Name: genome-wide quantification of translation in budding yeast by ribosome profiling
Uploaded: 2017-12-21T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Genome-wide Quantification of Translation in Budding Yeast by Ribosome Profiling at JoVE.com

Bu eser sağlık hibe AG040191 ve AG054566 için VML Ulusal Enstitüleri tarafından desteklenmiştir. VML yaşlanma araştırma Amerikan Federasyonu AFAR araştırma bursu alıcıdan iken bu araştırma yapılmıştır.

1. hazırlık ayıklamak
<ol>
	<li>YPD plakaları (% 1 Maya ekstresi, % 2 pepton, % 2 glikoz ve %2 agar) çizgi Maya suşları tek kolonileri için dondurulmuş hisse senedi üzerinden. Tabak 30 ° C'de 2 gün kuluçkaya.</li>
	<li>YPD orta (% 1 Maya ekstresi, % 2 pepton, % 2 glikoz) 50 mL konik santrifüj tüpü 15 mL içine Maya YPD plaka (kullanım bir koloni) aşılamak ve gecede 30 ° C'de (200-250 devir/dakika) sallayarak ile büyümek</li>
	<li>Kültür YPD ortamda bir 2 L steril şişe 500 mL içine oranında s...

<ol>
	<li>Holcik, M., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+control+in+stress+and+apoptosis.">Translational control in stress and apoptosis.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).</li><li>Tanenbaum, M. E., Stern-Ginossar, N., Weissman, J. S., Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+mRNA+translation+during+mitosis.">Regulation of mRNA translation during mitosis.</a> Elife. 4, (2015).</li><li>Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+in+vivo+of+translation+with+nucleotide+resolution+using+ribosome+profiling.">Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling.</a> Science. 324 (5924), 218-223 (2009).</li><li>Ingolia, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+translational+profiling+by+ribosome+footprinting.">Genome-wide translational profiling by ribosome footprinting.</a> Methods Enzymol. 470, 119-142 (2010).</li><li>Brar, G. A., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+profiling+reveals+the+what,+when,+where+and+how+of+protein+synthesis.">Ribosome profiling reveals the what, when, where and how of protein synthesis.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (11), 651-664 (2015).</li><li>Wolin, S. L., Walter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+pausing+and+stacking+during+translation+of+a+eukaryotic+mRNA.">Ribosome pausing and stacking during translation of a eukaryotic mRNA.</a> EMBO J. 7 (11), 3559-3569 (1988).</li><li>Guo, H., Ingolia, N. T., Weissman, J. S., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+microRNAs+predominantly+act+to+decrease+target+mRNA+levels.">Mammalian microRNAs predominantly act to decrease target mRNA levels.</a> Nature. 466 (7308), 835-840 (2010).</li><li>Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ribosome+profiling+strategy+for+monitoring+translation+in+vivo+by+deep+sequencing+of+ribosome-protected+mRNA+fragments.">The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments.</a> Nat Protoc. 7 (8), 1534-1550 (2012).</li><li>Bartholomaus, A., Del Campo, C., Ignatova, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+non-standardized+biases+of+ribosome+profiling.">Mapping the non-standardized biases of ribosome profiling.</a> Biol Chem. 397 (1), 23-35 (2016).</li><li>Larsson, O., Sonenberg, N., Nadon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=anota:+Analysis+of+differential+translation+in+genome-wide+studies.">anota: Analysis of differential translation in genome-wide studies.</a> Bioinformatics. 27 (10), 1440-1441 (2011).</li><li>Zhong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RiboDiff:+detecting+changes+of+mRNA+translation+efficiency+from+ribosome+footprints.">RiboDiff: detecting changes of mRNA translation efficiency from ribosome footprints.</a> Bioinformatics. 33 (1), 139-141 (2017).</li><li>Xiao, Z., Zou, Q., Liu, Y., Yang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+assessment+of+differential+translations+with+ribosome+profiling+data.">Genome-wide assessment of differential translations with ribosome profiling data.</a> Nat Commun. 7, 11194 (2016).</li><li>Chung, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+duplex-specific+nuclease+in+ribosome+profiling+and+a+user-friendly+software+package+for+Ribo-seq+data+analysis.">The use of duplex-specific nuclease in ribosome profiling and a user-friendly software package for Ribo-seq data analysis.</a> RNA. 21 (10), 1731-1745 (2015).</li><li>Popa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RiboProfiling:+a+Bioconductor+package+for+standard+Ribo-seq+pipeline+processing.">RiboProfiling: a Bioconductor package for standard Ribo-seq pipeline processing.</a> F1000Res. 5, 1309 (2016).</li><li>Dunn, J. G., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plastid:+nucleotide-resolution+analysis+of+next-generation+sequencing+and+genomics+data.">Plastid: nucleotide-resolution analysis of next-generation sequencing and genomics data.</a> BMC Genomics. 17 (1), 958 (2016).</li><li>Baranov, P. V., Michel, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Illuminating+translation+with+ribosome+profiling+spectra.">Illuminating translation with ribosome profiling spectra.</a> Nat Methods. 13 (2), 123-124 (2016).</li><li>Calviello, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+actively+translated+open+reading+frames+in+ribosome+profiling+data.">Detecting actively translated open reading frames in ribosome profiling data.</a> Nat Methods. 13 (2), 165-170 (2016).</li><li>Michel, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RiboGalaxy:+A+browser+based+platform+for+the+alignment,+analysis+and+visualization+of+ribosome+profiling+data.">RiboGalaxy: A browser based platform for the alignment, analysis and visualization of ribosome profiling data.</a> RNA Biol. 13 (3), 316-319 (2016).</li><li>Martin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutadapt+removes+adapter+sequences+from+high-throughput+sequencing+reads.">Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads.</a> EMBnet J. 17 (1), 10-12 (2011).</li><li>Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+and+memory-efficient+alignment+of+short+DNA+sequences+to+the+human+genome.">Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome.</a> Genome Biol. 10 (3), R25 (2009).</li><li>Anders, S., Pyl, P. T., Huber, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HTSeq--a+Python+framework+to+work+with+high-throughput+sequencing+data.">HTSeq--a Python framework to work with high-throughput sequencing data.</a> Bioinformatics. 31 (2), 166-169 (2015).</li><li>Love, M. I., Huber, W., Anders, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moderated+estimation+of+fold+change+and+dispersion+for+RNA-seq+data+with+DESeq2.">Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2.</a> Genome Biol. 15 (12), 550 (2014).</li><li>van den Elzen, A. M., Schuller, A., Green, R., Seraphin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dom34-Hbs1+mediated+dissociation+of+inactive+80S+ribosomes+promotes+restart+of+translation+after+stress.">Dom34-Hbs1 mediated dissociation of inactive 80S ribosomes promotes restart of translation after stress.</a> EMBO J. 33 (3), 265-276 (2014).</li><li>Guydosh, N. R., Green, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dom34+rescues+ribosomes+in+3'+untranslated+regions.">Dom34 rescues ribosomes in 3' untranslated regions.</a> Cell. 156 (5), 950-962 (2014).</li><li>Ingolia, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+profiling:+new+views+of+translation,+from+single+codons+to+genome+scale.">Ribosome profiling: new views of translation, from single codons to genome scale.</a> Nat Rev Genet. 15 (3), 205-213 (2014).</li><li>Gerashchenko, M. V., Lobanov, A. V., Gladyshev, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+ribosome+profiling+reveals+complex+translational+regulation+in+response+to+oxidative+stress.">Genome-wide ribosome profiling reveals complex translational regulation in response to oxidative stress.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (43), 17394-17399 (2012).</li><li>Weinberg, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+ribosome-footprint+and+mRNA+measurements+provide+insights+into+dynamics+and+regulation+of+yeast+translation.">Improved ribosome-footprint and mRNA measurements provide insights into dynamics and regulation of yeast translation.</a> Cell Rep. 14 (7), 1787-1799 (2016).</li><li>Park, J. E., Yi, H., Kim, Y., Chang, H., Kim, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+poly(A)+tail+and+translation+during+the+somatic+cell+cycle.">Regulation of poly(A) tail and translation during the somatic cell cycle.</a> Mol Cell. 62 (3), 462-471 (2016).</li><li>Howard, M. T., Carlson, B. A., Anderson, C. B., Hatfield, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+redefinition+of+UGA+codons+is+regulated+by+selenium+availability.">Translational redefinition of UGA codons is regulated by selenium availability.</a> J Biol Chem. 288 (27), 19401-19413 (2013).</li><li>Gerashchenko, M. V., Gladyshev, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribonuclease+selection+for+ribosome+profiling.">Ribonuclease selection for ribosome profiling.</a> Nucleic Acids Res. 45 (2), e6 (2017).</li><li>Gerashchenko, M. V., Gladyshev, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translation+inhibitors+cause+abnormalities+in+ribosome+profiling+experiments.">Translation inhibitors cause abnormalities in ribosome profiling experiments.</a> Nucleic Acids Res. 42 (17), e134 (2014).</li><li>O'Connor, P. B., Andreev, D. E., Baranov, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+survey+of+the+relative+impact+of+mRNA+features+on+local+ribosome+profiling+read+density.">Comparative survey of the relative impact of mRNA features on local ribosome profiling read density.</a> Nat Commun. 7, 12915 (2016).</li></ol>

Ribo Seq yaklaşım mRNA çeviri vivo içinde genom çapında düzey 3analizi için güçlü bir teknoloji olarak ortaya çıkmıştır. Çeviri ile tek-kodonu kararlılık izleme sağlar, bu yaklaşımı kullanarak çalışmalar translasyonel yönetmelik anlayışımızı katkıda bulunmuştur. Avantajları rağmen Ribo Seq bazı sınırlamaları vardır. Ribozomal RNA (rRNA) her zaman sırasında yalıtım Ribo Seq deneyler 9,25...

Hücredeki protein ifade yönetmelikte önemli bir rol oynayan temel işlemlerden biri mRNA çevrilmiştir. Bu nedenle, mRNA çeviri sıkı farklı iç ve dış fizyolojik uyaranlar 1,2yanıt olarak kontrol edilir. Ancak, translasyonel düzenleme mekanizmaları çöküşünde kalır. Burada, biz genom çapında miktar mayası çeviri için protokol ribozom profil oluşturma açıklanmaktadır. Ribozom profil çıkarma tekniği genel amacı çalışma ve çeşitli hücresel koşullarda belirli mRNA'ların çeviri ölçmek etmektir. Bu teknik ribozom doluluk genom boyunca kantitatif analiz için yeni nesil sıralama kullanır ve protein sentezi vivo içinde tek kodon çözünürlük 3,4oranı izleme sağlar. Şu anda, bu yöntem protein çeviri düzeyde ölçmenin en gelişmiş araçlar sağlar ve mevcut diğer tekniklerle, örneğin microarrays ortaya bilgi veren yararlı keşif aracı olduğu ispatlanmıştır veya Çeviri Durumu dizi analizi (TSAA) 5. Transkript düzeyleri ve çevirim çıkış birleştirilmiş değişiklikleri ile ilgili raporlar profil oluşturma ribozom da diğer yöntemlerine göre çok daha fazla hassasiyet sağlar.
Bu yaklaşım mRNA parçaları 3ribozom korumalı derin sıralama üzerinde temel alır. Ribozomlarda protein çeviri sırasında korumak ~ 28 nt bölümlerini (ayak izleri olarak adlandırılır) mRNA 6. Ribozom tarafından korunan parçaları dizisi belirleyerek, Ribo Seq ribozomlara çevrilmiş mRNA üzerinde konumunu harita ve mRNA hangi bölgelerinde aktif protein 3,7olarak tercüme edilebilir muhtemeldir tanımlamak. Buna ek olarak, biz kantitatif mRNA tercümesi verilen bir mRNA transkript hizalamak ayak izleri sayısını sayarak ölçebilirsiniz.
Ribozom tarafından korunan parçaları ayırmak için hücre lysates başlangıçta ribonükleaz sindirim tarafından takip ribozomlara oyalamak için bir çeviri önleyici ile tedavi edilir. Ücretsiz mRNA ve ribozomlar tarafından korunmamasına çevrilmiş mRNA'ların bölümlerini ribonükleaz tarafından bozulmuş ise, ribozom korumalı mRNA parçaları sağlam ribozom-ayak izi kompleksleri arındırıcı tarafından elde edilebilir. Bu mRNA ayak sonra cDNA kitaplığa dönüştürülür ve derin sıralama (şekil 1) tarafından analiz. Ribozom profil oluşturma için paralel olarak sağlam mRNA aynı örneğinden ayıklanmış ve sıralı. MRNA bereket ölçümleri ile Ribo-Seq tarafından tanımlanan çeviri düzeyini karşılaştırarak, biz özellikle up - veya aşağı-düzenlenmiş çeviri düzeyde olan genlerin tanımlamak ve mRNA genom geneli düzeyinde verimliliğini çeviri hesaplamak. Bu makalede açıklanan protokol için Maya belirli olmakla birlikte, aynı zamanda diğer sistemlerde Ribo Seq Protokolü kurmaya çalışacağız araştırmacılar için yararlı olmalıdır.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.45 &#956;M membrane filters</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>HVLP04700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 mL centrifugal filters (100 kDa MWCO)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC510024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M Tris-HCl, pH 7.0</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9850G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M Tris-HCl, pH 7.5 (pH 8.0 at 4&#176;C)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15567-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X TBE buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9863</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% TBE-urea gel</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>EC6875BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15% TBE-urea gel</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>EC6885BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 M MgCl2</td>
			<td>RPI</td>
			<td>M24500-10.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2X TBE-urea sample buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LC6876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3M NaOAc, pH 5.5</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5&#39; Deadenylase (10 U/&#956;L)</td>
			<td>Epicentre</td>
			<td>DA11101K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5X Nucleic acid sample loading buffer</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8% TBE gel</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>EC6215BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9722</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue light transilluminator</td>
			<td>Clare Chemical Research</td>
			<td>DR-46B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chrome-steel beads, 3.2 mm</td>
			<td>BioSpec Products</td>
			<td>11079132c</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogrinder</td>
			<td>Biospec product</td>
			<td>3110BX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cycloheximide</td>
			<td>RPI</td>
			<td>C81040-5.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data Acquisition System</td>
			<td>DATAQ Instruments</td>
			<td>DI-245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxynucleotide (dNTP) solution mix (10 mM)</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N0447L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gradient fractionation system</td>
			<td>Brandel</td>
			<td>BR-184X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-fidelity DNA polymerase (2,000 U/mL)</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0530S</td>
			<td>Supplied with 5X Phusion HF Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Next-generation sequencing library quantification kit</td>
			<td>Kapa Biosystems</td>
			<td>KK4824</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleic acid gel stain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S11494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima XE-90 ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A94471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(A) mRNA isolation kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>61011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rec J exonuclease (10 U/&#956;L)</td>
			<td>Epicentre</td>
			<td>RJ411250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse transcriptase (200 U/&#956;L)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18080093</td>
			<td>Supplied with 5X first-strand buffer and 0.1 M DTT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA fragmentation buffer</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E6186A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase I (100 U/&#956;L)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM2295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase inhibitor (20 U/&#956;L)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM2696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone rubber caps</td>
			<td>BioSpec Products</td>
			<td>2008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ssDNA ligase (100 U/&#956;L)</td>
			<td>Epicentre</td>
			<td>CL9021K</td>
			<td>Supplied with 10X CircLigase II buffer and 50 mM MnCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel microvials, 1.8 mL</td>
			<td>BioSpec Products</td>
			<td>2007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>RPI</td>
			<td>S24060-5000.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW-41 Ti rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>331362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>New Era Pump Systems</td>
			<td>NE-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 polynucleotide kinase (10,000 U/mL)</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0201S</td>
			<td>Supplied with 10X T4 polynucleotide kinase buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 RNA ligase 2 truncated KQ (200,000 U/mL)</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0373S</td>
			<td>Supplied with 10X T4 RNA ligase buffer and 50% PEG8000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal cycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1851148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thinwall polyallomer tubes, 13.2 mL</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>331372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>X100-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV monitor</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7318160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saccharomyces cerevisiae strain BY4741</td>
			<td>Open Biosystems</td>
			<td>YSC1048</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genome-wide quantification of translation in budding yeast by ribosome profiling

MRNA tercüme proteinler düzenleme birkaç kat içeren karmaşık bir işlemdir. Bu kez değişiklikleri protein sentezi mRNA transkripsiyon değişiklikleri yansıtmak, ama pek çok özel durumlar gözlenmiştir varsayılır. Son zamanlarda, ribozom profil oluşturma (Ribo Seq) adında bir teknik veya kimlik, mRNA hangi bölgelerinde protein ve miktar çeviri genom geneli düzeyinde çevriliyor yüksek doğrulukla sağlar güçlü bir yöntem olarak ortaya çıkmıştır. Burada, genom çapında miktar Ribo Seq mayası içinde kullanarak çeviri için Genelleştirilmiş bir iletişim kuralı mevcut. Buna ek olarak, mRNA bereket ölçümleri ile Ribo Seq veri birleştirerek aynı anda mRNA transkript aynı örnek içinde binlerce çeviri verimliliğini ölçmek ve bu parametreler deneysel cevaben değişiklikleri karşılaştırmak için bize izin verir işlemler veya farklı fizyolojik devletler. Biz üretimi ile birlikte uygun derin sıralama için nükleaz sindirim, bozulmamış ribozom-ayak izi kompleksleri Sükroz degrade ayırma ile yalıtım ve hazırlık DNA kütüphanelerinin kullanarak ribozom ayak izi için detaylı bir protokol tarif Kalite denetimleri doğru analiz vivo içinde çeviri sağlamak için gerekli.

Veri profil oluşturma ribozom bioinformatic çözümlenmesi için detaylı boru hatları-si olmak be daha önce açıklanan 8,9. Buna ek olarak, birçok araştırma grupları farklı gen ifade analizi ve ribozom yöntemi 10,11,12 profil oluşturma için özel sıralama veri işleme için Biyoinformatik araçlarını geliştirdik ,<...

Watch this Scientific Journal Video about Genome-wide Quantification of Translation in Budding Yeast by Ribosome Profiling at JoVE.com

Genome-wide Quantification of Translation in Budding Yeast by Ribosome Profiling

Translasyonel yönetmelik protein bereket kontrolünde önemli bir rol oynar. Burada, kantitatif analiz tomurcuklanma Maya Saccharomyces cerevisiaeçeviri için bir yüksek-den geçerek yöntemi açıklanmaktadır.

Genom çapında Quantification ribozom profil oluşturma tarafından mayası çeviri

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Mavi Yerli PAGE ve Protein İlişkisi Profil Yöntemi ile Affinity Saf protein Kompleksler çözümleniyor

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Deep Proteome Profiling by Isobaric Labeling, Extensive Liquid Chromatography, Mass Spectrometry, and Software-assisted Quantification

Derin Proteom izobarik etiketleme, kapsamlı sıvı Kromatografi, kütle spektrometresi ve yazılım destekli miktar tarafından profil oluşturma

Many exceptional advances have been made in mass spectrometry (MS)-based proteomics, with particular technical progress in liquid chromatography (LC) ...

Quantification of Hypopigmentation Activity In Vitro

Miktar hipopigmentasyon aktivitesinin in Vitro

This study presents laboratory methods for the quantification of hypopigmentation activity in vitro. Melanin, the major pigment in melanocytes, is ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

Anjiyotensin II tarafından gösterilen nitropeptid profil oluşturma ve tanımlama

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Endotel hücrelerinden RNA yalıtım için Ribosome affinity arıtma (TRAP) çevirisi In vivo

Many studies have been limited to using in vitro cellular assays and whole tissues or isolating of specific cell types from animals for in vitro analysis ...

DNA Sequence Recognition by DNA Primase Using High-Throughput Primase Profiling

Dna İlkase tarafından DNA Dizisi Tanıma Yüksek-Throughput Primase Profilleme kullanarak

DNA primase synthesizes short RNA primers that initiate DNA synthesis of Okazaki fragments on the lagging strand by DNA polymerase during DNA replication. ...

Dual DNA Rulers to Study the Mechanism of Ribosome Translocation with Single-Nucleotide Resolution

Çift DNA cetvelleri tek Nükledotid çözünürlüğe sahip Ribosome translocation mekanizmasını Incelemek için

The ribosome translocation refers to the ribosomal movement on the mRNA by exactly three nucleotides (nt), which is the central step in protein synthesis. ...

High-Resolution Complexome Profiling by Cryoslicing BN-MS Analysis

BN-MS Analizi Cryoslicing tarafından Yüksek Çözünürlüklü Complexome Profilleme

Proteins generally exert biological functions through interactions with other proteins, either in dynamic protein assemblies or as a part of stably formed ...