Name: genome-wide quantification of translation in budding yeast by ribosome profiling
Uploaded: 2017-12-21T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Genome-wide Quantification of Translation in Budding Yeast by Ribosome Profiling at JoVE.com

Questo lavoro è stato sostenuto dagli istituti nazionali di sovvenzioni di salute AG040191 e AG054566 di VML. Questa ricerca è stata condotta mentre VML era un destinatario AFAR Research Grant della Federazione americana per la ricerca di invecchiamento.

1. Estrarre la preparazione
<ol>
	<li>Ceppi di lievito di striscia dagli stock congelati per singole colonie su piastre YPD (1% di Estratto di lievito, 2% di peptone, glucosio di 2% e 2% agar). Incubare le piastre a 30 ° C per 2 giorni.</li>
	<li>Inoculare il lievito da una piastra YPD (uso una singola Colonia) in 15 mL di terreno YPD (Estratto di lievito 1%, 2% di peptone, 2% di glucosio) in una provetta conica per centrifuga da 50 mL e crescere durante la notte con agitazione (200-250 giri/min) a 30 ° C.</li>
	<li>...

<ol>
	<li>Holcik, M., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+control+in+stress+and+apoptosis.">Translational control in stress and apoptosis.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).</li><li>Tanenbaum, M. E., Stern-Ginossar, N., Weissman, J. S., Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+mRNA+translation+during+mitosis.">Regulation of mRNA translation during mitosis.</a> Elife. 4, (2015).</li><li>Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+in+vivo+of+translation+with+nucleotide+resolution+using+ribosome+profiling.">Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling.</a> Science. 324 (5924), 218-223 (2009).</li><li>Ingolia, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+translational+profiling+by+ribosome+footprinting.">Genome-wide translational profiling by ribosome footprinting.</a> Methods Enzymol. 470, 119-142 (2010).</li><li>Brar, G. A., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+profiling+reveals+the+what,+when,+where+and+how+of+protein+synthesis.">Ribosome profiling reveals the what, when, where and how of protein synthesis.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (11), 651-664 (2015).</li><li>Wolin, S. L., Walter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+pausing+and+stacking+during+translation+of+a+eukaryotic+mRNA.">Ribosome pausing and stacking during translation of a eukaryotic mRNA.</a> EMBO J. 7 (11), 3559-3569 (1988).</li><li>Guo, H., Ingolia, N. T., Weissman, J. S., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+microRNAs+predominantly+act+to+decrease+target+mRNA+levels.">Mammalian microRNAs predominantly act to decrease target mRNA levels.</a> Nature. 466 (7308), 835-840 (2010).</li><li>Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ribosome+profiling+strategy+for+monitoring+translation+in+vivo+by+deep+sequencing+of+ribosome-protected+mRNA+fragments.">The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments.</a> Nat Protoc. 7 (8), 1534-1550 (2012).</li><li>Bartholomaus, A., Del Campo, C., Ignatova, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+non-standardized+biases+of+ribosome+profiling.">Mapping the non-standardized biases of ribosome profiling.</a> Biol Chem. 397 (1), 23-35 (2016).</li><li>Larsson, O., Sonenberg, N., Nadon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=anota:+Analysis+of+differential+translation+in+genome-wide+studies.">anota: Analysis of differential translation in genome-wide studies.</a> Bioinformatics. 27 (10), 1440-1441 (2011).</li><li>Zhong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RiboDiff:+detecting+changes+of+mRNA+translation+efficiency+from+ribosome+footprints.">RiboDiff: detecting changes of mRNA translation efficiency from ribosome footprints.</a> Bioinformatics. 33 (1), 139-141 (2017).</li><li>Xiao, Z., Zou, Q., Liu, Y., Yang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+assessment+of+differential+translations+with+ribosome+profiling+data.">Genome-wide assessment of differential translations with ribosome profiling data.</a> Nat Commun. 7, 11194 (2016).</li><li>Chung, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+duplex-specific+nuclease+in+ribosome+profiling+and+a+user-friendly+software+package+for+Ribo-seq+data+analysis.">The use of duplex-specific nuclease in ribosome profiling and a user-friendly software package for Ribo-seq data analysis.</a> RNA. 21 (10), 1731-1745 (2015).</li><li>Popa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RiboProfiling:+a+Bioconductor+package+for+standard+Ribo-seq+pipeline+processing.">RiboProfiling: a Bioconductor package for standard Ribo-seq pipeline processing.</a> F1000Res. 5, 1309 (2016).</li><li>Dunn, J. G., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plastid:+nucleotide-resolution+analysis+of+next-generation+sequencing+and+genomics+data.">Plastid: nucleotide-resolution analysis of next-generation sequencing and genomics data.</a> BMC Genomics. 17 (1), 958 (2016).</li><li>Baranov, P. V., Michel, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Illuminating+translation+with+ribosome+profiling+spectra.">Illuminating translation with ribosome profiling spectra.</a> Nat Methods. 13 (2), 123-124 (2016).</li><li>Calviello, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+actively+translated+open+reading+frames+in+ribosome+profiling+data.">Detecting actively translated open reading frames in ribosome profiling data.</a> Nat Methods. 13 (2), 165-170 (2016).</li><li>Michel, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RiboGalaxy:+A+browser+based+platform+for+the+alignment,+analysis+and+visualization+of+ribosome+profiling+data.">RiboGalaxy: A browser based platform for the alignment, analysis and visualization of ribosome profiling data.</a> RNA Biol. 13 (3), 316-319 (2016).</li><li>Martin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutadapt+removes+adapter+sequences+from+high-throughput+sequencing+reads.">Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads.</a> EMBnet J. 17 (1), 10-12 (2011).</li><li>Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+and+memory-efficient+alignment+of+short+DNA+sequences+to+the+human+genome.">Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome.</a> Genome Biol. 10 (3), R25 (2009).</li><li>Anders, S., Pyl, P. T., Huber, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HTSeq--a+Python+framework+to+work+with+high-throughput+sequencing+data.">HTSeq--a Python framework to work with high-throughput sequencing data.</a> Bioinformatics. 31 (2), 166-169 (2015).</li><li>Love, M. I., Huber, W., Anders, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moderated+estimation+of+fold+change+and+dispersion+for+RNA-seq+data+with+DESeq2.">Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2.</a> Genome Biol. 15 (12), 550 (2014).</li><li>van den Elzen, A. M., Schuller, A., Green, R., Seraphin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dom34-Hbs1+mediated+dissociation+of+inactive+80S+ribosomes+promotes+restart+of+translation+after+stress.">Dom34-Hbs1 mediated dissociation of inactive 80S ribosomes promotes restart of translation after stress.</a> EMBO J. 33 (3), 265-276 (2014).</li><li>Guydosh, N. R., Green, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dom34+rescues+ribosomes+in+3'+untranslated+regions.">Dom34 rescues ribosomes in 3' untranslated regions.</a> Cell. 156 (5), 950-962 (2014).</li><li>Ingolia, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+profiling:+new+views+of+translation,+from+single+codons+to+genome+scale.">Ribosome profiling: new views of translation, from single codons to genome scale.</a> Nat Rev Genet. 15 (3), 205-213 (2014).</li><li>Gerashchenko, M. V., Lobanov, A. V., Gladyshev, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+ribosome+profiling+reveals+complex+translational+regulation+in+response+to+oxidative+stress.">Genome-wide ribosome profiling reveals complex translational regulation in response to oxidative stress.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (43), 17394-17399 (2012).</li><li>Weinberg, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+ribosome-footprint+and+mRNA+measurements+provide+insights+into+dynamics+and+regulation+of+yeast+translation.">Improved ribosome-footprint and mRNA measurements provide insights into dynamics and regulation of yeast translation.</a> Cell Rep. 14 (7), 1787-1799 (2016).</li><li>Park, J. E., Yi, H., Kim, Y., Chang, H., Kim, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+poly(A)+tail+and+translation+during+the+somatic+cell+cycle.">Regulation of poly(A) tail and translation during the somatic cell cycle.</a> Mol Cell. 62 (3), 462-471 (2016).</li><li>Howard, M. T., Carlson, B. A., Anderson, C. B., Hatfield, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+redefinition+of+UGA+codons+is+regulated+by+selenium+availability.">Translational redefinition of UGA codons is regulated by selenium availability.</a> J Biol Chem. 288 (27), 19401-19413 (2013).</li><li>Gerashchenko, M. V., Gladyshev, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribonuclease+selection+for+ribosome+profiling.">Ribonuclease selection for ribosome profiling.</a> Nucleic Acids Res. 45 (2), e6 (2017).</li><li>Gerashchenko, M. V., Gladyshev, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translation+inhibitors+cause+abnormalities+in+ribosome+profiling+experiments.">Translation inhibitors cause abnormalities in ribosome profiling experiments.</a> Nucleic Acids Res. 42 (17), e134 (2014).</li><li>O'Connor, P. B., Andreev, D. E., Baranov, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+survey+of+the+relative+impact+of+mRNA+features+on+local+ribosome+profiling+read+density.">Comparative survey of the relative impact of mRNA features on local ribosome profiling read density.</a> Nat Commun. 7, 12915 (2016).</li></ol>

L'approccio di Ribo-Seq è emerso come una potente tecnologia per l'analisi del mRNA traduzione in vivo presso il genoma di livello 3. Gli studi che utilizzano questo approccio, che permette di monitorare la traduzione con risoluzione di singolo-codone, ha contribuito alla nostra comprensione della regolazione traduzionale. Nonostante i suoi vantaggi, Ribo-Seq presenta diverse limitazioni. Frammenti di RNA ribosomiale (rRNA) sono sempre co-purificate durante l'isolamento delle orme protet...

traduzione del mRNA è uno dei processi fondamentali nella cellula, che svolge un ruolo importante nella regolazione dell'espressione della proteina. Di conseguenza, la traduzione degli mRNA è strettamente controllato in risposta a diversi stimoli fisiologici interni ed esterni 1,2. Tuttavia, i meccanismi di regolazione traduzionale rimangono Zito. Qui, descriviamo il protocollo per la quantificazione del genoma della traduzione nel lievito gemmante dal ribosoma profilatura. L'obiettivo generale della tecnica di profilatura del ribosoma è studiare e quantificare la traduzione di specifici mRNA sotto diverse condizioni cellulari. Questa tecnica utilizza sequenziamento di nuova generazione per analizzare quantitativamente l'occupazione del ribosoma in tutto il genoma e permette di monitorare il tasso di proteine sintesi in vivo al singolo codone risoluzione 3,4. Attualmente, questo metodo fornisce i mezzi più avanzati di misurare i livelli di traduzione di proteine e ha dimostrato di essere uno strumento di scoperta utile fornire informazioni che non possono essere rivelati da altre tecniche attualmente disponibili, ad esempio microarrays o Traduzione stato matrice analisi (TSAA) 5. Come ribosoma profilatura report sui cambiamenti combinati nei livelli della trascrizione e uscita traslazionale, fornisce anche sensibilità molto maggiore rispetto ad altri metodi.
Questo approccio si basa sul sequenziamento profondo del ribosoma-protetto mRNA frammenti 3. Durante la traduzione di proteine, i ribosomi proteggono ~ 28 porzioni di nt del mRNA (chiamato tracce) 6. Determinando la sequenza dei frammenti ribosoma-protetto, Ribo-Seq può mappa la posizione dei ribosomi su mRNA tradotta e identificare quali regioni del mRNA sono probabili essere attivamente tradotto in proteina 3,7. Inoltre, possiamo misurare quantitativamente la traduzione di mRNA contando il numero di impronte che si allineano a una determinata trascrizione di mRNA.
Al fine di isolare i frammenti ribosoma-protetto, lisati cellulari sono inizialmente trattati con un inibitore di traduzione di stallo i ribosomi seguiti da digestione di ribonucleasi. Considerando che libero mRNA e porzioni dei mRNAs tradotta non protetti dai ribosomi sono degradate da ribonucleasi, i frammenti di mRNA ribosoma-protetti possono essere recuperati da purificare complessi intatti ribosoma-impronta. Queste impronte di mRNA sono quindi convertite in cDNA biblioteca e analizzate mediante sequenziamento profondo (Figura 1). In parallelo alla profilatura del ribosoma, mRNA intatto viene estratta dallo stesso campione e sequenziato. Confrontando il livello di traduzione identificato da Ribo-Seq con misure di abbondanza del mRNA, possiamo identificare i geni che sono specificamente up - o down-regolato a livello della traduzione e calcolare l'efficienza della traduzione del mRNA a livello del genoma. Mentre il protocollo descritto in questo articolo è specifico per il lievito, dovrebbe essere anche utile per i ricercatori che cercano di stabilire il protocollo di Ribo-Seq in altri sistemi.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.45 &#956;M membrane filters</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>HVLP04700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 mL centrifugal filters (100 kDa MWCO)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC510024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M Tris-HCl, pH 7.0</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9850G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M Tris-HCl, pH 7.5 (pH 8.0 at 4&#176;C)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15567-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X TBE buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9863</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% TBE-urea gel</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>EC6875BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15% TBE-urea gel</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>EC6885BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 M MgCl2</td>
			<td>RPI</td>
			<td>M24500-10.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2X TBE-urea sample buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LC6876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3M NaOAc, pH 5.5</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5&#39; Deadenylase (10 U/&#956;L)</td>
			<td>Epicentre</td>
			<td>DA11101K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5X Nucleic acid sample loading buffer</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8% TBE gel</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>EC6215BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9722</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue light transilluminator</td>
			<td>Clare Chemical Research</td>
			<td>DR-46B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chrome-steel beads, 3.2 mm</td>
			<td>BioSpec Products</td>
			<td>11079132c</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogrinder</td>
			<td>Biospec product</td>
			<td>3110BX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cycloheximide</td>
			<td>RPI</td>
			<td>C81040-5.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data Acquisition System</td>
			<td>DATAQ Instruments</td>
			<td>DI-245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxynucleotide (dNTP) solution mix (10 mM)</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N0447L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gradient fractionation system</td>
			<td>Brandel</td>
			<td>BR-184X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-fidelity DNA polymerase (2,000 U/mL)</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0530S</td>
			<td>Supplied with 5X Phusion HF Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Next-generation sequencing library quantification kit</td>
			<td>Kapa Biosystems</td>
			<td>KK4824</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleic acid gel stain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S11494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima XE-90 ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A94471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(A) mRNA isolation kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>61011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rec J exonuclease (10 U/&#956;L)</td>
			<td>Epicentre</td>
			<td>RJ411250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse transcriptase (200 U/&#956;L)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18080093</td>
			<td>Supplied with 5X first-strand buffer and 0.1 M DTT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA fragmentation buffer</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E6186A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase I (100 U/&#956;L)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM2295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase inhibitor (20 U/&#956;L)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM2696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone rubber caps</td>
			<td>BioSpec Products</td>
			<td>2008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ssDNA ligase (100 U/&#956;L)</td>
			<td>Epicentre</td>
			<td>CL9021K</td>
			<td>Supplied with 10X CircLigase II buffer and 50 mM MnCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel microvials, 1.8 mL</td>
			<td>BioSpec Products</td>
			<td>2007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>RPI</td>
			<td>S24060-5000.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW-41 Ti rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>331362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>New Era Pump Systems</td>
			<td>NE-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 polynucleotide kinase (10,000 U/mL)</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0201S</td>
			<td>Supplied with 10X T4 polynucleotide kinase buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 RNA ligase 2 truncated KQ (200,000 U/mL)</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0373S</td>
			<td>Supplied with 10X T4 RNA ligase buffer and 50% PEG8000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal cycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1851148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thinwall polyallomer tubes, 13.2 mL</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>331372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>X100-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV monitor</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7318160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saccharomyces cerevisiae strain BY4741</td>
			<td>Open Biosystems</td>
			<td>YSC1048</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genome-wide quantification of translation in budding yeast by ribosome profiling

Traduzione di mRNA in proteine è un processo complesso che coinvolge diversi strati di regolamento. Spesso si presume che cambiamenti nella trascrizione del mRNA riflettono cambiamenti nella sintesi proteica, ma sono state osservate molte eccezioni. Recentemente, una tecnica chiamata ribosoma profilatura (o Ribo-Seq) è emerso come un potente metodo che permette l'identificazione, con alta precisione, quali regioni di mRNA vengono tradotti in proteine e quantificazione della traduzione a livello di genoma. Qui, presentiamo un protocollo generalizzato per la quantificazione del genoma di traduzione utilizzando Ribo-Seq in lievito. Inoltre, combinando Ribo-Seq dati con misure di abbondanza del mRNA permette di quantificare contemporaneamente l'efficienza della traduzione di migliaia di trascrizioni del mRNA nello stesso campione e confrontare le modifiche a questi parametri in risposta a sperimentale manipolazioni o in diversi stati fisiologici. Descriviamo un protocollo dettagliato per la generazione delle orme di ribosoma tramite digestione nucleasi, isolamento dei complessi intatti ribosoma-impronta tramite frazionamento gradiente di saccarosio e la preparazione delle librerie di DNA per sequenziamento profondo insieme appropriato controlli di qualità necessari per garantire l'accurata analisi della traduzione in vivo .

Sono state dettagliate condotte per analisi bioinformatica del ribosoma profiling dei dati descritto in precedenza 8,9. Inoltre, diversi gruppi di ricerca hanno sviluppato strumenti bioinformatici per l'analisi dell'espressione genica differenziale e trattamento dei dati di sequenziamento, che sono specifici per ribosoma profilatura metodo 10,11,<sup class="xref...

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Genome-wide Quantification of Translation in Budding Yeast by Ribosome Profiling

Regolazione traduzionale svolge un ruolo importante nel controllo dell'abbondanza di proteine. Qui, descriviamo un metodo di alto-rendimento per analisi quantitativa di traduzione nel lievito Saccharomyces cerevisiae.

Genome-wide quantificazione della traduzione nel lievito gemmante mediante profilatura, ribosoma

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Risoluzione purificato per affinità complessi proteici di Blue Native PAGE e proteine ​​correlazione Profiling

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Ricerca

Biochimica

Deep Proteome Profiling by Isobaric Labeling, Extensive Liquid Chromatography, Mass Spectrometry, and Software-assisted Quantification

Proteoma profonda profilatura di etichettatura isobarico, vasto cromatografia liquida, spettrometria di massa e quantificazione assistita da Software

Many exceptional advances have been made in mass spectrometry (MS)-based proteomics, with particular technical progress in liquid chromatography (LC) ...

Quantification of Hypopigmentation Activity In Vitro

Quantificazione di Hypopigmentation attività In Vitro

This study presents laboratory methods for the quantification of hypopigmentation activity in vitro. Melanin, the major pigment in melanocytes, is ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

Nitropeptide Profilazione e identificazione illustrata da Angiotensin II

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Traduzione della purificazione dell'affinità del ribosoma (TRAP) per l'isolamento dell'RNA dalle cellule endoteliali In vivo

Many studies have been limited to using in vitro cellular assays and whole tissues or isolating of specific cell types from animals for in vitro analysis ...

DNA Sequence Recognition by DNA Primase Using High-Throughput Primase Profiling

Riconoscimento della sequenza del DNA da parte del primase del DNA utilizzando la profilazione primasise ad alto valore a più velocità

DNA primase synthesizes short RNA primers that initiate DNA synthesis of Okazaki fragments on the lagging strand by DNA polymerase during DNA replication. ...

Dual DNA Rulers to Study the Mechanism of Ribosome Translocation with Single-Nucleotide Resolution

I governanti del DOPPIO DNA studiano il meccanismo della traslocazione del ribosoma con la risoluzione Single-Nucleotide

The ribosome translocation refers to the ribosomal movement on the mRNA by exactly three nucleotides (nt), which is the central step in protein synthesis. ...

High-Resolution Complexome Profiling by Cryoslicing BN-MS Analysis

Profilazione complesso ad alta risoluzione di Cryoslicing BN-MS Analysis

Proteins generally exert biological functions through interactions with other proteins, either in dynamic protein assemblies or as a part of stably formed ...