Name: genome-wide quantification of translation in budding yeast by ribosome profiling
Uploaded: 2017-12-21T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Genome-wide Quantification of Translation in Budding Yeast by Ribosome Profiling at JoVE.com

Detta arbete stöds av de National institutionerna of Health bidrag AG040191 och AG054566 att VML. Denna forskning utfördes medan VML var en AFAR forskningsbidrag mottagaren från det amerikanska förbundet för åldrande forskning.

1. extrahera förberedelse
<ol>
	<li>Strimma jäststammar från fryst lager för enstaka kolonier på YPD plattor (1% jästextrakt, 2% pepton, 2% glukos och 2% agar). Inkubera plattorna vid 30 ° C i 2 dagar.</li>
	<li>Inokulera jäst från ett YPD plattan (Använd en enda koloni) till 15 mL YPD medium (1% jästextrakt, 2% pepton, 2% glukos) i en 50 mL konisk centrifugrör och växa över natten med skakningar (200-250 rpm) vid 30 ° C.</li>
	<li>Späd kultur i 500 mL YPD medium i en 2 L sterila mätkolv, så att den O...

<ol>
	<li>Holcik, M., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+control+in+stress+and+apoptosis.">Translational control in stress and apoptosis.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).</li><li>Tanenbaum, M. E., Stern-Ginossar, N., Weissman, J. S., Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+mRNA+translation+during+mitosis.">Regulation of mRNA translation during mitosis.</a> Elife. 4, (2015).</li><li>Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+in+vivo+of+translation+with+nucleotide+resolution+using+ribosome+profiling.">Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling.</a> Science. 324 (5924), 218-223 (2009).</li><li>Ingolia, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+translational+profiling+by+ribosome+footprinting.">Genome-wide translational profiling by ribosome footprinting.</a> Methods Enzymol. 470, 119-142 (2010).</li><li>Brar, G. A., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+profiling+reveals+the+what,+when,+where+and+how+of+protein+synthesis.">Ribosome profiling reveals the what, when, where and how of protein synthesis.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (11), 651-664 (2015).</li><li>Wolin, S. L., Walter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+pausing+and+stacking+during+translation+of+a+eukaryotic+mRNA.">Ribosome pausing and stacking during translation of a eukaryotic mRNA.</a> EMBO J. 7 (11), 3559-3569 (1988).</li><li>Guo, H., Ingolia, N. T., Weissman, J. S., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+microRNAs+predominantly+act+to+decrease+target+mRNA+levels.">Mammalian microRNAs predominantly act to decrease target mRNA levels.</a> Nature. 466 (7308), 835-840 (2010).</li><li>Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ribosome+profiling+strategy+for+monitoring+translation+in+vivo+by+deep+sequencing+of+ribosome-protected+mRNA+fragments.">The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments.</a> Nat Protoc. 7 (8), 1534-1550 (2012).</li><li>Bartholomaus, A., Del Campo, C., Ignatova, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+non-standardized+biases+of+ribosome+profiling.">Mapping the non-standardized biases of ribosome profiling.</a> Biol Chem. 397 (1), 23-35 (2016).</li><li>Larsson, O., Sonenberg, N., Nadon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=anota:+Analysis+of+differential+translation+in+genome-wide+studies.">anota: Analysis of differential translation in genome-wide studies.</a> Bioinformatics. 27 (10), 1440-1441 (2011).</li><li>Zhong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RiboDiff:+detecting+changes+of+mRNA+translation+efficiency+from+ribosome+footprints.">RiboDiff: detecting changes of mRNA translation efficiency from ribosome footprints.</a> Bioinformatics. 33 (1), 139-141 (2017).</li><li>Xiao, Z., Zou, Q., Liu, Y., Yang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+assessment+of+differential+translations+with+ribosome+profiling+data.">Genome-wide assessment of differential translations with ribosome profiling data.</a> Nat Commun. 7, 11194 (2016).</li><li>Chung, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+duplex-specific+nuclease+in+ribosome+profiling+and+a+user-friendly+software+package+for+Ribo-seq+data+analysis.">The use of duplex-specific nuclease in ribosome profiling and a user-friendly software package for Ribo-seq data analysis.</a> RNA. 21 (10), 1731-1745 (2015).</li><li>Popa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RiboProfiling:+a+Bioconductor+package+for+standard+Ribo-seq+pipeline+processing.">RiboProfiling: a Bioconductor package for standard Ribo-seq pipeline processing.</a> F1000Res. 5, 1309 (2016).</li><li>Dunn, J. G., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plastid:+nucleotide-resolution+analysis+of+next-generation+sequencing+and+genomics+data.">Plastid: nucleotide-resolution analysis of next-generation sequencing and genomics data.</a> BMC Genomics. 17 (1), 958 (2016).</li><li>Baranov, P. V., Michel, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Illuminating+translation+with+ribosome+profiling+spectra.">Illuminating translation with ribosome profiling spectra.</a> Nat Methods. 13 (2), 123-124 (2016).</li><li>Calviello, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+actively+translated+open+reading+frames+in+ribosome+profiling+data.">Detecting actively translated open reading frames in ribosome profiling data.</a> Nat Methods. 13 (2), 165-170 (2016).</li><li>Michel, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RiboGalaxy:+A+browser+based+platform+for+the+alignment,+analysis+and+visualization+of+ribosome+profiling+data.">RiboGalaxy: A browser based platform for the alignment, analysis and visualization of ribosome profiling data.</a> RNA Biol. 13 (3), 316-319 (2016).</li><li>Martin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutadapt+removes+adapter+sequences+from+high-throughput+sequencing+reads.">Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads.</a> EMBnet J. 17 (1), 10-12 (2011).</li><li>Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+and+memory-efficient+alignment+of+short+DNA+sequences+to+the+human+genome.">Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome.</a> Genome Biol. 10 (3), R25 (2009).</li><li>Anders, S., Pyl, P. T., Huber, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HTSeq--a+Python+framework+to+work+with+high-throughput+sequencing+data.">HTSeq--a Python framework to work with high-throughput sequencing data.</a> Bioinformatics. 31 (2), 166-169 (2015).</li><li>Love, M. I., Huber, W., Anders, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moderated+estimation+of+fold+change+and+dispersion+for+RNA-seq+data+with+DESeq2.">Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2.</a> Genome Biol. 15 (12), 550 (2014).</li><li>van den Elzen, A. M., Schuller, A., Green, R., Seraphin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dom34-Hbs1+mediated+dissociation+of+inactive+80S+ribosomes+promotes+restart+of+translation+after+stress.">Dom34-Hbs1 mediated dissociation of inactive 80S ribosomes promotes restart of translation after stress.</a> EMBO J. 33 (3), 265-276 (2014).</li><li>Guydosh, N. R., Green, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dom34+rescues+ribosomes+in+3'+untranslated+regions.">Dom34 rescues ribosomes in 3' untranslated regions.</a> Cell. 156 (5), 950-962 (2014).</li><li>Ingolia, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+profiling:+new+views+of+translation,+from+single+codons+to+genome+scale.">Ribosome profiling: new views of translation, from single codons to genome scale.</a> Nat Rev Genet. 15 (3), 205-213 (2014).</li><li>Gerashchenko, M. V., Lobanov, A. V., Gladyshev, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+ribosome+profiling+reveals+complex+translational+regulation+in+response+to+oxidative+stress.">Genome-wide ribosome profiling reveals complex translational regulation in response to oxidative stress.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (43), 17394-17399 (2012).</li><li>Weinberg, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+ribosome-footprint+and+mRNA+measurements+provide+insights+into+dynamics+and+regulation+of+yeast+translation.">Improved ribosome-footprint and mRNA measurements provide insights into dynamics and regulation of yeast translation.</a> Cell Rep. 14 (7), 1787-1799 (2016).</li><li>Park, J. E., Yi, H., Kim, Y., Chang, H., Kim, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+poly(A)+tail+and+translation+during+the+somatic+cell+cycle.">Regulation of poly(A) tail and translation during the somatic cell cycle.</a> Mol Cell. 62 (3), 462-471 (2016).</li><li>Howard, M. T., Carlson, B. A., Anderson, C. B., Hatfield, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+redefinition+of+UGA+codons+is+regulated+by+selenium+availability.">Translational redefinition of UGA codons is regulated by selenium availability.</a> J Biol Chem. 288 (27), 19401-19413 (2013).</li><li>Gerashchenko, M. V., Gladyshev, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribonuclease+selection+for+ribosome+profiling.">Ribonuclease selection for ribosome profiling.</a> Nucleic Acids Res. 45 (2), e6 (2017).</li><li>Gerashchenko, M. V., Gladyshev, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translation+inhibitors+cause+abnormalities+in+ribosome+profiling+experiments.">Translation inhibitors cause abnormalities in ribosome profiling experiments.</a> Nucleic Acids Res. 42 (17), e134 (2014).</li><li>O'Connor, P. B., Andreev, D. E., Baranov, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+survey+of+the+relative+impact+of+mRNA+features+on+local+ribosome+profiling+read+density.">Comparative survey of the relative impact of mRNA features on local ribosome profiling read density.</a> Nat Commun. 7, 12915 (2016).</li></ol>

Metoden med Ribo-Seq har vuxit fram som en kraftfull teknik för analys av mRNA översättning i vivo på genome-wide nivå 3. Studier med hjälp av denna metod, som tillåter övervakning översättning med singel-kodon upplösning, har bidragit till vår förståelse för translationell förordning. Trots sina fördelar har Ribo-Seq flera begränsningar. Ribosomalt RNA (rRNA) fragment är alltid Co renat under isolering av Ribosomen-skyddade fotspår minskar avkastningen av användbar s...

mRNA översättning är en av de grundläggande processerna i cellen, som spelar en viktig roll i regleringen av proteinuttryck. Därför kontrolleras tätt mRNA översättning svar till olika interna och externa fysiologiska stimuli 1,2. Mekanismerna för translationell förordning dock understudied. Här beskriver vi protokollet för genome-wide kvantifiering av översättning i spirande jäst av Ribosomen profilering. Det övergripande målet med Ribosomen profilering tekniken är att studera och kvantifiera översättningen av specifika mRNA under olika cellulära förhållanden. Denna teknik använder nästa generations sekvensering att kvantitativt analysera Ribosomen beläggning i hela genomet och tillåter övervakning av proteinsyntes i vivo på enda kodon resolution 3,4. För närvarande, denna metod ger de mest avancerade metoder för att mäta nivåerna av protein översättning, och har visat sig vara en användbar upptäckt verktyg som ger information som inte kan avslöjas genom andra tillgängliga tekniker, e.g. microarrays eller Översättning staten array analys (TSAA) 5. Som Ribosomen profilering rapporter på de sammanslagna förändringarna i avskrift nivåer och translationell utgång, ger det också mycket större känslighet jämfört med andra metoder.
Denna strategi är baserad på djupsekvensering av Ribosomen-skyddade mRNA fragment 3. Under protein översättning, ribosomer skydda ~ 28 nt delar av mRNA (kallas fotspår) 6. Genom att bestämma sekvensen av Ribosomen-skyddade fragment, kan Ribo-Seq kartlägga placeringen av ribosomer på översatta mRNA och identifiera vilka områden i mRNA sannolikt översättas aktivt till protein 3,7. Dessutom kan vi kvantitativt mäta översättningen av mRNA genom att räkna antalet fotspår som anpassas till en viss mRNA-avskrift.
För att isolera de ribosom-skyddade fragment, behandlas cell lysates initialt med en översättning-hämmare till stall ribosomerna följt av ribonunkleas matsmältningen. Medan gratis mRNA och delar av översatta mRNA inte skyddas av ribosomer är förstörd av ribonunkleas, kan ribosom-skyddade mRNA fragment återvinnas genom att rena intakt Ribosomen-fotavtryck komplex. Dessa mRNA fotspår är sedan omvandlas till cDNA bibliotek och analyseras genom djupsekvensering (figur 1). Parallellt till Ribosomen profilering, intakt mRNA extraheras från samma prov och sekvenserade. Genom att jämföra nivån på översättning identifieras av Ribo-Seq med mRNA överflöd mätningar, kan vi identifiera gener som är specifikt upp - eller ner-reglerade i nivå med översättning och beräkna effektivitet i mRNA på genome-wide nivå. Protokollet beskrivs i denna artikel är specifika för jäst, bör det också vara användbar för forskare som försöker upprätta protokollet Ribo-Seq i andra system.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.45 &#956;M membrane filters</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>HVLP04700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 mL centrifugal filters (100 kDa MWCO)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC510024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M Tris-HCl, pH 7.0</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9850G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M Tris-HCl, pH 7.5 (pH 8.0 at 4&#176;C)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15567-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X TBE buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9863</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% TBE-urea gel</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>EC6875BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15% TBE-urea gel</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>EC6885BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 M MgCl2</td>
			<td>RPI</td>
			<td>M24500-10.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2X TBE-urea sample buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LC6876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3M NaOAc, pH 5.5</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5&#39; Deadenylase (10 U/&#956;L)</td>
			<td>Epicentre</td>
			<td>DA11101K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5X Nucleic acid sample loading buffer</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8% TBE gel</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>EC6215BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9722</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue light transilluminator</td>
			<td>Clare Chemical Research</td>
			<td>DR-46B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chrome-steel beads, 3.2 mm</td>
			<td>BioSpec Products</td>
			<td>11079132c</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogrinder</td>
			<td>Biospec product</td>
			<td>3110BX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cycloheximide</td>
			<td>RPI</td>
			<td>C81040-5.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data Acquisition System</td>
			<td>DATAQ Instruments</td>
			<td>DI-245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxynucleotide (dNTP) solution mix (10 mM)</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N0447L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gradient fractionation system</td>
			<td>Brandel</td>
			<td>BR-184X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-fidelity DNA polymerase (2,000 U/mL)</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0530S</td>
			<td>Supplied with 5X Phusion HF Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Next-generation sequencing library quantification kit</td>
			<td>Kapa Biosystems</td>
			<td>KK4824</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleic acid gel stain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S11494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima XE-90 ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A94471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(A) mRNA isolation kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>61011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rec J exonuclease (10 U/&#956;L)</td>
			<td>Epicentre</td>
			<td>RJ411250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse transcriptase (200 U/&#956;L)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18080093</td>
			<td>Supplied with 5X first-strand buffer and 0.1 M DTT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA fragmentation buffer</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E6186A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase I (100 U/&#956;L)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM2295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase inhibitor (20 U/&#956;L)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM2696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone rubber caps</td>
			<td>BioSpec Products</td>
			<td>2008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ssDNA ligase (100 U/&#956;L)</td>
			<td>Epicentre</td>
			<td>CL9021K</td>
			<td>Supplied with 10X CircLigase II buffer and 50 mM MnCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel microvials, 1.8 mL</td>
			<td>BioSpec Products</td>
			<td>2007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>RPI</td>
			<td>S24060-5000.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW-41 Ti rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>331362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>New Era Pump Systems</td>
			<td>NE-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 polynucleotide kinase (10,000 U/mL)</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0201S</td>
			<td>Supplied with 10X T4 polynucleotide kinase buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 RNA ligase 2 truncated KQ (200,000 U/mL)</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0373S</td>
			<td>Supplied with 10X T4 RNA ligase buffer and 50% PEG8000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal cycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1851148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thinwall polyallomer tubes, 13.2 mL</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>331372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>X100-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV monitor</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7318160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saccharomyces cerevisiae strain BY4741</td>
			<td>Open Biosystems</td>
			<td>YSC1048</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genome-wide quantification of translation in budding yeast by ribosome profiling

Översättning av mRNA till proteiner är en komplex process som involverar flera lager av förordning. Det antas ofta att förändringar i mRNA transkription återspegla förändringar i proteinsyntesen, men många undantag har observerats. Nyligen, en teknik som kallas ribosomer profilering (eller Ribo-Seq) har vuxit fram som en kraftfull metod som möjliggör identifiering, med hög noggrannhet, vilka regioner av mRNA översätts till proteiner och kvantifiering av översättning på genome-wide nivå. Här presenterar vi en generaliserad protokoll för genome-wide kvantifiering av översättning med Ribo-Seq i spirande jäst. Dessutom tillåter kombinera Ribo-Seq data med mRNA överflöd mätningar oss att samtidigt kvantifiera översättning effektivitet av tusentals mRNA avskrifter i samma prov och jämföra förändringar av dessa parametrar som svar på experimentella manipulationer eller i olika fysiologiska tillstånd. Vi beskriver ett detaljerat protokoll för generering av Ribosomen fotspår med nuclease-nedbrytning, isolering av intakt Ribosomen-fotavtryck komplex via sackaros gradient fraktionering och beredning av DNA bibliotek för djupsekvensering tillsammans med lämpliga kvalitetskontroller som är nödvändiga för att säkerställa korrekt analys av in-vivo översättning.

Detaljerade rörledningar för bioinformatiska analyser av Ribosomen profilering data har tidigare beskrivits 8,9. Dessutom har flera forskargrupper utvecklat bioinformatiska verktyg för differentiell gen uttryck analys och bearbetning av sekvensering data som är specifika för Ribosomen profilering metod 10,11,12 ,<sup clas...

Watch this Scientific Journal Video about Genome-wide Quantification of Translation in Budding Yeast by Ribosome Profiling at JoVE.com

Genome-wide Quantification of Translation in Budding Yeast by Ribosome Profiling

Translationell förordning spelar en viktig roll i kontrollen av protein överflöd. Här beskriver vi en hög genomströmning metod för kvantitativ analys av översättning i spirande jästen Saccharomyces cerevisiae.

Genome-wide kvantifiering av översättning i spirande jäst av Ribosomen profilering

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Lösa affinitetsrenat proteinkomplex av Blue Native PAGE och protein Korrelation profilering

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Deep Proteome Profiling by Isobaric Labeling, Extensive Liquid Chromatography, Mass Spectrometry, and Software-assisted Quantification

Djupa proteomet profilering av isobariska märkning, omfattande vätskekromatografi, masspektrometri och programvara-assisted kvantifiering

Many exceptional advances have been made in mass spectrometry (MS)-based proteomics, with particular technical progress in liquid chromatography (LC) ...

Quantification of Hypopigmentation Activity In Vitro

Kvantifiering av hypopigmentering aktivitet In Vitro

This study presents laboratory methods for the quantification of hypopigmentation activity in vitro. Melanin, the major pigment in melanocytes, is ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

Nitropeptid profilering och identifiering illustrerad av angiotensin II

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Översätta ribosom affinitetsrening (fälla) för RNA-isolering från endotelceller in vivo

Many studies have been limited to using in vitro cellular assays and whole tissues or isolating of specific cell types from animals for in vitro analysis ...

DNA Sequence Recognition by DNA Primase Using High-Throughput Primase Profiling

DNA-sekvens erkännande av DNA-Primase med hög genomströmning Primase profilering

DNA primase synthesizes short RNA primers that initiate DNA synthesis of Okazaki fragments on the lagging strand by DNA polymerase during DNA replication. ...

Dual DNA Rulers to Study the Mechanism of Ribosome Translocation with Single-Nucleotide Resolution

Dubbla DNA-linjaler för att studera mekanismen för ribosom Translocation med Ennukleotid upplösning

The ribosome translocation refers to the ribosomal movement on the mRNA by exactly three nucleotides (nt), which is the central step in protein synthesis. ...

High-Resolution Complexome Profiling by Cryoslicing BN-MS Analysis

Högupplöst Complexome-profilering genom att Cryoslicing BN-MS Analysis

Proteins generally exert biological functions through interactions with other proteins, either in dynamic protein assemblies or as a part of stably formed ...