanosci Nanotechnol. 16 (12), 12112-12123 (2016).</li><li>Ulbrich, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+drug+delivery+with+polymers+and+magnetic+nanoparticles:+covalent+and+noncovalent+approaches,+release+control,+and+clinical+studies.">Targeted drug delivery with polymers and magnetic nanoparticles: covalent and noncovalent approaches, release control, and clinical studies.</a> Chem Rev. 116 (9), 5338-5431 (2016).</li><li>Pershina, A. G., Sazonov, A. E., Filimonov, V. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+nanoparticles-DNA+interactions:+design+and+applications+of+nanobiohybrid+systems.">Magnetic nanoparticles-DNA interactions: design and applications of nanobiohybrid systems.</a> Rus Chem Rev. 83 (4), 299 (2014).</li><li>Xu, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+nanoparticles+characterization:+Sizing+and+zeta+potential+measurement.">Progress in nanoparticles characterization: Sizing and zeta potential measurement.</a> Particuol. 6 (2), 112-115 (2008).</li><li>Krickl, S., Touraud, D., Kunz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+ethanolamine+stabilized+natural+rubber+latex+from+Taraxacum+kok-saghyz+and+from+Hevea+brasiliensis+using+zeta-potential+and+dynamic+light+scattering+measurements.">Investigation of ethanolamine stabilized natural rubber latex from Taraxacum kok-saghyz and from Hevea brasiliensis using zeta-potential and dynamic light scattering measurements.</a> Ind Crops Prod. 103, 169-174 (2017).</li><li>Haddad, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Isolation+of+DNA+by+Polycharged+Magnetic+Particles:+An+Analysis+of+the+Interaction+by+Zeta+Potential+and+Particle+Size.">The Isolation of DNA by Polycharged Magnetic Particles: An Analysis of the Interaction by Zeta Potential and Particle Size.</a> Int J Mol Sci. 17 (4), (2016).</li><li>Tenorio-Neto, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Submicron+magnetic+core+conducting+polypyrrole+polymer+shell:+Preparation+and+characterization.">Submicron magnetic core conducting polypyrrole polymer shell: Preparation and characterization.</a> Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 61, 688-694 (2016).</li><li>Baharvand, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Encapsulation+of+ferromagnetic+iron+oxide+particles+by+polyester+resin.">Encapsulation of ferromagnetic iron oxide particles by polyester resin.</a> e-Polym. 8 (1), 1-9 (2008).</li><li>Ghorbani, Z., Baharvand, H., Nezhati, M. N., Panahi, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+polymer+particles+modified+with+beta-cyclodextrin.">Magnetic polymer particles modified with beta-cyclodextrin.</a> J Polym Res. 20 (7), (2013).</li><li>Heger, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paramagnetic+Nanoparticles+as+a+Platform+for+FRET-Based+Sarcosine+Picomolar+Detection.">Paramagnetic Nanoparticles as a Platform for FRET-Based Sarcosine Picomolar Detection.</a> Sci Rep. 5, (2015).</li><li>Navarro, E., Serrano-Heras, G., Casta&#241;o, M. J., Solera, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+PCR+detection+chemistry.">Real-time PCR detection chemistry.</a> Clin Chim Acta. 439, 231-250 (2015).</li></ol>

Neste protocolo, os princípios teóricos que explicam o emperramento do ADN para partículas magnéticas através de potencial zeta foram em questão. O protocolo descreve a síntese e modificação de nanopartículas magnéticas e micropartículas. Método para a preparação da solução de controle e vinculação de DNA também são descritos. Duas estratégias são mostradas aqui para triagem de interações DNA-partícula: PCR quantitativo e DLS se aproxima. DLS fornece três indicadores de alterações físico-qu?...

Isolamento do DNA é um dos passos mais importantes em biologia molecular. O desenvolvimento de métodos de extração de ácido nucleico tem grande impacto sobre os campos emergentes da genómica, metagenômica, epigenética e transcriptomics. Há uma ampla gama de aplicações biotecnológicas para isolamento de DNA, incluindo médicos (ferramentas forenses/diagnóstico e prognósticos biomarcadores) e aplicações ambientais (biodiversidade metagenomic, prevalência do patógeno e vigilância). Tem havido crescente demanda para purificar e isolar o DNA de diferentes materiais e em diferentes escalas tais como sangue, urina, solo, madeira e outros tipos de amostras. 1 , 2 , 3 , 4
E micropartículas nanométricas são apropriadas para isolamento de DNA devido à sua elevada área superficial e, em especial quando eles podem ser imobilizados por um campo magnético. Propriedades físico-químicas de partículas, tais como tamanho ou carga, grandemente podem influenciar a sua capacidade de biomoléculas alvo. 5 para aumentar ainda mais a vinculação de biomoléculas e estabilizar as partículas, as modificações químicas diferentes (revestimentos de superfície) podem ser utilizadas. As muitas estratégias diferentes para ligação são classificadas de acordo com interações não covalentes e covalentes. 6 o tamanho das partículas afeta diretamente suas propriedades de magnetização, Considerando que a composição da partícula pode ser costurada por incorporação de metálico, ligas ou outros materiais que podem influenciar a sua densidade, porosidade e superfície. 7 não há nenhuma maneira confiável para medir a carga superficial das partículas pequenas. Em vez disso, o potencial elétrico no plano de escorregamento (alguma distância longe da superfície de nanopartículas) pode ser medido. 8 este valor é chamado de zeta potencial e é uma ferramenta potente que geralmente é utilizada para avaliação da estabilidade de nano - e micropartículas através de DLS. 9 desde que seu valor é altamente dependente não só o pH e força iônica do meio ambiente dispersivo, mas também sobre as características de superfície das partículas, pode também provar as alterações nesta superfície causado pela interação entre o partículas e moléculas de interesse. 10
Por outro lado, a estrutura do DNA em condições desidratado (forma A-DNA) exposições compactado conformações que facilitam sua precipitação (agregação) quando comparado ao comumente ocorrendo formulário B-DNA. Eletrostática (iônica e ligação-H) são as principais forças controlando a ligação do DNA a outros materiais devido à sua estericamente acessível fosfato e bases nitrogenadas (particularmente a guanina). 7 , 10
Neste trabalho, analisam-se três modificações químicas representativas de nanopartículas magnéticas e micropartículas (figura 1A). São descritos o método de síntese e modificação química de nanopartículas e micropartículas. Uma solução de ligação, que acordos de princípios teóricos da precipitação do DNA (pH, força iônica e desidratação), é usada para avaliar a eluição e vinculação de DNA. PCR quantitativo é usado para avaliar a eficiência de eluição do DNA do representante nanopartículas e micropartículas (figura 1B). Granulometria, índice de polidispersividade e potencial zeta são importantes parâmetros que são usados para visualizar as alterações físico-químicas que ocorrem na superfície da partícula (Figura 1). É importante ressaltar sobre a caracterização química de superfície de partícula magnética. Enquanto esta etapa foi para além do âmbito do presente protocolo, várias técnicas modernas podem ser aplicadas para investigar a eficiência de modificações químicas. 11 , 12 , 13 , 14 a espectroscopia no infravermelho (FTIR) transformada de Fourier pode ser usada para avaliar o espectro infravermelho de superfície de partícula e compará-lo com o espectro de modificadores químicos livre. Espectroscopia de fotoelétron de raios x (XPS) é outra técnica que pode ser usada para identificar a composição elementar da superfície do material. Outros métodos eletroquímicos, microscópicos e espectroscópicos podem ser usados para lançar a luz sobre a qualidade da síntese de partículas. Este trabalho destaca uma nova perspectiva de análise de DNA-magnético interações de partículas via DLS.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Iron(III) chloride hexahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>207926</td>
			<td>Magnetic particle synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron(II) chloride tetrahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>380024</td>
			<td>Magnetic particle synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron(II) sulfate heptahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F8263</td>
			<td>Magnetic particle synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Penta</td>
			<td>10060-11000</td>
			<td>Magnetic particle synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W302600</td>
			<td>Magnetic particle synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetraethyl orthosilicate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>131903</td>
			<td>Magnetic particle synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(3-Aminopropyl)triethoxysilane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>440140</td>
			<td>Magnetic particle synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine, branched, average Mw ~25,000</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>408727</td>
			<td>Magnetic particle synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium hydroxide solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>221228-M&#160;</td>
			<td>Magnetic particle synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Penta</td>
			<td>71250-11000</td>
			<td>Magnetic particle synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium nitrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6083</td>
			<td>Magnetic particle synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1.05012</td>
			<td>Magnetic particle synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ow-molecular-weight cut-off membrane (Mw=1 kDa)</td>
			<td>Spectrum labs</td>
			<td>G235063</td>
			<td>Magnetic particle synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Overhead Stirrer</td>
			<td>witeg Labortechnik GmbH</td>
			<td>DH.WOS01035</td>
			<td>Magnetic particle synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waterbath</td>
			<td>Memmert GmbH + Co.</td>
			<td>84198998</td>
			<td>Magnetic particle synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Bandelin</td>
			<td>795</td>
			<td>Magnetic particle synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BRAND UV cuvette micro</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>BR759200-100EA</td>
			<td>Cuvette for size measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BRAND cap for UV-cuvette micro</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>BR759240-100EA</td>
			<td>Cuvette caps for size measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folded Capillary Zeta Cell</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>DTS1070</td>
			<td>Cuvette for zeta potential measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zetasizer Nano ZS</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>ZEN3600</td>
			<td>Device for measurement of size and zeta potential</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infinite 200 PRO 
			NanoQuant instrument</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>396 227 V1.0, 04-2010</td>
			<td>device for measurement of DNA concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Green Quantitative RT-PCR Kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>QR0100</td>
			<td>PCR kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mastercycler pro S instrument</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>6325 000.013</td>
			<td>Thermocycler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MinElute kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28004</td>
			<td>DNA purification kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7670</td>
			<td>DNA binding</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dna-magnetic particle binding analysis by dynamic and electrophoretic light scattering

Isolamento de DNA utilizando partículas magnéticas é um campo de grande importância na pesquisa de biotecnologia e biologia molecular. Este protocolo descreve a avaliação de partículas magnéticas-DNA ligação via difusão dinâmica da luz (DLS) e espalhamento de luz eletroforético (ELS). Análise por DLS fornece informações valiosas sobre as propriedades físico-químicas das partículas, incluindo o tamanho de partícula, polidispersividade e potencial zeta. O último descreve a carga superficial da partícula que desempenha papel importante na ligação eletrostática de materiais tais como o DNA. Aqui, uma análise comparativa explora três modificações químicas de nanopartículas e micropartículas e seus efeitos sobre a ligação do DNA e eluição. Modificações químicas por ramificada o polyethylenimine, tetraetila orthosilicate e (3-aminopropil) triethoxysilane são investigados. Desde que o DNA apresenta uma carga negativa, espera-se que potencial zeta de superfície de partícula irá diminuir a ligação do DNA. Formação de clusters deve também afetam o tamanho de partícula. Para investigar a eficiência dessas partículas isoladamente e eluição do DNA, as partículas são misturadas com DNA em pH baixo (~ 6), alta força iônica e ambiente de desidratação. As partículas são lavadas no ímã e então DNA é eluída por tampão Tris-HCl (pH = 8). Número de cópia do DNA é estimado usando quantitativa cadeia da polimerase (PCR). Potencial zeta, tamanho de partícula, polidispersividade e dados quantitativos de PCR são avaliados e comparados. DLS é uma perspicaz e método de análise que adiciona uma nova perspectiva para o processo de triagem de partículas para isolamento de DNA de apoio.

Usando o protocolo descrito aqui por síntese química e modificação das partículas magnéticas, seis partículas magnéticas foram sintetizadas e analisadas para ligação de DNA. Um resumo da análise é mostrado na tabela 1. Comparando o tamanho de partícula em água e em solução de ligação, é claro que todas as partículas de agregado na solução de ligação por dobras 2-22. Algumas partículas mais agregados mais dobras na presença de DNA; no entanto isto...

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DNA-magnetic Particle Binding Analysis by Dynamic and Electrophoretic Light Scattering

Este protocolo descreve a síntese de partículas magnéticas e avaliação de suas propriedades de ligação a DNA através de espalhamento de luz dinâmica e eletroforético. Este método concentra-se em acompanhamento de alterações no tamanho da partícula, sua polidispersividade e potencial zeta de superfície de partícula que desempenham grande papel na ligação de materiais tais como o DNA.

DNA-magnético partícula análise por dispersão de luz dinâmica e eletroforético de vinculação

Isolation of DNA using magnetic particles is a field of high importance in biotechnology and molecular biology research. This protocol describes the ...

Research

JoVE Journal

Chemistry

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Determinando os planos de ligação de gelo de proteínas anticongelantes pela afinidade do plano de gelo baseado em fluorescência

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Light-driven Enzymatic Decarboxylation

Claro conduzido enzimática descarboxilação

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Dissolução dinâmico Nuclear Polarização Instrumentação para em tempo real enzimática Reaction Taxa de Medições por RMN

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Microfluidic Chips for In Situ Crystal X-ray Diffraction and In Situ Dynamic Light Scattering for Serial Crystallography

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Chips microfluídicos por difração de raio x de cristal In Situ e In Situ Difusão dinâmica da luz de cristalografia de Serial

This protocol describes fabricating microfluidic devices with low X-ray background optimized for goniometer based fixed target serial crystallography. The ...

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Elemental-sensíveis à deteção da química em baterias através de espectroscopia de absorção de raios-x moles e espalhamento inelástico de raios-x ressonante

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Luminophore Formation in Various Conformations of Bovine Serum Albumin by Binding of Gold(III)

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Lumíforo formação em várias conformações de albumina de soro bovino por ligação de Gold(III)

The purpose of the presented protocols is to study the process of Au(III) binding to BSA, yielding conformation change-induced red fluorescence (&#955;em ...